Summary
רומן, חיסוני התאמה לניקוי רקמות הרקמה כמו הדמיה 3D האולטימטיבי של איברים הממס נקי לאפשר הדמיה 3D של זיהום המוח וירוס כלבת הסביבה הסלולרית המורכבת שלה. עבה, נוגדן מתויג פרוסות רקמת המוח נעשים שקופים להגדיל את עומק ההדמיה כדי לאפשר ניתוח תלת-ממד על ידי המיקרוסקופיה סריקת לייזר מיקרוסקופ.
Abstract
ההדמיה של תהליכי זיהום ברקמות ובאיברים על ידי immunolabeling היא שיטה מרכזית בביולוגיה זיהום מודרני. היכולת להתבונן וללמוד את ההפצה, tropism, שפע של פתוגנים בתוך רקמות האיברים מספק נתונים מרכזי על פיתוח המחלה והתקדמות. באמצעות שיטות מיקרוסקופ קונבנציונאלי, אימונויניום מוגבל בעיקר לחלקים דקים המתקבלים פרפין-מוטבע או מדגמים קפואים. עם זאת, מישור התמונה 2D מוגבל של סעיפים דקים אלה עשוי להוביל לאובדן מידע חיוני על המבנה המורכב של איבר נגוע ההקשר הסלולר של הזיהום. המודרנית multicolor, חיסוני מכתים לניקוי רקמות הרקמה כעת לספק דרך מהירה יחסית וזולה ללמוד בנפח גדול 3D התמונה ערימות של רקמת איבר נגוע וירוס. על-ידי חשיפת הרקמה לממיסים אורגניים, היא הופכת לשקופה בצורה אופטית. זה תואם את מדדי השבירה של המדגם ובסופו של דבר מוביל לירידה משמעותית של פיזור אור. כך, בשילוב עם מטרות ארוכות בטווח העבודה הפנוי, מקטעי רקמות גדולים עד גודל של 1 מ"מ ניתן לתמונה על ידי מיקרוסקופ מיקרוסקופית לייזר קונפוקלית וקד מקובל (clsm) ברזולוציה גבוהה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להחיל הדמיה עמוקה רקמות לאחר ניקוי רקמות כדי להמחיש התפלגות וירוס כלבת במוח נגוע על מנת ללמוד נושאים כמו פתוגנזה וירוס, התפשטות, tropism, והפלישה neuroinvasion
Introduction
טכניקות היסטולוגיה קונבנציונאלי להסתמך בעיקר על חלקים דקים של רקמות איברים, אשר יכול באופן מטבעו לספק רק התובנות 2D לתוך סביבת 3D מורכבת. למרות שניתן לעשות זאת בעיקרון, שחזור תלת-ממדי ממקטעים דקים סדרתיים מחייב קווים טכניים מסוימים לפריסה ולאחר מכן ביישור סיליקו של התמונות הנרכשים1. יתר על כן, שחזור חלק של כרכים z לאחר חיתוך מיקרוטום הוא קריטי כמו גם ממצאים מכניים וחישוביים יכולים להישאר בגלל רישום התמונה האופטימלי הנגרמת על ידי מטוסי התמונה לא חופפים, וריאציות מכתים, ופיזית , הרס רקמות על ידי. למשל, להב המיקרו-טומה לעומת זאת, חיתוך אופטי טהור של דגימות רקמה עבה שלמים מאפשר רכישה של מטוסי תמונה חופפים (דגימה מראש), ובכך, מקלה על שחזור תלת-ממד. זה, בתורו, מועיל מאוד לניתוח של תהליכים זיהום באוכלוסיות תאים מורכבות (למשל, רשתות נוירואליות בהקשר של התאים גליה המקיפים והחיסונית). עם זאת, מכשולים הטבועה של מקטעי רקמה עבים כוללים פיזור אור חדירה נוגדן מוגבלת לתוך הרקמה. בשנים האחרונות, מגוון