Summary
Roman, immunofärgning-kompatibel vävnad clearing tekniker som den ultimata 3D-avbildning av lösningsmedel rensas organ tillåter 3D-visualisering av rabiesvirus hjärninfektion och dess komplexa cellulära miljö. Tjocka, antikropp-märkta hjärnvävnad skivor görs optiskt transparent för att öka bildbehandling djup och för att möjliggöra 3D-analys av konfokala laserscanning mikroskopi.
Abstract
Visualisering av infektions processer i vävnader och organ genom immunolabeling är en viktig metod i modern infektionsbiologi. Förmågan att observera och studera distribution, tropism, och överflöd av patogener insidan av orgel vävnader ger centrala uppgifter om sjukdomsutveckling och progression. Med konventionella mikroskopi metoder, immunolabeling är oftast begränsad till tunna sektioner som erhållits från paraffin-inbäddade eller frysta prover. Men den begränsade 2D bildplanet av dessa tunna sektioner kan leda till förlust av viktig information om den komplexa strukturen hos ett infekterat organ och cellulära kontexten av infektionen. Modern Multicolor, immunofärgning-kompatibel vävnad clearing tekniker ger nu ett relativt snabbt och billigt sätt att studera hög volym 3D bild högar av virus-infekterade orgel vävnad. Genom att utsätta vävnaden för organiska lösningsmedel blir den optiskt transparent. Detta matchar provets brytningsindex och leder så småningom till en signifikant minskning av ljusspridningen. Således, i kombination med långa fria arbetsavstånd mål, kan stora vävnad sektioner upp till 1 mm i storlek avbildas med konventionell konfokal laserscanning mikroskopi (CLSM) med hög upplösning. Här beskriver vi ett protokoll för att tillämpa djup vävnad Imaging efter vävnads clearing att visualisera rabiesvirus distribution i infekterade hjärnor för att studera ämnen som virus patogenes, spridning, tropism, och neuroinvasion.
Introduction
Konventionella histologi tekniker förlitar sig främst på tunna delar av orgel vävnader, som i sig kan ge endast 2D insikter i en komplex 3D-miljö. Även om det är genomförbart i princip kräver 3D-rekonstruktion från seriella tunna sektioner krävande tekniska rörledningar för både skivning och efterföljande i silico-anpassning av de förvärvade bilderna1. Dessutom är sömlös rekonstruktion av z-volymer efter mikrotomen skivning kritisk eftersom både mekaniska och beräkningsmässiga artefakter kan kvarstå på grund av suboptimala bild registrering som orsakas av icke överlappande bild plan, färgning variationer och fysiska nedbrytning av vävnad genom till exempel mikrotomen bladet. I kontrast, ren optisk skivning av intakt tjockt vävnadsprover tillåter förvärvet av överlappande bild plan (översampling) och därmed underlättar 3D-rekonstruktion. Detta, i sin tur, är mycket fördelaktigt för analys av infektions processer i komplexa cellpopulationer (t. ex., neuronala nätverk i samband med omgivande gliaceller och immunceller). Emellertid, inneboende hinder av tjocka vävnad sektioner inkluderar ljusspridning och begränsad antikropps inträngning i vävnaden. Under de senaste åren har en mängd olika tekniker utvecklats och optimerats för att lösa dessa problem2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , elva , 12 , 13. i huvudsak vänds målvävnaderna optiskt transparent genom behandling med antingen vatten2,3,4,5,6,7 ,8,9 eller organiska lösningsmedelsbaserade10,11,12,13 lösningar. Införandet av 3disco (3D-avbildning av lösningsmedelsavklarade organ)11,12 och dess efterträdare udisco (Ultimate 3D Imaging av lösningsmedelsavklarade organ)13 förutsatt en relativt snabb, enkel och billig verktyg med utmärkta clearingmöjligheter. De viktigaste beståndsdelarna i clearingprotokollet är de organiska lösningsmedlen tert-butanol (TBA), bensylalkohol (ba), bensylbensoat (BB) och difenyleter (DPE). Utveckling och tillägg av iDISCO (immunolabeling-aktiverad 3D-avbildning av lösningsmedelsavklarade organ)14, ett kompatibelt immunofärgnings protokoll, utgjorde en annan fördel jämfört med befintliga metoder och möjliggjorde djup vävnads märkning av antigener av intresse, samt långtidslagring av immunfärgade prover. Således möjliggör kombinationen av iDISCO14 och udisco13 för högupplöst avbildning av antikroppsmärkta proteiner i stora vävnads sektioner (upp till 1 mm) med konventionell clsm.
