Denne opsonophagocytic drab analysen bruges til at sammenligne evne til fagocyterende immunceller til at reagere på og dræbe bakterier baseret på forskellige behandlinger og/eller betingelser. Klassisk, fungerer dette assay som den gyldne standard for vurdering af effektor funktion af antistoffer, der er rejst mod en bakterie som opsonin.
Et centralt aspekt af immunrespons på bakteriel kolonisering af værten er fagocytose. En opsonophagocytic drab assay (OPKA) er en eksperimentel procedure hvor fagocyterende celler er co kulturperler med bakteriel enheder. Immunceller vil phagocytosis og dræbe de bakterielle kulturer på en måde, komplement-afhængig. Effektiviteten af immun-medieret celle drab er afhængig af en række faktorer og kan bruges til at bestemme, hvordan forskellige bakterielle kulturer sammenligne med hensyn til modstand til celledød. På denne måde, kan effekten af potentielle immun-baserede therapeutics vurderes mod specifikke bakteriestammer og/eller serotyper. I denne protokol beskriver vi en forenklet OPKA, der udnytter grundlæggende dyrkningsbetingelserne og celle tælle Bestem bakteriel cellernes levedygtighed efter fælles kultur med behandling betingelser og HL-60 immunceller. Denne metode har udnyttet med held med en række forskellige pneumokok serotyper, kapsulær, og acapsular stammer og andre bakteriearter. Fordelene ved denne OPKA protokol er dets enkelhed, alsidighed (som denne analyse ikke er begrænset til antistof behandlinger som opsonins), og minimering af tid og reagenser til at vurdere grundlæggende eksperimentelle grupper.
Opsonophagocytic dræbe assay (OPKA) er et kritisk værktøj for forbinder ændringer i bakteriel struktur eller funktion til efterfølgende ændringer i immunrespons og funktion. Som sådan, er det ofte brugt som en supplerende analyse til at bestemme immun-baserede effekten af antistof behandlinger, vaccine kandidater og enzym optimering. Mens in vivo assays er nødvendigt at fastlægge effektive clearance eller beskyttelse i en bakteriel infektion model, OPKA kan bruges til at vurdere immun bidrag til bakteriel celledød på det mest grundlæggende komponenter: bakterier, immunceller, og eksperimenterende behandlinger. Tidligere undersøgelser har vist, at OPKAs kan ændres og anvendes til en bred vifte af bakterier og serotyper, herunder Streptococcus pneumoniae1, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3. Desuden, disse optimeret assays kan bruges til at vurdere forskellige eksperimentelle behandlinger, herunder et enzym evne til at gøre bakterien mere tilgængelige for komplement-medieret immun celler4 og antistof behandlinger til at forbedre opsonization5. Klassisk, OPKA assay held har været anvendt i grundforskning og klinisk forskning indstillinger som en stærk indikator for beskyttelse induceret af patogen-specifikke antistoffer6,7,8,9 .
Forskellige typer af immunceller kan anvendes til vurdering af opsonophagocytic drab. Et almindeligt anvendte fagocyterende befolkning er HL-60 menneskelige leukemic cellelinie. Denne cellelinje kan holdes som inaktiverede promyelocytes i kultur; de kan dog opdeles i forskellige aktiveret stater via forskellige stof behandlinger10,11. Behandling af HL60 med N, N-dimethylformamid adskiller linjen celle i aktiverede neutrofiler med stærk Fagocytisk aktivitet11. Mens HL-60 celler er blevet optimeret og anvendes ofte til disse fagocytose assays10, kan andre primære polymorfnukleære leukocytter bruges som eksperiment12immun arm.
Derudover disse assays kan være forenklet13 eller multipleksede14 at se på flere antibiotika-resistente stammer af bakterier til at blive testet. Metoden multipleksede er gjort mere realistisk gennem udvikling af software, der effektivt kan tælle bakteriel kolonidannende enheder (CFUs) pr. spot på en agar plade15. Her, beskriver vi en strømlinet metode ved hjælp af en bakteriel stamme, HL-60 celler, baby kanin supplement og blod agar plader. Med denne metode kan flere behandlinger vurderes hurtigt for at løse specifikke forskningsspørgsmål om hvordan den medfødte immun reaktion på bakteriel infektion kan moduleres.
OPKAs tjener væsentlige roller i vurderingen af antistof medieret immunrespons induceret af vaccinationer6,8. Den centrale betydning af denne forenklede OPKA er tilpasningsevne i betingelserne, der skal testes (dvs. antistoffer, enzym behandlinger, osv.). I denne forstand, mens dette assay kan bruges til at teste bidrag af opsonins (dvs. antistoffer) i fagocytose, kan det også bruges til at vurdere måder at overvinde virulens faktorer (dvs. kapsulær polysakka…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) for hans uvurderlige hjælp i etablering af OPKA assays i vores laboratorium. Dette arbejde blev støttet af nationale institutter af sundhed Grant 1R01AI123383-01A1 til FYA.
Annexin V (APC conjugated) | BioLegend | 640919 | |
anti-CD35, human (PE conjugated) | BioLegend | 333405 | |
anti-CD71, human (PE conjugated) | BioLegend | 334105 | |
bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2) | Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) | ||
blood agar plates | Hardy Diagnostic | A10 | |
Fetal Clone serum | HyClone | SH30080.03 | |
glycerol | Sigma | G9012-1L | |
HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
IgG Isotype Control (PE conjugated) | BioLegend | 400907 | |
N,N-dimethylformamide (DMF) | Fisher Chemical | UN2265 | |
propidium iodide | Sigma | P4864 | |
RPMI media with L-glutamine | Corning | 10-040-CV |