Summary
تسمح تقنيات إزالة الأنسجة الجديدة المتوافقة مع التلطيخ المناعي مثل التصوير ثلاثي الأبعاد النهائي للأعضاء التي يتم تطهيرها بالمذيبات بالتصور ثلاثي الأبعاد للعدوى الدماغية بفيروس داء الكلب وبيئته الخلوية المعقدة. يتم جعل شرائح أنسجة الدماغ السميكة التي تحمل اسم الأجسام المضادة شفافة بصرياً لزيادة عمق التصوير وتمكين التحليل ثلاثي الأبعاد عن طريق الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر.
Abstract
التصور لعمليات العدوى في الأنسجة والأعضاء عن طريق وضع العلامات المناعية هو وسيلة رئيسية في علم الأحياء العدوى الحديثة. القدرة على مراقبة ودراسة توزيع، التروبيسم، ووفرة مسببات الأمراض داخل أنسجة الأعضاء يوفر بيانات محورية عن تطور المرض والتقدم. باستخدام أساليب الفحص المجهري التقليدية، يقتصر وضع العلامات المناعية في الغالب على المقاطع الرقيقة التي يتم الحصول عليها من عينات جزءا لا يتجزأ من البارافين أو المجمدة. ومع ذلك، فإن مستوى الصورة ثنائي الأبعاد المحدود لهذه الأقسام الرقيقة قد يؤدي إلى فقدان معلومات حاسمة عن البنية المعقدة للجهاز المصاب والسياق الخلوي للعدوى. توفر تقنيات إزالة الأنسجة الحديثة متعددة الألوان والمتوافقة مع تلطيخ المناعة الآن طريقة سريعة وغير مكلفة نسبياً لدراسة أكوام الصور ثلاثية الأبعاد ذات الحجم الكبير من أنسجة الأعضاء المصابة بالفيروس. من خلال تعريض الأنسجة للمذيبات العضوية، فإنه يصبح شفافا بصريا. وهذا يطابق مؤشرات الانكسار للعينة ويؤدي في نهاية المطاف إلى انخفاض كبير في تشتت الضوء. وهكذا، جنبا إلى جنب مع أهداف مسافة العمل الحرة لمسافات طويلة، يمكن تصوير أقسام الأنسجة الكبيرة تصل إلى 1 ملم في الحجم بواسطة الفحص المجهري الضوئي بالليزر البؤري التقليدي (CLSM) بدقة عالية. هنا، ونحن نصف بروتوكول لتطبيق التصوير الأنسجة العميقة بعد تطهير الأنسجة لتصور توزيع فيروس داء الكلب في العقول المصابة من أجل دراسة مواضيع مثل مسببات الأمراض الفيروس، وانتشار، التروبيسم، والغزو العصبي.
Introduction
تعتمد تقنيات علم الأنسجة التقليدية في الغالب على أجزاء رقيقة من أنسجة الأعضاء، والتي يمكن أن توفر بطبيعتها رؤى 2D فقط في بيئة 3D معقدة. على الرغم من أن من الممكن من حيث المبدأ، إعادة الإعمار 3D من أقسام رقيقة المسلسل يتطلب خطوط أنابيب التقنية الصعبة لكل من تشريح واللاحقة في محاذاة silico من الصور المكتسبة1. وعلاوة على ذلك، إعادة الإعمار السلس من z-volumes بعد تشريح microtome أمر بالغ الأهمية كما يمكن أن تبقى على حد سواء القطع الأثرية الميكانيكية والحسابية بسبب تسجيل صورة دون المستوى الأمثل الناجمة عن طائرات الصورة غير المتداخلة، والاختلافات تلطيخ، والمادية تدمير الأنسجة من قبل، على سبيل المثال، شفرة microtome. وعلى النقيض من ذلك، فإن التقطيع البصري النقي لعينات الأنسجة السميكة السليمة يسمح باقتناء طائرات صور متداخلة (الإفراط في أخذ العينات)، وبالتالي يسهل إعادة البناء ثلاثي الأبعاد. وهذا بدوره مفيد للغاية لتحليل عمليات العدوى في مجموعات الخلايا المعقدة (مثل الشبكات العصبية في سياق الخلايا الدبقية والمناعية المحيطة). ومع ذلك، تشمل العقبات الكامنة في أقسام الأنسجة السميكة التشتت الخفيف واختراق الأجسام المضادة محدودة في الأنسجة. في السنوات الأخيرة، تم تطوير مجموعة متنوعة منالتقنيات وتحسينها للتغلب على هذه القضايا 2،3،4،5،6،7،8 , 9 , 10 سنوات , 11 , 12 , 13.أساسا، يتم تحويل الأنسجة المستهدفة شفافةبصريا عن طريق العلاج مع إما مائي 2،3،4،5،6،7 ،8،9 أو العضوية المذيبات القائمةعلى 10،11،12،13 الحلول. إدخال 3DISCO (التصوير 3D من الأجهزة المذيبات تطهيرها)11،12 وuDISCO خليفتها (في نهاية المطاف التصوير 3D من الأجهزة المذيبات تطهيرها)13 وفرت أداة سريعة نسبيا، بسيطة، وغير مكلفة مع قدرات ممتازة المقاصة. والمكونات الرئيسية لبروتوكول المقاصة هي المذيبات العضوية tert-butanol (TBA)، والكحول البنزيل (BA)، وبنزوات البنزيل (BB)، والإيثر الثنائي الفينيل (DPE). تطوير وإضافة iDISCO (التصوير 3D تمكين وضع العلامات المناعية من الأجهزة المذيبات تطهيرها)14،بروتوكول متوافق للبقع المناعية، شكلت ميزة أخرى على الأساليب القائمة وتمكين وضع العلامات الأنسجة العميقة من المستضدات من الفائدة، فضلا عن التخزين على المدى الطويل من العينات الملطخة بالمناعة. وهكذا، فإن الجمع بين iDISCO14 و uDISCO13 يسمح للتصوير عالية الدقة من البروتينات التي تحمل اسم الأجسام المضادة في أقسام الأنسجة الكبيرة (تصل إلى 1 ملم) باستخدام CLSM التقليدية.