Bevarandet av ett organs komplexa struktur i alla tre dimensionerna är särskilt viktigt för hjärnvävnad. Nervceller utgör en mycket heterogena cellulära subpopulation med mycket varierande 3D morfologier baserat på deras påverkar prognoser (granskas av masland15). Dessutom består hjärnan av ett antal fack och underavdelningar, som vardera består av olika cellulära subpopulationer och förhållanden därav, inklusive gliaceller och neuroner (granskad av von Bartheld et al.16). Som ett neurotropa virus, rabiesvirus (rabv, granskas av fooks et al.17) infekterar främst nervceller, med hjälp av deras transport maskiner att resa i retrograd riktning längs axoner från den primära platsen för infektion till centralanervsystemet (CNS). Det protokoll som beskrivs här (figur 1A) möjliggör immunofärgning-assisterad detektion och visualisering av RABV-och rabv-infekterade celler i stora, sammanhängande bild stackar som erhållits från infekterad hjärnvävnad. Detta möjliggör en opartisk, 3D högupplöst bedömning av infektions miljön. Det är tillämpligt på hjärnvävnad från en mängd olika arter, kan utföras omedelbart efter fixering eller efter långtidslagring av prover i PARAFORMALDEHYD (PFA), och gör det möjligt att lagring och reimaging av färgade och rensas prover i månader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
RABV-infekterade, PFA-fast arkiverade hjärnan material användes. De respektive försöksdjurens experimentella studier utvärderades av den ansvariga djuromsorgen, bruket och etikkommittén av det statliga kontoret för jordbruk, livsmedelssäkerhet och fiske i Mecklenburg-Västra Pomerania (LALFF M-V) och fick godkännande med tillåtelser 7221.3-2.1-002/11 (möss) och 7221.3-1-068/16 (illrar). Allmän vård och metoder som används i djurförsöken utfördes enligt de godkända riktlinjerna.
Varning: detta protokoll använder olika giftiga och/eller skadliga ämnen, inklusive PFA, metanol (MeOH), väteperoxid (H2O2), natriumazid (Nan3), TBA, ba, BB och DPE. MeOH och TBA är mycket brandfarlig. Undvik exponering genom att bära lämplig personlig skyddsutrustning (en labbrock, handskar och ögonskydd) och utföra experiment i ett draghuv. Samla upp avfall separat i lämpliga behållare och kassera det enligt lokala föreskrifter. Rabies virus klassificeras som en biosäkerhetsnivå (BSL)-2 patogen och kan därför i allmänhet hanteras under BSL-2 villkor. Vissa aktiviteter, inklusive procedurer som kan generera aerosoler, arbeta med höga viruskoncentrationer, eller arbeta med nya lyssaviruses, kan kräva BSL-3-klassificering. Profylax före exponering rekommenderas för högrisk personal, inklusive djurskötare och laboratoriearbetare18,19. Se lokala myndighetsföreskrifter.
1. fixering av hjärnvävnad och snittning
- Fixera hjärn prov i en lämplig volym av 4% PFA i fosfatbuffrad saltlösning (PBS [pH 7,4]) under minst 48 timmar vid 4 ° c (med ett approximativt vävnads-till fixerande förhållande på 1:10 [v/v]).
- Tvätta vävnadsproverna 3x i PBS i minst 30 min varje tvätt och förvara dem i 0,02% NaN3/PBS vid 4 ° c till användning.
- Dela upp vävnaden i 1 mm tjocka sektioner med en vibratome (bladmatningshastighet: 0,3 – 0,5 mm/s, amplitud: 1 mm, segment tjock lek: 1 000 μm).
- För att behålla rätt segment sekvens, lagra varje vävnads sektion separat i en brunn av en multispot cellkultur tallrik. Tillsätt 0,02% NaN3/PBS och förvara vävnads sektionerna vid 4 ° c fram till användning.
2. prov förbehandling med metanol
Anmärkning: utför alla inkubations steg med skonsam svängning och, om inte annat anges, vid rumstemperatur. Skydda proverna från ljus. Provet förbehandling tjänar det övergripande syftet att förbättra antikropp diffusion och minska vävnad autofluorescence genom exponering för MeOH och H2O2, respektive14.
- Förbered 20% (v/v), 40%, 60%, och 80% MeOH lösningar i destillerat vatten. Till exempel, för 20% MeOH, tillsätt 10 mL 100% MeOH till 40 mL destillerat vatten i ett lämpligt tätnings Bart kärl och blanda genom att invertera den.