של טכניקות פותחה ממוטבת להתגבר על בעיות אלה2,3,4,5,6,7,8 , מיכל בן 10 , מיכל עשור , מיכל בן 11 , מיכל בן 12 , 13. ביסודו של דבר, רקמות היעד הפכו שקופים באופן שקוף על ידי טיפול עם מימית2,3,4,5,6,7 ,8,9 או אורגני מבוסס הממס10,11,12,13 פתרונות. המבוא של 3disco (3disco הדמיה של איברים הממס נקי)11,12 ו udisco העוקבת שלה (3disco האולטימטיבי הדמיה של האיברים הממס נוקה)13 סיפק מהיר יחסית, פשוט, ו זול הכלי עם יכולות סליקה מצוינות. המרכיבים העיקריים של פרוטוקול סליקה הם ממיסים אורגניים טרט-butanol (יפורסם), בנזיל אלכוהול (BA), בנזיל בנזואט (BB), ו diphenyl אתר (dpe). הפיתוח והתוספת של iDISCO (immunolabeling מאופשר 3D הדמיה של איברים הממס נוקה)14, פרוטוקול חיסוני תואם, היוו יתרון נוסף על שיטות קיימות ואיפשר את התיוג העמוק ברקמה של אנטיגנים של עניין, כמו גם אחסון לטווח ארוך של דגימות מוכתם חיסוני. כך, השילוב של iDISCO14 ו udisco13 מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של חלבונים המסומנים נוגדנים בסעיפים רקמות גדולות (עד 1 מ"מ) באמצעות clsm קונבנציונאלי.
שימור מבנה מורכב של איבר בכל שלושת הממדים חשוב במיוחד לרקמת המוח. נוירונים מהווים תת הטרוגנית התאית מאוד עם מורפולוגיות 3D מגוונים מאוד מבוסס על התחזיות הneurite שלהם (נבדק על ידי Masland15). יתרה מזאת, המוח מורכב ממספר תאים ותאי משנה, כל אחד מהם מורכב מאוכלוסיות שונות של תת-משנה ומיחס אליו, כולל תאים גליאל ונוירונים (שנבדקו על ידי פון ברטלד ואח '16). כווירוס נוירוטרופי, וירוס הכלבת (rabv, נבדק על ידי fooks ואח '17) מדביק בעיקר נוירונים, באמצעות מכונות ההובלה שלהם לנסוע בכיוון נסיגה לאורך אקסונים מהאתר העיקרי של זיהום למערכת העצבים המרכזית (cn). הפרוטוקול המתואר כאן (איור 1א) מאפשר זיהוי חיסוני בסיוע ויזואליזציה של התאים הנגועים RABV ו-rabv ב גדול, בערימות תמונה קוהרנטית שהתקבלו מרקמת המוח נגוע. הדבר מאפשר הערכה ברזולוציה גבוהה משוחדת, תלת-ממדית של סביבת הזיהום. זה חל על רקמת המוח ממגוון של מינים, ניתן לבצע מיד לאחר קיבעון או אחרי אחסון לטווח ארוך של דגימות של פאראפורמלדהיד (בתחתית), ומאפשר אחסון והדמיה מחדש של דגימות מוכתם ומנוקה במשך חודשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
שימוש בחומר המוח המאוחסן בארכיון באמצעות RABV. מחקרים ניסיוניים בעלי חיים בהתאמה הוערכו על ידי טיפול בעלי חיים אחראי, השימוש, וועדת האתיקה של משרד המדינה לחקלאות, בטיחות מזון, ודיג ב קלנבורג-מערב פומרניה (LALFF M-V) וקיבל אישור עם הרשאות 7221.3-2.1-002/11 (עכברים) ו-7221.3-1-068/16 (חמוסים). טיפול כללי ושיטות המשמשות בניסויים בבעלי חיים נעשו בהתאם להנחיות המאושרות.