الحفاظ على بنية الجهاز المعقدة في جميع الأبعاد الثلاثة مهم بشكل خاص لأنسجة الدماغ. الخلايا العصبية تشكل شبه السكان الخلوية غير متجانسة جدا مع مورفولوجيات 3D متنوعة للغاية على أساس التوقعات النيورايت (استعرض من قبل ماسلاند15). وعلاوة على ذلك، يتكون الدماغ من عدد من المقصورات والمقصورات الفرعية، يتكون كل منها من مجموعات فرعية خلوية مختلفة ونسب منها، بما في ذلك الخلايا الغليفية والخلايا العصبية (التي استعرضها فون بارتالد وآخرون16). كفيروس عصبي، فإن فيروس داء الكلب (RABV، الذي استعرضه Fooks et al.17)يصيب الخلايا العصبية في المقام الأول، وذلك باستخدام آلات النقل الخاصة بهم للسفر في اتجاه رجعي على طول المحاور من الموقع الرئيسي للعدوى إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS). يسمح البروتوكول الموضح هنا (الشكل1A)بالكشف بمساعدة المناعة والتصور للخلايا المصابة بـ RABV وRABV في أكوام صور كبيرة ومتماسكة تم الحصول عليها من أنسجة الدماغ المصابة. وهذا يمكّن من إجراء تقييم غير متحيز وثلاثي الدقة لبيئة العدوى. وهو ينطبق على أنسجة الدماغ من مجموعة متنوعة من الأنواع، ويمكن القيام به مباشرة بعد التثبيت أو بعد التخزين الطويل الأجل للعينات في البارافورمالهايد (PFA)، ويسمح بتخزين وإعادة تصوير العينات الملونة وتطهيرها لعدة أشهر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم استخدام مواد الدماغ المحفوظة الثابتة بـ PFV. تم تقييم الدراسات التجريبية الحيوانية ذات الصلة من قبل لجنة الرعاية الحيوانية المسؤولة، واستخدام، والأخلاقيات التابعة لمكتب الدولة للزراعة والسلامة الغذائية وصيد الأسماك في مكلنبورغ بوميرانيا الغربية (LALFF M-V) وحصلت على الموافقة بإذن 7221.3-2.1-002/11 (الفئران) و 7221.3-1-068/16 (النمس). وقد أجريت الرعاية العامة والأساليب المستخدمة في التجارب الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة.
تحذير: يستخدم هذا البروتوكول مواد سامة و/أو ضارة مختلفة، بما في ذلك PFA، الميثانول (MeOH)، بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)،أزيد الصوديوم (NaN3)،TBA، BA، BB، وDPE. MeOH وTBA قابلة للاشتعال للغاية. تجنب التعرض عن طريق ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والقفازات، وحماية العين) وإجراء التجارب في غطاء الدخان. جمع النفايات بشكل منفصل في الحاويات المناسبة والتخلص منها وفقا للوائح المحلية. ويصنف فيروس داء الكلب على أنه ممرض على مستوى السلامة الأحيائية (BSL)-2، وبالتالي يمكن التعامل معه عموماً في ظل ظروف BSL-2. وقد تتطلب بعض الأنشطة، بما في ذلك الإجراءات التي قد تولد الهباء الجوي، أو العمل بتركيزات عالية من الفيروسات، أو العمل مع فيروسات الليسا الجديدة، تصنيف BSL-3. يوصى بالوقاية قبل التعرض للموظفين المعرضين لمخاطر عالية، بمن فيهم القائمون على رعاية الحيوانات وعمال المختبرات18،19. الرجوع إلى لوائح السلطة المحلية.
1. تثبيت أنسجة الدماغ والقسم
- إصلاح عينات الدماغ في حجم مناسب من 4٪ PFA في محلول الفوسفات المخزنة المالحة (PBS [درجة الحموضة 7.4]) لمدة 48 ساعة على الأقل في 4 درجة مئوية (مع نسبة الأنسجة إلى المثبتة التقريبية من 1:10 [V/v]).
- غسل عينات الأنسجة 3X في PBS لمدة 30 دقيقة على الأقل كل غسل وتخزينها في 0.02٪ NaN3/ PBS في 4 درجة مئوية حتى استخدامها.
- قسم الأنسجة إلى 1 مم سميكة باستخدام الاهتزاز (معدل تغذية شفرة: 0.3-0.5 مم / ثانية، السعة: 1 ملم، سمك شريحة: 1000 م).
- للاحتفاظ بتسلسل الشريحة الصحيح، قم بتخزين كل مقطع من الأنسجة بشكل منفصل في بئر لوحة ثقافة الخلية متعددة الآبار. إضافة 0.02٪ NaN3/ PBS وتخزين أقسام الأنسجة في 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
2. عينة المعالجة المسبقة مع الميثانول
ملاحظة: تنفيذ جميع خطوات الحضانة مع التذبذب لطيف، وإذا لم يذكر خلاف ذلك، في درجة حرارة الغرفة. حماية العينات من الضوء. وتخدم المعالجة المسبقة للعينة الغرض العام المتمثل في تحسين انتشار الأجسام المضادة والحد من الفلورة الذاتية للأنسجة عن طريق التعرض لـ MeOH و H2O2،على التوالي14.