- Överför proverna till någorlunda stora kärl (t. ex. 5 mL reaktionsrör). Var noga med att använda material som är kemiskt resistenta mot de reagens som används i detta protokoll. Till exempel, Observera att medan polypropen är lämplig, polystyren är inte.
Anmärkning: volymspecifikationerna i detta protokoll avser 5 mL reaktionsrör. Om ett annat fartyg används justerar du volymerna därefter. - Inkubera proverna i 4 mL av varje koncentration av den förberedda serien MeOH-lösningar i stigande ordning för 1 h vardera.
- Inkubera proverna 2x för 1 h vardera i ren (100%) MeOH.
- Kyl proverna till 4 ° c (t. ex. i ett laboratorium-kassaskåp).
- Förbered blekning lösning (5% H2O2 i MeOH) genom att, till exempel, späda en 30% H2O2 stamlösning på 1:6 i ren (100%) MeOH och kyla den vid 4 ° c.
- Ta bort 100% MeOH från de kylda proverna och tillsätt 4 mL förkyld bleknings lösning (5% H2O2 i MeOH). Inkubera över natten vid 4 ° c.
- Växla bleknings lösningen för 4 mL 80% MeOH och inkubera i 1 h. Fortsätt att använda den förberedda serien MeOH Solutions i fallande ordning för 1 h vardera tills proverna har inkuberats för 1 h i 4 mL 20% MeOH.
- Tvätta proverna 1x i 1 h med 4 mL PBS.
3. immunofärgning
Anmärkning: utför alla inkubations steg med skonsam svängning och, om inte annat anges, vid rumstemperatur. Skydda proverna från ljus. För att förhindra mikrobiell tillväxt, tillsätt NaN3 till en slutlig koncentration av 0,02% till lösningarna i detta avsnitt. Vävnadsprover är ytterligare permeabiliseras genom behandling med icke-jonaktivt rengöringsmedel Triton X-100 och Tween 20. Normalt serum används för att blockera ospecifik antikroppsbindning. Glycin och heparin tillsätts för att reducera den immunolabelande bakgrunden14.
- Tvätta proverna 2x för 1 h vardera i 4 mL 0,2% Triton X-100/PBS.
- Permeabilize proverna för 2 dagar vid 37 ° c med 4 mL 0,2% Triton X-100/20% DMSO/0.3 M glycin/PBS.
- Blockera ospecifik bindning av antikroppar genom att ruinera proverna i 2 dagar vid 37 ° c i 4 mL 0,2% Triton X-100/10% DMSO/6% normalt serum/PBS.
Anmärkning: Använd normal serum från samma art den sekundära antikroppen togs upp för att uppnå idealiska blockeringsresultat. - Inkubera proverna i 2 mL primär antikropps lösning (3% normalt serum/5% DMSO/PTwH [PBS-Tween 20 med heparin] + primär antikropp/antikroppar) i 5 dagar vid 37 ° c. Uppdatera den primära antikroppslösningen efter 2,5 dagar.
- För PTwH, rekonstruera heparin natriumsalt i destillerat vatten för att göra en 10 mg/mL stamlösning (förvara denna lösning, aliciterat, vid 4 ° c). Tillsätt stamlösningen till 0,2% Tween 20/PBS till en slutlig koncentration av 10 μg/mL.
Obs: att välja rätt antikropps utspädning kan kräva optimering. Generellt, standard immunohistokemi koncentrationer är en bra utgångspunkt.
- För PTwH, rekonstruera heparin natriumsalt i destillerat vatten för att göra en 10 mg/mL stamlösning (förvara denna lösning, aliciterat, vid 4 ° c). Tillsätt stamlösningen till 0,2% Tween 20/PBS till en slutlig koncentration av 10 μg/mL.
- Tvätta proverna i 1 dag i 4 mL PTwH, Byt ut tvättbufferten minst 4x – 5x under dagen och lämna den sista tvätten på natten.
- Inkubera proverna i 2 mL sekundär antikropps lösning (3% normalt serum/PTwH + sekundär antikropp/antikroppar) i 5 dagar vid 37 ° c. Uppdatera den sekundära antikroppslösningen efter 2,5 dagar.
- Späd ut sekundär antikropp/antikroppar vid 1:500 i sekundär antikropps lösning (dvs. 4 μL i 2 mL).
- Tvätta proverna i 1 dag enligt beskrivningen i steg 3,5 och lämna den sista tvätten på natten.
