Summary
Este ensaio de matança de opsonophagocytic é usado para comparar a capacidade de células fagocíticas de imunes a responder e matar as bactérias com base em diferentes tratamentos e/ou condições. Classicamente, este ensaio serve como o padrão ouro para avaliar funções efetoras dos anticorpos produzidos contra uma bactéria como opsoninas.
Abstract
Um aspecto fundamental da resposta imune a colonização bacteriana do host é fagocitose. Um ensaio de matança de opsonophagocytic (OPKA) é um procedimento experimental em que células fagocíticas são co cultivadas com unidades bacterianas. As células do sistema imunológico irão fagocitar e matar as culturas bacterianas de forma dependente de complemento. A eficiência da matança imune mediada por células é dependente de uma série de fatores e pode ser usada para determinar bacteriano como diferente culturas comparam no que diz respeito a resistência à morte celular. Desta forma, a eficácia da terapêutica potencial imunológico-baseado pode ser avaliada contra estirpes de bactérias específicas e/ou serótipos. Neste protocolo, descrevemos um OPKA simplificado que utiliza condições de cultura de base e célula contando determinar a viabilidade celular bacteriana após co-cultura com condições de tratamento e HL-60 células do sistema imunológico. Este método tem sido utilizado com sucesso com um número de diferentes sorotipos de pneumococo, capsulares e estirpes de acapsular e outras espécies bacterianas. As vantagens deste protocolo OPKA são sua simplicidade, versatilidade (como este ensaio não é limitado aos tratamentos de anticorpo como opsoninas) e a minimização do tempo e reagentes para avaliar grupos experimentais básicos.
Introduction
O opsonophagocytic matar o ensaio (OPKA) é uma ferramenta fundamental para vinculação de alterações na estrutura bacteriana ou função alterações posteriores na resposta imune e na função. Como tal, é frequentemente usado como um ensaio complementar para determinar baseados em imune a eficácia de tratamentos anticorpo candidatos vacinais, otimização de enzimas, etc. Enquanto os ensaios in vivo são necessários para determinar o espaço livre efetivo ou proteção em um modelo de infecção bacteriana, o OPKA pode ser usado para avaliar a contribuição imune à morte da célula bacteriana componentes mais básicos: bactérias, células do sistema imunológico e experimental tratamentos. Estudos anteriores mostraram que os OPKAs podem ser modificados e utilizados para uma variedade de bactérias e sorotipos, incluindo Streptococcus pneumoniae1, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3. Além disso, estes ensaios otimizados podem ser usados para avaliar diferentes tratamentos experimentais, incluindo a capacidade de uma enzima para tornar a bactéria mais acessíveis aos tratamentos4 e anticorpo de células do sistema imune mediada por complemento para melhorar opsonização5. Classicamente, ensaio OPKA tem sido utilizado com sucesso na investigação básica e clínica configurações como um indicador poderoso para proteção induzida por anticorpos específicos do patógeno6,7,8,9 .
Diferentes tipos de células do sistema imunológico podem ser utilizados para avaliação de matar opsonophagocytic. Uma população fagocítica comumente usada é a linha de células leucêmicas humanas HL-60. Esta linha de celular pode ser mantida como promielócitos inactivados em cultura; no entanto, eles podem ser diferenciados em vários Estados ativados via drogas diferentes tratamentos10,11. Tratamento de HL60 com N, N-dimetilformamida diferencia a linha celular em neutrófilos ativados com forte atividade fagocítica11. Enquanto as células HL-60 foram otimizadas e são frequentemente utilizadas para estes ensaios de fagocitose10, outros leucócitos polimorfonucleares primários podem ser usados como o braço imune do experimento12.
Além disso, estes ensaios podem ser simplificados13 ou multiplexagem14 olhar para várias estirpes resistentes aos antibióticos das bactérias a ser testado. O método multiplexado tornou-se mais viável através do desenvolvimento de software que pode eficientemente contar bactérias formadoras de unidades (CFUs) por ponto sobre uma placa de ágar15. Aqui, descrevemos um método simplificado usando uma estirpe bacteriana, células HL-60, complemento de coelho bebê e placas de ágar sangue. Com este método, vários tratamentos podem ser avaliados rapidamente, para abordar questões específicas de investigação sobre como a resposta imune inata a infecção bacteriana pode ser modulada.
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Protocol
1. cultura, diferenciação e validação de células HL-60
- Prepare meios de cultura celular HL-60, composto de 500 mL RPMI com L-glutamina e 50ml inactivadas pelo calor fetal soro bovino. Não adicione antibióticos como isso pode afetar a diferenciação das células HL-60.