- إعداد 20٪ (V / V)، 40٪، 60٪، و 80٪ حلول MeOH في الماء المقطر. على سبيل المثال، ل20٪ MeOH، إضافة 10 مل من 100٪ MeOH إلى 40 مل من الماء المقطر في وعاء قابل للغلق المناسب ومزيج عن طريق عكس ذلك.
- نقل العينات إلى أوعية ذات حجم معقول (على سبيل المثال، 5 أنابيب رد فعل مل). الحرص على استخدام المواد المقاومة كيميائيا للكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول. على سبيل المثال، لاحظ أنه في حين أن البولي بروبلين هو مناسب، والبوليسترين ليست كذلك.
ملاحظة: تشير مواصفات وحدة التخزين في هذا البروتوكول إلى أنابيب التفاعل 5 مل. إذا تم استخدام وعاء مختلف، ضبط وحدات التخزين وفقا لذلك. - احتضان العينات في 4 مل من كل تركيز من سلسلة أعدت من حلول MeOH في ترتيب تصاعدي لمدة ساعة واحدة لكل منهما.
- احتضان العينات 2X لمدة ساعة واحدة كل في نقية (100٪) حسناً، حسناً، حسناً، حسناً
- تبريد العينات إلى 4 درجة مئوية (على سبيل المثال، في ثلاجة آمنة مختبر).
- إعداد محلول التبييض (5٪ H2O2 في MeOH) عن طريق، على سبيل المثال، تخفيف 30٪ H2O2 حل الأسهم في 1:6 في نقية (100٪) MeOH، والبرد في 4 درجة مئوية.
- إزالة MeOH 100٪ من العينات المبردة وإضافة 4 مل من محلول التبييض prechilled (5٪ H2O2 في MeOH). الحضانة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- تبادل محلول التبييض لمدة 4 مل من 80٪ MeOH والحضانة لمدة 1 ح. مواصلة استخدام سلسلة أعدت من حلول MeOH في ترتيب تنازلي لمدة ساعة واحدة لكل حتى يتم احتضان العينات لمدة 1 ساعة في 4 مل من 20٪ MeOH.
- غسل العينات 1X لمدة ساعة مع 4 مل من PBS.
3. تلطيخ المناعة
ملاحظة: تنفيذ جميع خطوات الحضانة مع التذبذب لطيف، وإذا لم يذكر خلاف ذلك، في درجة حرارة الغرفة. حماية العينات من الضوء. لمنع نمو الميكروبات، أضف NaN3 إلى التركيز النهائي بنسبة 0.02% إلى الحلول في هذا القسم. عينات الأنسجة هي أكثر نفاذية عن طريق العلاج مع المنظفات nonionic تريتون X-100 وتوين 20. يتم استخدام المصل العادي لمنع ربط الأجسام المضادة غير محددة. يتم إضافة الجلايسين والهيبارين للحد من خلفية الوسم المناعي14.
- غسل العينات 2X لمدة 1 ساعة كل في 4 مل من 0.2٪ تريتون X-100/PBS.
- Permeabilize العينات لمدة 2 أيام في 37 درجة مئوية مع 4 مل من 0.2٪ تريتون X-100/20٪ DMSO / 0.3 M غليسين / PBS.
- منع الربط غير محددة من الأجسام المضادة عن طريق احتضان العينات لمدة 2 أيام في 37 درجة مئوية في 4 مل من 0.2٪ تريتون X-100/10٪ DMSO / 6٪ المصل العادي / PBS.
ملاحظة: استخدم المصل الطبيعي من نفس النوع الذي تم رفع الجسم المضاد الثانوي فيه لتحقيق نتائج حظر مثالية. - احتضان العينات في 2 مل من محلول الأجسام المضادة الأولية (3٪ المصل العادي / 5٪ DMSO / PTwH [PBS-توين 20 مع الهيبارين] + الأجسام المضادة الأولية / الأجسام المضادة) لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية. قم بتحديث محلول الأجسام المضادة الأساسي بعد 2.5 يوم.
- لPTwH، إعادة تشكيل ملح الصوديوم الهيبارين في الماء المقطر لجعل 10 ملغ / مل حل الأوراق المالية (تخزين هذا الحل، aliquoted، في 4 درجة مئوية). إضافة محلول الأسهم إلى 0.2٪ توين 20 /PBS إلى تركيز نهائي من 10 ميكروغرام / مل.
ملاحظة: قد يتطلب اختيار تخفيف الأجسام المضادة الصحيح التحسين. بشكل عام، تركيزات الكيمياء المناعية القياسية هي نقطة انطلاق جيدة.
- لPTwH، إعادة تشكيل ملح الصوديوم الهيبارين في الماء المقطر لجعل 10 ملغ / مل حل الأوراق المالية (تخزين هذا الحل، aliquoted، في 4 درجة مئوية). إضافة محلول الأسهم إلى 0.2٪ توين 20 /PBS إلى تركيز نهائي من 10 ميكروغرام / مل.
- اغسل العينات لمدة يوم واحد في 4 مل من PTwH، وتبادل المخزن المؤقت للغسيل على الأقل 4x-5x خلال اليوم وترك الغسيل النهائي في ليلة وضحاها.
- احتضان العينات في 2 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوية (3٪ المصل العادي / PTwH + الأجسام المضادة الثانوية / الأجسام المضادة) لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية. قم بتحديث محلول الأجسام المضادة الثانوي بعد 2.5 يوم.