4. nukleär färgning
Anmärkning: utför alla inkubations steg med skonsam svängning och, om inte annat anges, vid rumstemperatur. Skydda proverna från ljus. Om ingen nukleär färgning krävs eller excitation våglängd/utsläpp spektrum av TO-PRO-3 krävs för excitation eller detektering av en annan fluorophore, hoppa över detta steg.
- Späd nukleinsyrningen till-PRO-3 vid 1:1000 i PTwH och inkubera proverna i 4 mL nukleär Färgnings lösning i 5 timmar.
- Tvätta proverna i 1 dag enligt beskrivningen i steg 3,5 och lämna den sista tvätten på natten.
Anmärkning: efter tvättningen kan proverna förvaras i PBS vid 4 ° c till optisk rensning.
5. vävnads rensning
Anmärkning: utför alla inkubations steg med skonsam svängning och, om inte annat anges, vid rumstemperatur. Skydda proverna från ljus. Vävnadsproverna är uttorkad i en graderad serie TBA-lösningar. Eftersom immunofärgning kräver vattenlösningar måste alla infärgnings procedurer vara avslutade innan vävnads rensning. Optisk clearance och refraktiv index matchning uppnås genom behandling med en blandning av BA, BB och DPE. Röjnings lösningen kompletteras med DL-α-tokoferol som en antioxidant13.
- Förbered 30% (v/v), 50%, 70%, 80%, 90%, och 96% TBA lösningar i destillerat vatten. Till exempel, för 30% TBA, tillsätt 15 mL 100% TBA till 35 mL destillerat vatten i ett lämpligt tätnings Bart kärl och blanda genom att invertera.
Anmärkning: TBA har en smältpunkt på 25 – 26 ° c; Sålunda, det tenderar att vara fast vid rumstemperatur. För att förbereda TBA-lösningar, värm den väl tillslutna flaskan vid 37 ° c i en inkubator eller vattenbad. - Torka proverna med 4 mL av varje koncentration av den förberedda serien av TBA-lösningar i stigande ordning för 2 h vardera. Lämna 96% TBA på natten.
- Dehydrera proverna ytterligare i ren (100%) TBA för 2 h.
- Förbered clearing lösning BABB-D15.
Anmärkning: BABB-D15 är en kombination av BA och BB (BABB) som blandas med DPE vid ett förhållande av x: 1, där x anges i lösningens namn, i detta fall 15.- För BABB, blanda en del BA med två delar BB.
- Blanda BABB och DPE vid ett förhållande av 15:1.
- Tillsätt 0,4 Vol% DL-α-tokoferol (vitamin E).
Anmärkning: till exempel, för 20 mL BABB-D15, blanda 6,25 mL BA med 12,5 mL BB. Tillsätt 1,25 mL DPE och komplettera med 0,08 mL DL-α-tokoferol.
- Rensa proverna i clearing lösning tills de är optiskt transparenta (2 – 6 h).
- Proverna kan förvaras vid 4 ° c i BABB-D15, skyddade från ljus, fram till montering och avbildning.
6. prov montage
- Använda en 3D-skrivare, skriva ut bildbehandlings kammaren och locket (material: sampolyester [CPE], munstycke: 0,25 mm, Lagerhöjd: 0,06 mm, vägg tjocklek: 0,88 mm, vägg Count: 4, utfyllnad: 100%, ingen stödstruktur; motsvarande. STL-fil finns i tilläggs materialen i detta protokoll).
- Montera bild kammaren (bild 2).
- Montera en rund täckslip (diameter: 30 mm) på bildbehandlings kammaren med RTV-1 (en-komponents rum-temperatur-vulcanizing) silikon gummi. Ta bort överflödigt silikon gummi med en vattenfuktad bomullspinne och bota över natten.
- Montera en rund täckslip (diameter: 22 mm) på locket med RTV-1 silikon gummi. Ta bort överflödigt silikon gummi med en vattenfuktad bomullspinne och bota över natten.
- Placera provet i en bildbehandlings kammare, tillsätt en liten mängd BABB-D15 och sätt i locket. Fyll kammaren med BABB-D15 genom inloppet med hjälp av en hypodermisk nål (27 G x 3/4 tum [0,40 mm x 20 mm]).
- Anslut inloppet och försegla bildbehandlings kammaren med RTV-1 silikon gummi. Bota över natten i mörkret.
7. bild-och bildbehandling
- Ställ in bild förvärvet genom att välja respektive laserlinje för att matcha de fluoroforer som används. Justera detekterings intervallen för varje detektor för att förhindra att signalen överlappar varandra mellan kanalerna.