- Para propagação/manutenção de células HL-60,6 células de cultura 5 x 10 em 10 mL de meios de cultura de células HL-60 em 75 cm2 exalados frascos em 37 ° C e 5% de CO2. Passagem células todos os dias 3−4 para manter as concentrações de célula ideal.
Nota: A concentração de célula não deve exceder 5 x 106/mL. - Gere ações de trabalho de células HL-60 por alíquotas aproximadamente 1 x 106 células/mL em meios de cultura HL60 com 10% de Dimetilsulfóxido (DMSO) para tubos criogênicos de 1 mL.
Nota: Estoques de trabalho podem ser armazenados a-80 ° C. O estoque de mestre deve ser armazenado a-120 ° C. - Diferencie células HL-60 pelo cultivo de 1,5 x 107 células em 15 mL de meios de cultura de células HL-60 com 0,6% N, N-dimetilformamida (DMF) a 37 ° C e 5% CO2 em frascos de2 estéril 75cm filtro tampado por 3 dias antes da OPKA.
- Validar que as células HL-60 tem sido diferenciadas com êxito e são apropriadas para uso no ensaio de OPKA através do teste de viabilidade e marcadores de superfície celular de acordo com o estabelecido fluxo cytometry protocolos16,17, 18,19. Após a diferenciação, colher células HL-60 e mancha de aproximadamente 1 x 104 células com anticorpos conjugados a fluorescente/manchas para CD71, CD35, anexina V e iodeto de propidium.
Nota: Células diferenciadas devem ser ≥55 viável, ≥65% % CD35+e ≤20% CD71+ , conforme determinado pela estabeleceu protocolos de validação14 (Figura 1).
2. preparação de reagentes e Buffers OPKA
- Prepare 50 mL de tampão estéril opsonização B (OBB) misturando 42,5 mL de estéril 1x tampão fosfato salino (PBS) com Ca2 +/ mg2 +, 5 mL de soro bovino fetal inactivadas pelo calor e 2,5 mL de 0.1% gelatina estéril. Loja a 4 ° C.
- Obter coelho bebê complemento e armazenar a-80 ° C.
- Obter ou preparar pratos de cultura bacteriana (ou seja, placas de ágar sangue de 15 x 100 mm2 5% ovelha).
3. preparação de amostras bacterianas de estoque
- Obter um estoque de uma estirpe bacteriana a ser testado.
Nota: Para este protocolo, sorotipo 3 Streptococcus pneumoniae (WU2, generosamente fornecidos pelo Dr. Moon Nahm) é usado. - Crescer a estirpe bacteriana em um caldo apropriado (ou seja, caldo Todd-Hewitt + extrato de levedura 0,5% para esta estirpe WU2) para aproximadamente 2−4 h a 37 ° C.
Nota: A densidade óptica em 600 nm (OD600) da cultura deve estar entre 0,6 e 0,8. - As bactérias de pelotas por centrifugação a 6.000 x g por 2 min e ressuspender as células em 10−30 mL de glicerol de 15% do caldo apropriado. Alíquota a cultura bacteriana (500 µ l por alíquota) em tubos de centrífuga estéril 1,5 mL e loja a-80 ° C.
- Descongele um frasco de estoque bacteriana em banho maria a 37 ° C. As células bacterianas de pelotas e Resuspenda em 500 µ l de OBB sob condições estéreis.
- Prepare diluições diferentes das ações bacterianas no OBB (i.e., 10 µ l da diluição não, 10 µ l de 01:10, 10 µ l de 1: 100, etc.). Realize o ensaio OPKA (seções 4-6, incluindo co-cultura HL-60/complemento) conforme descrito abaixo, utilizando várias diluições do estoque bacteriana não tratada. Cultura as placas durante a noite a 30 ° C (não CO2).
Nota: A temperatura de 30 ° C é específica para WU2 prevenir o crescimento excessivo; outros cepas/serótipos podem crescer otimamente a 37 ° C. - Conte as colônias para cada diluição do estoque de bacteriana não tratada co cultivada com complemento e células HL-60. Determine qual diluição de bactérias produz o número ideal de colônias contáveis (aproximadamente 80−120 CFUs por bactérias não tratadas co cultivadas com células HL-60). Observe esta diluição para OPKAs futuras envolvendo este estoque bacteriana.
4. cultura e tratamento bacteriano
- Descongele um tubo de estoque bacteriana preparado no passo 3.3. Bactérias (6.000 x g por 2 min) de pelotas e resuspenda o pellet celular em OBB a diluição ideal conforme determinado na etapa 3.6.