- تخفيف الأجسام المضادة الثانوية / الأجسام المضادة في 1:500 في محلول الأجسام المضادة الثانوية (أي، 4 ميكرولتر في 2 مل).
- اغسل العينات لمدة يوم واحد كما هو موضح في الخطوة 3.5، وترك الغسيل النهائي في ليلة وضحاها.
4 - التلطيخ النووي
ملاحظة: تنفيذ جميع خطوات الحضانة مع التذبذب لطيف، وإذا لم يذكر خلاف ذلك، في درجة حرارة الغرفة. حماية العينات من الضوء. وإذا لم تكن هناك حاجة إلى تلطيخ نووي أو إذا كان الطول الموجي/الانبعاث للموجة من TO-PRO-3 مطلوباً للإثارة أو الكشف عن فلوروفور آخر، تخطي هذه الخطوة.
- تخفيف وصمة عار حمض نووي TO-PRO-3 في 1:1,000 في PTwH واحتضان العينات في 4 مل من محلول تلطيخ النووية لمدة 5 ساعة.
- اغسل العينات لمدة يوم واحد كما هو موضح في الخطوة 3.5، وترك الغسيل النهائي في ليلة وضحاها.
ملاحظة: بعد السهي، يمكن تخزين العينات في PBS في 4 درجة مئوية حتى مسح البصرية.
5. إزالة الأنسجة
ملاحظة: تنفيذ جميع خطوات الحضانة مع التذبذب لطيف، وإذا لم يذكر خلاف ذلك، في درجة حرارة الغرفة. حماية العينات من الضوء. يتم تجفيف عينات الأنسجة في سلسلة متدرجة من حلول TBA. وبما أن تلطيخ المناعة يتطلب حلولاً مائية، يجب الانتهاء من جميع إجراءات التلطيخ قبل تطهير الأنسجة. يتم تحقيق التخليص البصري ومطابقة مؤشر الانكسار عن طريق العلاج مع خليط من BA، BB، وDPE. يتم استكمال حل المقاصة مع DL-α-توكوفيرول كمضاد للأكسدة13.
- إعداد 30٪ (V / V)، 50٪، 70٪، 80٪، 90٪، و 96٪ TBA الحلول في الماء المقطر. على سبيل المثال، بالنسبة لـ 30٪ TBA، إضافة 15 مل من 100٪ TBA إلى 35 مل من الماء المقطر في وعاء قابل للغلق المناسب ومزيج عن طريق عكس.
ملاحظة: TBA لديه نقطة انصهار من 25-26 درجة مئوية; وبالتالي، فإنه يميل إلى أن تكون صلبة في درجة حرارة الغرفة. من أجل إعداد حلول TBA، تسخين زجاجة مختومة جيدا في 37 درجة مئوية في حاضنة أو حمام مائي. - تجفيف العينات مع 4 مل من كل تركيز من سلسلة أعدت من حلول TBA في ترتيب تصاعدي لمدة 2 ساعة لكل منهما. ترك 96٪ TBA على بين عشية وضحاها.
- تجفيف العينات أكثر في نقية (100٪) TBA لمدة 2 ساعة.
- إعداد حل المقاصة BABB-D15.
ملاحظة: BABB-D15 هو مزيج من مكتبة الإسكندرية وBB (BABB) التي يتم خلطها مع DPE بنسبة x:1، حيث يتم تحديد x في اسم الحل، في هذه الحالة 15.- لBABB، مزيج من جزء واحد BA مع جزأين BB.
- مزيج BABB وDPE بنسبة 15:1.
- إضافة 0.4 فول٪ DL-α-توكوفيرول (فيتامين E).
ملاحظة: على سبيل المثال، ل20 مل من BABB-D15، مزيج 6.25 مل من مكتبة الإسكندرية مع 12.5 مل من BB. إضافة 1.25 مل من DPE وتكمله مع 0.08 مل من DL-α-توكوفيرول.
- قم بإلغاء مسح العينات في محلول المقاصة حتى تكون شفافة بصريًا (2-6 ساعة).
- يمكن تخزين العينات في 4 درجة مئوية في BABB-D15، محمية من الضوء، حتى التركيب والتصوير.
6. عينة تصاعد
- باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد، اطبع غرفة التصوير والغطاء (المادة: copolyester [CPE]، فوهة: 0.25 مم، ارتفاع الطبقة: 0.06 مم، سمك الجدار: 0.88 مم، عدد الجدران: 4، الحفر: 100٪، لا هيكل دعم؛ المقابلة . يمكن العثور على ملف STL في المواد التكميلية لهذا البروتوكول).
- تجميع غرفة التصوير(الشكل 2).
- جبل غطاء جولة (قطرها: 30 ملم) على غرفة التصوير مع RTV-1 (مكون واحد غرفة درجة الحرارة- مبركن) سيليكون المطاط. إزالة المطاط سيليكون الزائدة مع مسحة القطن مبللة بالماء وعلاج بين عشية وضحاها.
- قم بتركيب غطاء دائري (قطر: 22 مم) على الغطاء مع مطاط السيليكون RTV-1. إزالة المطاط سيليكون الزائدة مع مسحة القطن مبللة بالماء وعلاج بين عشية وضحاها.
- ضع العينة في غرفة التصوير، وأضف وحدة تخزين صغيرة من BABB-D15، وأدخل الغطاء. املأ الغرفة بـ BABB-D15 من خلال مدخل الباب، باستخدام إبرة تحت الجلد (27 G × 3/4 بوصة [0.40 مم × 20 مم]).
- سد مدخل وختم غرفة التصوير مع المطاط سيليكون RTV-1. علاج بين عشية وضحاها في الظلام.