Anmärkning: exemplariska Detektionsområden för Alexa fluor 488, Alexa fluor 568, och TO-PRO-3 är 500 – 550 Nm, 590 – 620 nm, och 645 – 700 nm, respektive. - Välj anskaffnings parametrarna, definiera den övre och undre gränsen för z-stacken och hämta bildstapeln.
Anmärkning: exemplarisk förvärvs parametrar är en sekventiell skanning med en pixelstorlek på 60-90 nm, en z-stegs storlek på 0,5 μm, en linje i genomsnitt 1, en skanningshastighet på 400 Hz, och en hålstorlek på 1 luftig enhet. - Bearbeta bildstapeln med hjälp av lämplig bildanalysprogram vara (t. ex. Fiji) för att generera 3D-projektioner eller utföra djupgående analyser.
Obs: på grund av den stora storleken på de förvärvade avbildningsfiler, är användningen av en arbetsstation vanligtvis nödvändigt.- Öppna anskaffningen eller avbildsfilerna i Fiji (Arkiv | Öppna | Välj filer).
- Om du till exempel använder. LIF-filer, markera eller avmarkera önskade alternativ i dialogrutan bio-format. Visa stack med Hyperstack. Annat än att inga specifika val eller fästingar är nödvändiga. Tryck på OK.
- Om filen innehåller flera bildstackar väljer du de som ska analyseras och bekräftar genom att trycka på OK.
- Utför blekmedel korrigering genom att dela den sammanslagna bilden i enskilda kanaler (bild | Färg | Kanal verktygetoch välj sedan mer | Delade kanaler). För varje kanal väljer du blekmedel korrigering (bild | Justera | Blekmedel korrigering) och välj enkelt förhållande (bakgrundsintensitet: 0,0).
Obs: i vissa fall, till exempel, när det inte finns någon linjär sönderfall av signalen eller signalen är för svag övergripande, kan enkelt förhållande misslyckas. Alternativt kan du prova exponentiell passning eller hoppa över blekmedel korrigeringen. - Justera ljusstyrkan och kontrasten för varje kanal med hjälp av skjutreglagen (bild | Justera | Ljusstyrka | Kontrast).
- Sammanfoga kanalerna (bild | Färg | Sammanfoga kanaler), gör en komposit (bild | Färg | Kanal verktygetoch välj sedan mer | Gör komposit) och konvertera den till RGB-format (bild | Färg | Kanal verktygetoch välj sedan mer | Konvertera till RGB).
- Om det behövs ändrar du storlek på bildstapeln för att minska beräkningstiden och filstorleken (bild | Justera | Storlek, båda alternativen markerade plus Bilinjär interpolation).
- Generera en 3D-projektion (bild | Stackar | 3D-projekt). Välj ljusaste punkt som projektionsmetod och Ställ in segment avståndet så att det matchar z-stegstorleken för den förvärvade bildstapeln. För maximal kvalitet anger du rotationsvinkeln till 1 och aktiverar interpolering. Ändra den totala rotationen, genomskinlighets trösklarna och opaciteten efter behov.
- Om det behövs, Justera kontrasten och ljusstyrkan genom att konvertera 3D-projektion tillbaka till 8-bitars format (bild | Typ | 8-bitars). Använd respektive skjutreglage (bild | Justera | Ljusstyrka | Kontrast) och konvertera om bildstapeln till RGB-format enligt beskrivningen i steg 7.3.4.
- Spara 3D-projektion som. TIF-fil (bildfilsformat) och. AVI-fil (videofilformat).
- Öppna anskaffningen eller avbildsfilerna i Fiji (Arkiv | Öppna | Välj filer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kombinationen av iDISCO14 och udisco13 tillsammans med högupplöst clsm ger djupa insikter i den spatiotemporal upplösning och plasticitet av rabv infektion i hjärnvävnad och omgivande cellulära sammanhang.
Med hjälp av immunofärgning av RABV fosfoprotein (P) kan komplexa skikt av infekterade neuronala celler visualiseras i tjocka sektioner av mus hjärnor (figur 3). Därefter kan sömlösa 3D-projektioner av de förvärvade bildstackarna rekonstrueras (figur 3A, B, höger panel; Animerad figur 1). Försiktighet måste iakttas vid användning av primära antikroppar från och sekundära antikroppar mot arten som orgel materialet härstammar från. Användningen av anti-mus IgG antikroppar på mus hjärnvävnad resulterade i en distinkt färgning av kärlsystemet (figur 3B, vänster panel). På grund av den högupplösta bilden stackar förvärvas med, kan infektionen bedömas upp till en enda cellnivå (figur 4), vilket möjliggör påståenden om till exempel överflöd och distribution av antigen i cellen (figur 4C ).