- Pipete 10 µ l da diluição bacteriana ressuspensa por alvéolo em uma placa de cultura de células 96 poços de fundo redondo.
- Adicione 20 µ l de tratamento adequado de anticorpos ou drogas a cada poço experimental em duplicado.
Nota: Neste protocolo, um anticorpo sorotipo específico gerado em camundongos é adicionado como tratamento X e uma enzima de glicosídeo hidrolase conhecida para degradar a cápsula de polissacarídeo 3 sorotipo é adicionada como tratamento de4,Y (Figura 2)20. Para poços de controle, use 1X PBS ou OBB, dependendo o buffer usado para poços de tratamento. - Agite a placa de amostra em cerca de 90 rpm por 1h à temperatura ambiente. Ajuste a estas condições, dependendo da temperatura ideal ou agitação condições dos tratamentos sendo testados.
5. HL-60 cultura bacteriana de co
- Prepare células HL-60 por colheita de células HL-60 diferenciados que são tratadas com DMF três dias antes (consulte a etapa 1.4) para tubos cônico de 15 mL. As células (500 x g, 3 min) de Pelotas, desprezar o sobrenadante e lavar pelo menos 10 mL de 1X PBS.
- As células lavadas (500 x g, 3 min) de Pelotas, desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em OBB (começa com 1 mL OBB e ajustar para uma concentração final de 1 x 107/mL após a contagem de células).
- Adicione complemento de coelho bebê (soro de coelho bebê estéril, não diluído, semanas de idade 3−4) em um volume final de 1:5.
Nota: A concentração final da mistura HL-60-complemento deve ser 1 x 107/mL. Se o teste de complemento de dependência, uma segunda solução contendo células HL-60 ativas com complemento inactivadas pelo calor pode ser utilizada (complemento pode ser inactivado por incubar em banho-maria em > 55 ° C, durante pelo menos 30 min). - Após cultura bacteriana de 1h é completo (passo 4.4), divida cada amostra (ou seja, 10 µ l de cada 30 µ l da amostra em dois novos poços) em poços de duplicados para os dois grupos (ou seja, uso somente 20 µ l de cultura co original de 30 µ l a conta para pipetagem erro) : um conjunto será co cultivado com HL-60-complemento e um incluirá apenas bactérias. Adicionar 50 µ l da mistura HL-60-complemento (da etapa 5.3) para cada conjunto experimental de poços (delegada + HL-60); Adicione 50 µ l de OBB sozinho aos poços de bactérias única (delegada -HL-60).
Nota: Para este exemplo, aproximadamente 800 CFUs bacterianas são usados para a inicial co-cultura com células de HL-60 5 x 10550 µ l. Se essa multiplicidade de infecção é muito alta ou muito baixa, como indicado pelos números do final da colônia, ajuste a diluição inicial bacteriana em oposição a contagem de células HL-60. - Agite a placa de 96 poços a 37 ° C por 1 h (não CO2).
6. amostra chapeamento e incubação durante a noite
- Dilua cada poço 1:5 com OBB, para que cada amostra possui um volume de pelo menos 50 µ l.
- Pipete 50 µ l de cada amostra diretamente sobre uma área designada de uma placa de cultura bacteriana, garantindo o espaçamento adequado entre as amostras. Para 15 x 100 mm2 rodada placas de ágar, amostras de pipeta aproximadamente 4 em um prato.
- Cobrir e deixar amostras secar por aproximadamente 15 min à temperatura ambiente.
- Inverta as placas e cultura durante a noite a 30 ° C (não CO2). Alternativamente, placas em frascos anaeróbios para testar se anóxica condições afetam o crescimento bacteriano ou de controle para a morfologia da cultura.
- Depois da cultura durante a noite, conte as colônias em cada área de amostra designado. Analisar dados, comparando o número de células vivas em cada conjunto para o controle correspondente e/ou amostras que não recebem co-cultura de células HL-60 (indicativo de sobrevivência da pilha de 100%, 0% célula matar).
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Representative Results
Validação de HL-60 diferenciação deve ser executada antes de iniciar o OPKA. Isso pode ser feito usando citometria de fluxo para determinar a expressão extracelular de CD11b, CD35, CD71 e anexina V (Figura 1). Iodeto de propidium também pode ser usado como um marcador da viabilidade. Após o tratamento com DMF durante 3 dias, a expressão de CD35 deve ser aumentada (≥55% de todas as células) e expressão de CD71 deve ser diminuída (≤20% de todas as células). Deve ser a porcentagem de células de iodeto (PI +) propidium juntas e anexina V + < 35% para garantir suficiente viabilidade celular. Se estas percentagens não atende aos requisitos mínimos, as condições de cultura devem ser ajustadas conforme descrito na discussão.