7. التصوير ومعالجة الصور
- إعداد الحصول على الصورة عن طريق تحديد خطوط الليزر ذات الصلة لتتناسب مع الفلوروفور المستخدمة. ضبط نطاقات الكشف عن كل كاشف لمنع تداخل الإشارة بين القنوات.
ملاحظة: نطاقات الكشف المثالي لأليكسا فلور 488، اليكسا فلور 568، وTO-PRO-3 هي 500-550 نانومتر، 590-620 نانومتر، و 645-700 نانومتر، على التوالي. - اختر معلمات الاكتساب، وحدد الحد العلوي والسفلي لمكدس z، واحصل على مكدس الصور.
ملاحظة: معلمات الاكتساب المثالية هي مسح تسلسلي بحجم بكسل من 60-90 نانومتر، وحجم خطوة z 0.5 ميكرومتر، ومتوسط خط 1، وسرعة مسح 400 هرتز، وحجم ثقب من وحدة متجددة الهواء 1. - معالجة كومة الصور باستخدام برامج تحليل الصور المناسبة (مثل فيجي) لتوليد إسقاطات ثلاثية الأبعاد أو إجراء تحليلات متعمقة.
ملاحظة: بسبب الحجم الكبير لملفات الصور المكتسبة عادةً ما يكون استخدام محطة عمل ضروري.- فتح ملف (ملفات) الاكتساب أو الصورة في فيجي (ملف | فتح | حدد الملفات).
- إذا كنت تستخدم، على سبيل المثال، . LIF، حدد أو قم بإلغاء تحديد الخيارات المطلوبة في إطار الحوار تنسيقات حيوية. عرض المكدس مع Hyperstack. بخلاف ذلك، لا توجد اختيارات محددة أو علامات التجزئة ضرورية. اضغط على موافق.
- إذا كان الملف يحتوي على مكدسات صور متعددة، حدد تلك التي سيتم تحليلها وتأكيدها عن طريق الضغط على موافق.
- إجراء تصحيح التبييض عن طريق تقسيم الصورة المدمجة إلى قنوات فردية (صورة | اللون | أداة القنوات، ثم حدد المزيد | تقسيم القنوات). لكل قناة، حدد تصحيح التبييض (صورة | ضبط | تصحيح التبييض) واختر نسبة بسيطة (كثافة الخلفية: 0.0).
ملاحظة: في بعض الحالات، على سبيل المثال، عندما لا يكون هناك اضمحلال خطي للإشارة أو الإشارة ضعيفة جداً بشكل عام، قد تفشل نسبة بسيطة. بدلاً من ذلك، حاول Exponential Fit أو تخطي تصحيح التبييض. - ضبط السطوع والتباين لكل قناة باستخدام أشرطة التمرير (صورة | ضبط | السطوع | التباين).
- دمج القنوات (صورة | اللون | دمجالقنوات)، وجعل مركب (صورة | اللون | أداة القنوات، ثم حدد المزيد | جعلمركب)، وتحويلها إلى تنسيق RGB (صورة | اللون | أداة القنوات، ثم حدد المزيد | قم بالتحويل إلى RGB).
- إذا لزم الأمر، تغيير حجم مكدس الصور لتقليل وقت الحساب وحجم الملف (صورة | ضبط | الحجم،كلا الخيارين تكتك بالإضافة إلى الاستيفاء bilinear).
- إنشاء إسقاط ثلاثي الأبعاد (صورة | مكدسات | 3D المشروع). اختر نقطة ألمع كطريقة إسقاط وتعيين تباعد الشرائح لمطابقة حجم خطوة z لمكدس الصور المكتسبة. للحصول على أقصى جودة، قم بتعيين زيادة زاوية الدوران إلى 1 وتمكين الاستيفاء. تعديل الاستدارة الإجمالية وعتبات الشفافية والتعتيم حسب الحاجة.
- إذا لزم الأمر، تعديل التباين والسطوع عن طريق تحويل الإسقاط 3D مرة أخرى إلى تنسيق 8 بت (صورة | النوع | 8 بت). استخدام المتزلجون المعنية (صورة | ضبط | السطوع | التباين) وإعادة تحويل مكدس الصور إلى تنسيق RGB كما هو موضح في الخطوة 7.3.4.
- حفظ الإسقاط 3D كـ . TIF (تنسيق ملف الصورة) و . AVI (تنسيق ملف الفيديو).
- فتح ملف (ملفات) الاكتساب أو الصورة في فيجي (ملف | فتح | حدد الملفات).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مزيج من iDISCO14 و uDISCO13 جنبا إلى جنب مع CLSM عالية الدقة يوفر رؤى عميقة في القرار spatiotime واللدونة من العدوى RABV من أنسجة الدماغ والسياق الخلوي المحيطة بها.
باستخدام التلطيخ المناعي للبروتين الفوسفاتي RABV (P)، يمكن تصور الطبقات المعقدة منالخلايا العصبية المصابة في أقسام سميكة من أدمغة الماوس (الشكل 3). وفي وقت لاحق، يمكن إعادة بناء الإسقاطات ثلاثية الأبعاد السلسة لأكوام الصور المكتسبة (الشكل3ألف،B، اللوحة اليمنى؛ الرسوم المتحركة الشكل 1). يجب توخي الحذر عند استخدام الأجسام المضادة الأولية من والأجسام المضادة الثانوية ضد الأنواع التي تنشأ منها مادة الأعضاء. أدى استخدام الأجسام المضادة للماوس IgG على أنسجة الدماغ الماوس في تلطيخ متميزة من نظام الأوعية الدموية (الشكل3B،لوحة اليسار). بسبب دقة عالية يتم الحصول على أكوام الصورة مع، يمكن تقييم العدوىتصل إلى مستوى خلية واحدة (الشكل 4)، مما يسمح التأكيدات على، على سبيل المثال، وفرة وتوزيع مستضد داخل الخلية (الشكل4C ).