Bortsett från mus hjärnvävnad, protokollet kan också tillämpas på hjärnvävnad från andra djurarter (t. ex. illrar) (figur 5; Animerad figur 2). Sektioner tagna från olika avdelningar i en infekterad iller hjärna avslöjade en varierande grad av RABIAT infektion (figur 5a-D).
Eftersom hjärnan omfattar många olika cellulära subpopulationer, differentiering mellan dessa populationer är avgörande. Med hjälp av antikroppar riktade mot cell markörer, bedömning av den cellulära identiteten hos infekterade och angränsande celler är möjligt. Till exempel kan astrocyter differentieras via uttrycket av gliaceller fibrillärt surt protein (GFAP) (figur 6A, C; Animerad figur 3), medan neuriter kan specifikt färgas för mikrotubule-associerat protein 2 (MAP2) (figur 6B, D; Animerad figur 4). Samtidigt, virala proteiner, i detta fall, RABV nukleoprotein (N), kan costained att bedöma sambandet mellan infekterade celler och den markerade cellulära subpopulationen.
Figur 1 : Grundläggande princip och arbetsflöde för protokollet. A) grafisk representation av arbetsflödet baserat på protokollen från Renier et al.14 och Pan et al.13. (B) två exemplariska iller hjärn skivor, en före (vänster panel) och en efter behandling med organiska lösningsmedel (höger panel). Clearing förvandlar vävnaden optiskt transparent som observerbara av den då läsbara texten. Den rensade hjärn biten bäddas in i en 3D-tryckt bildbehandlings kammare (höger panel). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Teknisk illustration av den 3D-tryckta bildhanterings kammaren. (A) Sprängskiss av bild kammaren. De punktstreckade linjerna markerar komponenter som måste monteras på varandra med silikon gummi av RTV-1. De streckade linjerna representerar instruktioner för den efterföljande monteringen av kammaren. B) bildhanterings kammarens CAD-fil (Computer-Aided Design). Motsvarande. STL-fil att skriva ut bildbehandlings kammaren finns i kompletterande material. C) färdigmonterad bildbehandlings kammare. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Djup vävnad avbildning av RABV-infekterade mus hjärnvävnad. (A och B) möss var infekterade med ett rekombinant räv Street virus. RABV P färgning (grön) avslöjar infekterade neuronala skikt med stora, intrasslad neurit projektioner inuti rensas hjärnvävnad. Nuclei motfärgas med till-PRO-3 (blått). (B) användningen av fluorophore-märkta anti-Mouse IgG sekundära antikroppar (röd) på mus vävnad resulterar i en distinkt märkning av kärlsystemet. 3D-rekonstruktion av de förvärvade bildstaplar möjliggör observation från olika betraktningsvinklar (a och B, höger paneler). Skalstreck = 60 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Med högupplöst Bildinsamling kan komplexa bedömningar upp till en enda cellnivå. Hjärnan dissekeras från en SORGLIG L16-infekterade mus. (A) Rabv P-färgning (grön) belyser en individuellt infekterad neuron. (B och C) detalj bilder och projektioner visar att djupgående analyser av antigen överflöd, distribution och lokalisering kan utföras. Nuclei motfärgas med till-PRO-3 (blått). Skalstreck = 20 μm (A), 5 μm (C). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Djup vävnad avbildning av RABV-infekterade iller hjärnvävnad. Illrar var infekterade med Hundarnas gata RABV. (a–D) Skivor från specificerade områden i hjärnan togs, immunostained för RABV P (grön), och optiskt rensas. Projektioner visar att de infekterade cellerna i olika delar av hjärnan skiljer sig i mängd och morfologi. Dessutom belyser de tillämpligheten av protokollet till andra vävnader än mus-härledda. Nuclei motfärgas med till-PRO-3 (blått). Skalstreck = 60 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Flerfärgad immunofluorescens möjliggör samtidig färgning av cell markörer. Hjärnvävnad skivor från illrar smittade med Hundarnas gata RABV användes och coimmunostained för RABV N (röd) och antingen (a och C) gfap (grön) eller (B och D) MAP2 (grön). Medan GFAP är en astrocyt markör, MAP2 särskilt belyser neuriter. Nuclei motfärgas med till-PRO-3 (blått). (C och D) i botten avbildas enstaka segment extraktioner av de uppräknade detaljvyerna från de sammanslagna projektionerna. Skalstreck = 15 μm (A och B) 10 μm (C och D). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Animerad figur 1:3D rekonstruktioner och detalj prognoser för bild stackar från RABV-infekterade mus hjärnor. Projektionerna genererades från de bild stackar som beskrivs i figur 3. (A och C) animationer av hela respektive z-stackar. (B) en detaljerad projektion av en 3D-rekonstruktion av en del av z-stacken av de områden som belystes i början av videon. Den detaljerad projektion av ett tomogram av en del av z-stacken i de områden som belystes i början av videon. Grön = RABV P; röd = mus IgG; blå = kärnor. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Animerad figur 2:3D rekonstruktioner av bild stackar förvärvade från en RABV-infekterade Ferret hjärnan. Projektionerna genererades från de bild stackar som beskrivs i figur 5. (a–D) Anteckningarna hänvisar till samma siffra och beskriva respektive områden i hjärnan skivorna togs från. Grön = RABV P; blå = kärnor. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Animerad figur 3: gradvis projektion av de olika kanalerna i en 3D-rekonstruktion av en RABV-infekterade iller hjärnan costained med astrocyt markör GFAP. Projektioner genererades från bild stacken som beskrivs i figur 6A. Den gradvisa tillägg av kanaler börjar med RABV N (röd), varefter följa cell kärnornas (blå) och slutligen GFAP (grön), medan subtraktion först tar bort RABV N, då cellkärnor, och så småningom GFAP. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Animerad figur 4: gradvis projektion av de olika kanalerna i en 3D-rekonstruktion av en RABV-infekterade iller hjärnan costained med neuronala markör MAP2. Projektioner genererades från den bildstapel som beskrivs i figur 6B. Den gradvisa tillägg av kanaler börjar med RABV N (röd), varefter följa cell kärnornas (blå) och slutligen, MAP2 (grön), medan subtraktion först tar bort RABV N, då cellkärnor, och så småningom MAP2. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Återkomsten och vidare utvecklingen av vävnads clearingtekniker under de senaste åren2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , elva , 12 , 13 , 14 har öppnat upp många nya möjligheter att få stora volymer bild stackar av orgel vävnad. Detta gav ett oöverträffat och kraftfullt verktyg för att studera, bland många andra ämnen, virusinfektion. Den efterföljande 3D-rekonstruktion av dessa bild stackar möjliggör sofistikerade påståenden om, till exempel, virus tropism, överflöd, och tidsförloppet för infektion. Detta protokoll beskriver immunolabeling-assisterad visualisering av RABV-infektion i lösningsmedelsrensade hjärnvävnad.
Det finns flera kritiska steg i beredningen och förvärvet av bilden stackar av immunolabeled, lösningsmedelsrensade vävnad. Långvarig exponering för PFA kan maskera epitoper och därmed resultera i minskad antigenicitet20,21,22. Det är därför viktigt att begränsa bindningstiden till det minimum som krävs och överföra proverna till en lämplig lösning (t. ex. PBS kompletterad med 0,02% NaN3 för långtidsförvaring). Alla representativa bilder och projektioner som ges här har dock erhållits från arkiverade hjärn prov, av vilka några hade lagrats i PFA i veckor, vilket belyser tillämpligheten av tekniken på organ material som har exponerats för PFA för längre tidsperioder. Liknande resultat har visats för Human hjärn prov13. En annan, om inte det mest, kritiska steget är antikroppen inkubering. Koncentrationer av antikroppar måste väljas noggrant. Medan i de flesta fall, standard IHC koncentrationer är en bra utgångspunkt för djup-vävnad antikropp märkning, vissa antigener kan kräva ytterligare optimering av antikroppskoncentrationen. Detta protokoll visar att både RABV N och P lätt är detekterbara av de använda antikropparna. Medan MeOH förbehandling vanligtvis förbättrar immunolabeling, vissa antigener är oförenliga med denna behandling. För dem, Renier och kollegor14 som en alternativ MeOH-gratis prov förbehandling. Analys av de förvärvade bildstackarna kräver tillräcklig beräkningskraft. På grund av de stora filstorlekarna på upp till flera gigabyte per stapel behövs kraftfulla datorer för att bearbeta bilderna. Postprocessing omfattar ofta subtraktion av bakgrundsljud och en blekmedel korrigering för att kompensera för förvärvs-associerade blekning effekter. Vid mätning av avstånd, måste man hålla i minnet att, som en bieffekt, vävnaden krymper under clearing processen.