O número de CFUs obtidos de passo 6.5 pode ser usado para comparar a sobrevivência da célula bacteriana de diferentes grupos em comparação ao grupo controle sem tratamento (100% sobrevivência da pilha), como mostrado na Figura 2. Por exemplo, a contagem média Obtida de poços que não receberam nenhum tratamento, mas foram co cultivadas com HL-60 deve ser relativamente estreita no número de células que receberam nenhum tratamento e sem cultura co de HL-60, o que seria indicativo de sobrevivência da pilha de 100% ou 0 morte celular de %. Com um tratamento eficaz, os números de colônias devem ser mais diferentes entre co-cultura HL-60 e não células HL-60 (Figura 2 e Figura 3). Maiores diferenças entre HL-60 e não moda HL-60 são indicativas de fagocitose mais eficiente. No entanto, o tratamento pode realmente melhorar o crescimento de células bacterianas no conjunto que não é culto co com células HL-60. Deve notar-se essa diferença nas amostras tratadas e não tratadas. Se a diluição bacteriana não é otimizado (passo 3.6) ou o crescimento da colônia não é cuidadosamente observado após chapeamento (passo 6.5 ou ver discussão), crescimento excessivo das colônias pode impedir a contagem exata das colônias (Figura 4).
Figura 1 : Validação de diferenciação de células HL-60 através de citometria de fluxo. Células diferenciadas de HL-60 foram colhidas, lavadas e resuspended em 1 x 105 células/mL PBS. As células foram então aliquotadas para 12 poços (100 µ l/poço) em uma placa de 96 poços. As células foram então coradas com conjugado fluorescente anti-CD35, anti-CD71, anexina V e iodeto de propidium. Imaculado de células ou células coradas com anticorpos do isotipo conjugado fluorescente foram usadas como controles. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Matar células HL-60-mediada de bactérias melhora o tratamento Y. Amostras de S. pneumoniae foram tratadas com tratamento X (anticorpo) ou tratamento Y (enzima). OPKA foi realizada de acordo com o protocolo e CFUs bacterianas foram contados em duplicado. Amostras que não foram tratadas com células HL-60 foram utilizadas como controle (100% sobrevivência da pilha). São mostradas as percentagens médias de CFUs bacterianas nos grupos tratados HL-60 em comparação com os grupos correspondentes não HL-60-tratados. Barras representam o erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : CFUs bacterianas após OPKA e cultura durante a noite. Amostras bacterianas foram tratadas e co cultivadas sem (A) ou com células (B) HL-60 por 1 h a 37 ° C. Amostras foram diluídas de acordo com o protocolo e chapeadas em gelose de sangue durante a noite, as placas a 30 ° C (não CO2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Supercrescimento bacteriano CFU. Amostras bacterianas foram tratadas e OPKA foi realizada. Amostras foram diluídas e banhadas em sangue agar placas durante a noite a 37 ° C (não CO2). Uma avaliação exacta dos números de colônia não pode ser determinada como supercrescimento de colônias é mostrado. Como a 37 ° C (não CO2) levou ao overgrowth bacteriano, a temperatura de incubação para futuras placas foi reduzido para 30 ° C (não CO2) para manter a enumerabilidade das colônias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
OPKAs servir papéis essenciais na avaliação de respostas imunes de anticorpo mediada induzidas pela vacinação6,8. O principal significado deste OPKA simplificado é a capacidade de adaptação nas condições a serem testadas (ou seja, anticorpos, enzimas tratamentos, etc.). Neste sentido, este ensaio pode ser usado para testar a contribuição de opsoninas (ou seja, anticorpos) na fagocitose, mas pode também ser usado para avaliar maneiras de superar os fatores de virulência (ou seja, polissacarídeos capsulares) que normalmente inibem fagocíticas caminhos. Minimizando o número de etapas que são usadas normalmente em um OPKA multiplexado potencialmente minimiza as chances de erros técnicos que podem afetar os resultados experimentais e reduz a quantidade de solução de problemas e otimização para a obtenção de dados utilizáveis. Como este protocolo é adequado para variações de condições de tratamento, permite uma grande quantidade de versatilidade.