وبصرف النظر عن أنسجة الدماغ الماوس، ويمكن أيضا تطبيق البروتوكول على أنسجة الدماغ من الأنواع الحيوانية الأخرى (على سبيل المثال، النمس) (الشكل5; الرسوم المتحركة الشكل 2). وكشفت الأجزاء المأخوذة من مقصورات مختلفة من الدماغ النمس المصاب بدرجة متفاوتة من العدوى RABV (الشكل5A-D).
وبما أن الدماغ يضم العديد من الفئات الفرعية الخلوية المختلفة، فإن التمايز بين هذه التجمعات أمر حيوي. باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد علامات الخلايا، من الممكن تقييم الهوية الخلوية للخلايا المصابة والمجاورة. على سبيل المثال، يمكن تمييز الخلايا النجمية عن طريق التعبير عن البروتين الحمضي الليفي الغليفي (GFAP) (الشكل6A,C; الرسوم المتحركة الشكل3)، في حين أن النيورايتات يمكن أن تكون ملطخة على وجه التحديد للبروتين المرتبطة microtubule 2 (MAP2) (الشكل6B، D؛ الرسوم المتحركة الشكل 4). في الوقت نفسه، يمكن في هذه الحالة، البروتينات الفيروسية، في هذه الحالة، RABV nucleoprotein (N)، أن تكون كوستايند لتقييم العلاقة بين الخلايا المصابة وsubpopulation الخلوية أبرز.
الشكل 1 المبدأ الأساسي وسير العمل للبروتوكول. (أ) التمثيل الرسومي لسير العمل استناداً إلى البروتوكولات من Renier et al.14 and Pan et al.13. (B) اثنين من شرائح الدماغ النمس مثالية، واحدة قبل (اللوحة اليسرى) وواحدة بعد العلاج مع المذيبات العضوية (اللوحة اليمنى). مسح يتحول الأنسجة شفافة بصريا كما يمكن ملاحظتها من قبل النص ثم للقراءة. يتم تضمين شريحة الدماغ التي تم تطهيرها في غرفة التصوير المطبوعة ثلاثية الأبعاد (اللوحة اليمنى). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 الرسم التوضيحي الفني لغرفة التصوير المطبوعة ثلاثية الأبعاد. (أ) رسم عرض انفجرت من غرفة التصوير. خطوط متقطعة نقطة تسليط الضوء على المكونات التي يجب تركيبها على بعضها البعض باستخدام المطاط سيليكون RTV-1. تمثل الخطوط المتقطعة تعليمات للتجميع اللاحق للغرفة. (B) CAD (تصميم بمساعدة الكمبيوتر) ملف غرفة التصوير. المقابلة . يمكن العثور على ملف STL لطباعة غرفة التصوير في الموادالتكميلية . (C) تجميعها بالكامل غرفة التصوير. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 تصوير الأنسجة العميقة لأنسجة الدماغ الماوس المصابة RABV. (A و B)أصيب الفئران بفيروس شارع الفرج المؤتلف. RABV P تلطيخ (الأخضر) يكشف عن طبقات الخلايا العصبية المصابة مع كبير, التوقعات النيورايت متشابكة داخل أنسجة الدماغ تطهيرها. كانت النوى ملطخة بـ TO-PRO-3 (الأزرق). (ب) استخدام الأجسام المضادة الثانوية IgG المضادة للماوس ذات العلامات الفلورية (الحمراء) على أنسجة الماوس يؤدي إلى وضع علامات متميزة على نظام الأوعية الدموية. إعادة بناء 3D من أكوام الصور المكتسبة تمكن المراقبة من زوايا عرض مختلفة (A و B، لوحات الحق). قضبان مقياس = 60 درجة.
الشكل 4 يتيح الحصول على صورة عالية الدقة إجراء تقييمات معقدة تصل إلى مستوى خلية واحدة. تم تشريح الدماغ من فأر مصاب بـ SAD L16. (A) RABV P تلطيخ (الأخضر) يسلط الضوء على الخلايا العصبية المصابة بشكل فردي. (B و C)تظهر الصور والإسقاطات التفصيلية أنه يمكن إجراء تحليلات متعمقة لوفرة المستضد اتّساحه وتوزيعه وتوطينه. كانت النوى ملطخة بـ TO-PRO-3 (الأزرق). قضبان مقياس = 20ميكرومتر (A)، 5 ميكرومتر (C). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 تصوير الأنسجة العميقة لأنسجة الدماغ المصابة بـ RABV. لقد أصيب (فيريت) بالكلاب في شارع (رابف) (A–D) تم أخذ شرائح من مناطق محددة من الدماغ، ملطخة بمناعية لRABV P (الأخضر)، ومسح بصريا. وتبين الإسقاطات أن الخلايا المصابة في أجزاء مختلفة من الدماغ تختلف من حيث الكمية والمورفولوجيا. وعلاوة على ذلك، فإنها تسلط الضوء على انطباق البروتوكول على أنسجة أخرى غير المستمدة من الماوس. كانت النوى ملطخة بـ TO-PRO-3 (الأزرق). قضبان مقياس = 60 درجة.