I jämförelse med andra mikroskopi plattformar, som ljusplåt fluorescens mikroskopi (lsfm) eller två-Photon laserscanningmikroskopi (2plsm), har clsm den mest begränsade arbetsavstånd. Därför är det nödvändigt att preslice organ till 1 mm i tjocklek för avbildning. Dessutom har CLSM den långsammaste förvärvs hastigheten på grund av dess höga bildupplösning. Användningen av ett lätt ark Mikroskop skulle möjliggöra snabbare avbildning av större volymer upp till hel-hjärnavbildning, samtidigt offra bildupplösning. En annan begränsning är den inneboende ökningen av vävnad autofluorescence med minskande våglängd. Detta gör användningen av fluoroforer och färgämnen upphetsad av laserlinjen vid 405 nm, inklusive Hoechst färgämnen, opraktiskt till omöjligt.
När det gäller andra vävnads clearing tekniker, kombinerar hybrid av iDISCO14 och udisco13 de mest positiva attributen: det är mycket förenligt med immunofärgning, mycket mångsidig, relativt snabb och billig, har det Utmärkt clearing kapacitet, och det är möjligt med en standard konfokal Mikroskop. Dessutom är detta protokoll inte begränsat till immunofärgning och clearing av hjärnvävnad men kan också tillämpas på en mängd andra mjukdelar och patogener, både neuroinvasiv och icke-neuroinvasiv. Sammanfattningsvis är det protokoll som beskrivs här en pipeline för högupplöst 3D-avbildning av RABV-infekterade hjärnvävnad. 3D rekonstruktioner av infekterade hjärnvävnad kan användas för att besvara en mängd frågor om RABV sjukdomsprogression, patogenes, och neuroinvasion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Thomas C. Mettenleiter och Verena te kamp för att kritiskt läsa manuskriptet. Detta arbete stöddes av det federala initiativet för excellens i Mecklenburg-Vorpommern och Europeiska social fonden (ESF) Grant koinfekt (ESF/14-BM-A55-0002/16) och ett interna forskningsanslag på lyssaviruses vid Friedrich-Loeffler-Institutet (RI-0372).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Clearing reagent |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Clearing reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Various buffers |
| Diphenyl ether | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Clearing reagent |
| DL-α-Tocopherol | Alfa Aesar | A17039 | Antioxidant |
| Donkey serum | Bio-Rad | C06SBZ | Blocking reagent |
| Glycine | Carl Roth | 3908.2 | Background reduction |
| Goat serum | Merck | S26-100ML | Blocking reagent |
| Heparin sodium salt | Carl Roth | 7692.1 | Background reduction |
| Hydrogen peroxide solution (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sample bleaching |
| Methanol | Carl Roth | 4627.4 | Sample pretreatment |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | Crystalline powder to make fixative solution |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | Prevention of microbial growth in stock solutions |
| tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Sample dehydration for tissue clearing |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Nucleic acid stain |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detergent |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Detergent |
| Miscellaneous | |||
| 5 mL reaction tubes | Eppendorf | 0030119401 | Sample tubes |
| Coverslip, circular (diameter: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Part of imaging chamber |
| Coverslip, circular (diameter: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Part of imaging chamber |
| Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Filling of the imaging chamber with clearing solution |
| RTV-1 silicone rubber | Wacker | Elastosil E43 | Adhesive for the assembly of the imaging chamber |
| Ultimaker CPE 2.85 mm transparent | Ultimaker | 8718836374869 | Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber |
| Technical equipment and software | |||
| 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Printing of imaging chamber |
| Automated water immersion system | Leica | 15640019 | Software-controlled water pump |
| Benchtop orbital shaker | Elmi | DOS-20M | Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm) |
| Benchtop orbital shaker, heated | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Inverted confocal microscope for sample imaging |
| Fiji | NIH (ImageJ) | open source software (v1.52h) | Image processing package based on ImageJ |
| Long working distance water immersion objective | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Sample slicing |
| Workstation | Dell | Precision 7920 | CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
| Primary antibodies | |||
| Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400 |
|
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100 |
| Rabbit anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250 |
| Rabbit anti-RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000 |
|
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
References
- Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction. Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Masland, R. H.
- von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
- Fooks, A. R., et al.
- WHO. WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. , No. 1012 (2018).
- CDC. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services. , (2009).
- Arnold, M. M., et al. Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens. Biotechnic & Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).
- Orbanz, J., Finke, S. Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters. Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).