Pre-estabelecer o ensaio através de cultura de HL-60 e o estabelecimento de populações bacterianas é importante para prevenir passos de otimização estranhas ao executar o OPKA. Tempo deve ser dedicado para certificar-se de que todos os reagentes e tipos de células estão prontos e funcionais antes do experimento é executada. Estas etapas incluem a HL-60 linha celular em cultura (cerca de duas semanas), Validando que concentrações específicas de DMF eficazmente diferenciam as células HL-60 (cerca de uma semana) e estabelecendo ações bacterianas otimizada e livre de contaminantes de propagação diluições (cerca de duas semanas).
Algumas etapas do presente protocolo são críticas para a obtenção de colônias contáveis e dados adequados. Este protocolo utiliza células HL-60 como fagócitos devido à facilidade do uso de uma linhagem de células humanas que pode ser mantida em cultura e diferenciada com relativamente poucos passos. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) também podem ser utilizadas; no entanto, obter estas células e otimizando as condições para a sua utilização podem ser mais desafiador. As células HL-60 devem ser diferenciadas a fim de funcionar como fagócitos contra as bactérias. Para verificar se a diferenciação após o tratamento de 3 dias com DMF, citometria de fluxo deve ser usada para testar a expressão de CD11b e CD35 na maioria das células antes de realizar qualquer OPKA, conforme discutido na etapa 1.5. Viabilidade celular também deve ser verificada (de preferência com anexina V e coloração de iodeto de propidium). Se um grande número de células está morto, apoptose, ou indiferenciado, como observado com citometria de fluxo, a diferenciação de 3 dias com 0,6% DMF na mídia RPMI pode ser modificado (− 0 0,4%. 8% DMF, tempo de cultura 2−6 dia) até marcadores de viabilidade e diferenciação celular são melhorado. Esta diferenciação deve ser a primeira otimização do OPKA como função HL-60 é fundamental para matar bactérias. Recomendamos validar diferenciação HL-60 antes de cada experimento OPKA.
O número de CFUs bacterianas (passo 3.6) inicialmente dispensadas na placa de 96 poços (etapa 4.2) também é fundamental: muitas células de distribuição fará a contagem difícil e impreciso (passo 6.5) e pode diminuir a morte celular observada de co-cultura HL-60, Considerando que muito poucas células de distribuição pode aumentar a quantidade de desvio entre duplicatas e não pode mostrar qualquer contáveis colônias após co-cultura HL-60. Otimizando a diluição, portanto, é crítico e deve ser testado com o protocolo completo, incluindo co-cultura HL-60/complemento.
A importância do complemento também pode ser testada com este protocolo, incluindo dois conjuntos de amostras: uma com complemento de coelho bebê ativo e outra com complemento inactivadas pelo calor. Células HL-60 devem ser co cultivadas com ambos os conjuntos, embora um conjunto somente bactérias ainda deve ser incluído como uma base de sobrevivência celular 100%.
Para alguns sorotipos bacterianos, o da morfologia das colónias pode fazer contagem de células ou visibilidade problemático. Mucoides sorotipos como tipo 3, Streptococcus pneumoniae, por exemplo, pode facilmente overgrow e reduzir a contagem de UFC. Pode ser especialmente problemático quando testar tratamentos que afectam a cápsula, como supercrescimento poderia ser evitado no grupo tratado, mas maior número de colônias menores poderia ser contado. Para evitar essa discrepância, controle do crescimento celular é fundamental. Cultivo das colônias chapeadas a 30 ° C durante a noite provavelmente permitirá uma melhor monitorização do crescimento bacteriano e as placas podem ser removidas quando todas as colônias atingem tamanhos contabilísticos, distinguíveis. Além disso, placas de ágar diferentes podem ser utilizadas para melhorar a visibilidade das colônias individuais. Desta forma, este protocolo é vantajoso como pequenas mudanças para otimizar as condições, portanto, pode ser usadas para contabilizar um número de cepas bacterianas ou várias opções de tratamento.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos o Dr. Moon Nahm (Universidade de Alabama Birmingham) por sua inestimável ajuda no estabelecimento de ensaios OPKA em nosso laboratório. Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de saúde Grant 1R01AI123383-01A1 para FYA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V (APC conjugated) | BioLegend | 640919 | |
| anti-CD35, human (PE conjugated) | BioLegend | 333405 | |
| anti-CD71, human (PE conjugated) | BioLegend | 334105 | |
| bacterial strain to be used (i.e., Streptococcus pneumoniae, WU2) | Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) | ||
| blood agar plates | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Fetal Clone serum | HyClone | SH30080.03 | |
| glycerol | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| IgG Isotype Control (PE conjugated) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Fisher Chemical | UN2265 | |
| propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| RPMI media with L-glutamine | Corning | 10-040-CV |
References
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