الشكل 6 يسمح الفلورة المناعية متعددة الألوان بكوستاينينغ العلامات الخلوية. تم استخدام شرائح أنسجة الدماغ من النمس المصابة بالكلاب شارع RABV وcoimmunostained لRABV N (الأحمر) وإما(A و C) GFAP (الأخضر) أو (B و D)MAP2 (الأخضر). في حين GFAP هو علامة astrocyte، MAP2 يسلط الضوء على وجه التحديد النيورايتات. كانت النوى ملطخة بـ TO-PRO-3 (الأزرق). (C و D)في الجزء السفلي، يتم تصوير عمليات استخراج شريحة واحدة من طرق عرض التفاصيل المذكورة من الإسقاطات المدمجة. قضبان مقياس = 15 ميكرومتر (A و B)10 ميكرومتر (C and D). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل المتحرك 1: عمليات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد وإسقاطات تفصيلية لأكوام الصور من أدمغة الفئران المصابة بـ RABV. تم إنشاء الإسقاطات من مكدسات الصور الموضحة في الشكل 3. (A و C)الرسوم المتحركة من كامل مكدسات z المعنية. (ب) إسقاط مفصل لإعادة بناء 3D من جزء من كومة z من المناطق التي تم تسليط الضوء عليها في بداية الفيديو. (D) إسقاط مفصل لمخطط لجزء من كومة z من المناطق التي تم إبرازها في بداية الفيديو. الأخضر = RABV P; الأحمر = الماوس IgG. الأزرق = النوى. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
الشكل المتحرك 2: إعادة بناء 3D من أكوام الصور المكتسبة من الدماغ النمس المصابة RABV. تم إنشاء الإسقاطات من مكدسات الصور الموضحة في الشكل 5. (A–D) تشير الشروح إلى نفس الشكل وتصف المناطق ذات الصلة من الدماغ التي أخذت منها الشرائح. الأخضر = RABV P; الأزرق = النوى. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
الرسوم المتحركة الشكل 3: الإسقاط التدريجي للقنوات المختلفة لإعادة بناء 3D من الدماغ النمس المصابة RABV كوستايند مع علامة الخلايا النجمية GFAP. تم إنشاء الإسقاطات من مكدس الصور الموضح في الشكل 6A. الإضافة التدريجية للقنوات تبدأ مع RABV N (الأحمر)، وبعد ذلك اتبع نوى الخلية (الأزرق) وأخيرا، GFAP (الأخضر)، في حين أن الطرح يزيل أولا RABV N، ثم نوى الخلية، وفي نهاية المطاف GFAP. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
الرسوم المتحركة الشكل 4: الإسقاط التدريجي للقنوات المختلفة لإعادة بناء 3D من الدماغ النمس المصابة RABV كوستايند مع علامة الخلايا العصبية MAP2. تم إنشاء الإسقاطات من مكدس الصور الموضح في الشكل 6B. الإضافة التدريجية للقنوات تبدأ مع RABV N (الأحمر)، وبعد ذلك اتبع نوى الخلية (الأزرق) وأخيرا، MAP2 (الأخضر)، في حين أن الطرح يزيل أولا RABV N، ثم نوى الخلية، وفي نهاية المطاف MAP2. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عودة ومواصلة تطوير تقنيات إزالة الأنسجة في السنوات الأخيرة2و3و4 و5 و6و7و8، 9 , 10 سنوات , 11 , 12 , 13 , 14 فتحت العديد من الاحتمالات الجديدة للحصول على أكوام صورة كبيرة الحجم من أنسجة الأعضاء. وقد وفر ذلك أداة قوية لا مثيل لها لدراسة العديد من المواضيع الأخرى، العدوى بالفيروس. إعادة بناء 3D اللاحقة من هذه المداخن صورة تمكن التأكيدات المتطورة على سبيل المثال، التروبيسم الفيروس، وفرة، ومسار الوقت للعدوى. يصف هذا البروتوكول التصور بمساعدة العلامات المناعية للعدوى RABV في أنسجة الدماغ التي تم تطهيرها من المذيبات.
هناك العديد من الخطوات الحاسمة في إعداد واقتناء أكوام الصور من الأنسجة ذات العلامات المناعية، والمذيبات تطهيرها. التعرض لفترات طويلة لPFA يمكن أن تخفي الepitopes، وبالتالي، يؤدي إلى انخفاض مضادات الجينات20،21،22. ولذلك، من المهم الحد من أوقات التثبيت إلى الحد الأدنى اللازم ونقل العينات إلى حل مناسب (على سبيل المثال، PBS تكملها 0.02٪ NaN3 للتخزين على المدى الطويل). ومع ذلك، تم الحصول على جميع الصور التمثيلية والإسقاطات المقدمة هنا من عينات الدماغ المحفوظة، والتي تم تخزين بعضها في PFA لأسابيع، وتسليط الضوء على إمكانية تطبيق هذه التقنية على مواد الأعضاء التي تعرضت لPFA ل فترات طويلة من الزمن. وقد أظهرت نتائج مماثلة لعينات الدماغ البشري13. خطوة أخرى، إن لم تكن الأكثر أهمية، هي حضانة الأجسام المضادة. يجب اختيار تركيزات الأجسام المضادة بعناية. في حين أن تركيزات IHC القياسية في معظم الحالات هي نقطة انطلاق جيدة لوضع العلامات على الأجسام المضادة للأنسجة العميقة، قد تتطلب بعض المستضدات تحسين ًا إضافيًا لتركيز الأجسام المضادة. يوضح هذا البروتوكول أن كلاً من RABV N وP يمكن الكشف عنها بسهولة بواسطة الأجسام المضادة المستخدمة. في حين أن المعالجة المسبقة MeOH عادة ما يحسن التحمل المناعي، فإن بعض المستضدات غير متوافقة مع هذا العلاج. وبالنسبة لهؤلاء، قدم رينييه وزملاؤه14 عينة بديلة خالية من MeOH. يتطلب تحليل مكدسات الصور المكتسبة قوة حسابية كافية. وبسبب أحجام الملفات الكبيرة التي تصل إلى عدة غيغابايت لكل مكدس، هناك حاجة إلى أجهزة كمبيوتر قوية لمعالجة الصور. غالباً ما تشمل المعالجة طرح الضوضاء الخلفية وتصحيح التبييض للتعويض عن آثار التبييض المرتبطة بالاكتساب. عند قياس المسافات، يجب أن يوضع في الاعتبار أنه، كأثر جانبي، يتقلص النسيج أثناء عملية المقاصة.
بالمقارنة مع منصات الفحص المجهري الأخرى، مثل التنظير المجهري للورقة الخفيفة (LSFM) أو اثنين من الفوتونات المسح الضوئي المجهري (2PLSM)، CLSM لديه مسافة العمل الأكثر محدودية. لذلك، فمن الضروري أن preslice الأجهزة إلى 1 ملم في سمك للتصوير. بالإضافة إلى ذلك، CLSM لديه أبطأ سرعة الاكتساب بسبب دقة التصوير العالية. ومن شأن استخدام مجهر ورقة الضوء أن يسمح بتصوير أسرع لكميات أكبر تصل إلى تصوير كامل الدماغ، مع التضحية في الوقت نفسه بدقة الصورة. وثمة قيد آخر هو الزيادة المتأصلة في الفلورة الذاتية للأنسجة مع انخفاض الطول الموجي. وهذا يجعل استخدام الفلوروفور والأصباغ متحمس من قبل خط الليزر في 405 نانومتر، بما في ذلك الأصباغ Hoechst، غير عملي إلى المستحيل.
وفيما يتعلق تقنيات أخرى لإزالة الأنسجة، والهجين من iDISCO14 و uDISCO13 يجمع بين السمات الأكثر إيجابية: أنها متوافقة للغاية مع مناعة، تنوعا للغاية، سريع نسبيا وغير مكلفة، فقد قدرات ممتازة المقاصة، وأنه من الممكن مع المجهر البؤري القياسية. وعلاوة على ذلك، لا يقتصر هذا البروتوكول على تلطيخ المناعة وتطهير أنسجة الدماغ، ولكن يمكن أيضا تطبيقه على مجموعة متنوعة من الأنسجة الرخوة الأخرى ومسببات الأمراض، سواء العصبية الغازية وغير الغازية. في الختام، يمثل البروتوكول الموصوف هنا خط أنابيب للتصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة لأنسجة الدماغ المصابة بـ RABV. يمكن استخدام عمليات إعادة بناء أنسجة الدماغ المصابة ثلاثية الدمن للإجابة على مجموعة متنوعة من الأسئلة المتعلقة بتطور مرض RABV، ومسببات الأمراض، والغزو العصبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون توماس [ك.]. [متّنليتر] و [فيرينا] [ت] [كمب] ل [أنفيوو] يقرأ المخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل مبادرة التميز الاتحادية لمكلنبورغ بوميرانيا الغربية والصندوق الاجتماعي الأوروبي (ESF) منحة KoInfekt (ESF/14-BM-A55-0002/16) ومنحة بحثية تعاونية داخل الجدارية على Lyssaviruses في [فريدريش-لوفلر-ينستيت] ([ري-0372]).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Clearing reagent |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Clearing reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Various buffers |
| Diphenyl ether | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Clearing reagent |
| DL-α-Tocopherol | Alfa Aesar | A17039 | Antioxidant |
| Donkey serum | Bio-Rad | C06SBZ | Blocking reagent |
| Glycine | Carl Roth | 3908.2 | Background reduction |
| Goat serum | Merck | S26-100ML | Blocking reagent |
| Heparin sodium salt | Carl Roth | 7692.1 | Background reduction |
| Hydrogen peroxide solution (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sample bleaching |
| Methanol | Carl Roth | 4627.4 | Sample pretreatment |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | Crystalline powder to make fixative solution |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | Prevention of microbial growth in stock solutions |
| tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Sample dehydration for tissue clearing |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Nucleic acid stain |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detergent |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Detergent |
| Miscellaneous | |||
| 5 mL reaction tubes | Eppendorf | 0030119401 | Sample tubes |
| Coverslip, circular (diameter: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Part of imaging chamber |
| Coverslip, circular (diameter: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Part of imaging chamber |
| Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Filling of the imaging chamber with clearing solution |
| RTV-1 silicone rubber | Wacker | Elastosil E43 | Adhesive for the assembly of the imaging chamber |
| Ultimaker CPE 2.85 mm transparent | Ultimaker | 8718836374869 | Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber |
| Technical equipment and software | |||
| 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Printing of imaging chamber |
| Automated water immersion system | Leica | 15640019 | Software-controlled water pump |
| Benchtop orbital shaker | Elmi | DOS-20M | Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm) |
| Benchtop orbital shaker, heated | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Inverted confocal microscope for sample imaging |
| Fiji | NIH (ImageJ) | open source software (v1.52h) | Image processing package based on ImageJ |
| Long working distance water immersion objective | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Sample slicing |
| Workstation | Dell | Precision 7920 | CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
| Primary antibodies | |||
| Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400 |
|
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100 |
| Rabbit anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250 |
| Rabbit anti-RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000 |
|
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
References
- Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction. Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Masland, R. H.
- von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
- Fooks, A. R., et al.
- WHO. WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. , No. 1012 (2018).
- CDC. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services. , (2009).
- Arnold, M. M., et al. Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens. Biotechnic & Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).
- Orbanz, J., Finke, S. Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters. Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).