התראה: פרוטוקול זה משתמש בחומרים רעילים ו/או מזיקים שונים, כולל המתנול, מימן (meoh), מי חמצן (H2O2), נתרן אזיד (נאן3), יפורסם, BA, BB, ו dpe. MeOH ו-יפורסם הם דליקים מאוד. הימנע מחשיפה על-ידי לבישת ציוד הגנה אישי מתאים (מעיל מעבדה, כפפות והגנת עיניים) וביצוע ניסויים בתוך מכסה המנוע. לאסוף פסולת בנפרד במיכלים המתאימים ולהיפטר ממנו על פי התקנות המקומיות. וירוס כלבת מסווג כרמת בטיחות ביולוגית (BSL)-2 הפתוגן והוא יכול, לכן, בדרך כלל להיות מטופלים תחת תנאי BSL-2. פעילויות מסוימות, כולל הליכים שעשויים לייצר אירוסולים, לעבוד עם ריכוזי וירוסים גבוהים, או לעבוד עם lyssaviruses הרומן, עשוי לדרוש סיווג BSL-3. מניעה טרום חשיפה מומלצת לעובדים בעלי סיכון גבוה, כולל מטפלים בבעלי חיים ועובדי מעבדה18,19. התייחס לתקנות הרשות המקומיות.
1. קיבוע רקמת המוח והסדר
- לתקן דגימות מוח בנפח מתאים של 4% בתחתית מלוחים באגירה פוספט (PBS [pH 7.4]) עבור לפחות 48 h ב 4 ° צ' (עם יחס רקמות משוער של 1:10 [v/v]).
- לשטוף את דגימות רקמות 3x ב PBS עבור לפחות 30 דקות כל לשטוף ולאחסן אותם 0.02% נאן3/PBS ב 4 ° צ' עד השימוש.
- מקטע את הרקמה לתוך מקטעים בעובי 1 מ"מ באמצעות רטט (קצב הזנת להב: 0.3 – 0.5 מ"מ/s, משרעת: 1 מ"מ, עובי פרוסה: 1,000 μm).
- כדי לשמור על רצף הפרוסה הנכון, אחסן כל אחד מסוגי הרקמה בנפרד בצלחת של לוחית התרבות של התאים המרובים. הוסף 0.02% NaN3/PBS ואחסן את מקטעי הרקמה ב -4 ° צ' עד השימוש.
2. לדוגמה טרום טיפול עם מתנול
הערה: בצע את כל שלבי הדגירה עם תנודה עדינה, ואם לא צוין אחרת, בטמפרטורת החדר. . להגן על הדגימות מהאור הטיפול במדגם משמש את המטרה הכוללת של שיפור הנוגדן והפחתת הרקמה האוטומטית של רקמות על ידי חשיפה MeOH ו-H2O2, בהתאמה14.
- להכין 20% (v/v), 40%, 60%, ו 80% MeOH פתרונות במים מזוקקים. למשל, עבור 20% MeOH, להוסיף 10 מ"ל של 100% MeOH ל 40 mL של מים מזוקקים בספינה מתאימה לאיטום ולערבב על ידי היפוך זה.
- העבירו את הדגימות לכלי בגודל סביר (למשל, 5 מ ל שפופרות תגובה). לדאוג לשימוש בחומרים עמידים כימית כדי ריאגנטים בשימוש בפרוטוקול זה. למשל, שים לב כי בעוד פוליפרופילן מתאים, הפוליסטירן אינו.
הערה: מפרטי עוצמת הקול בפרוטוקול זה מתייחסים ל-5 שפופרות תגובה mL. אם נעשה שימוש בכלי קיבול אחר, התאימו את אמצעי האחסון בהתאם. - מודאת הדגימות ב 4 מ ל של כל ריכוז של הסדרה המוכנה של פתרונות MeOH בסדר עולה עבור 1 h כל אחד.
- מודאת הדגימות 2x עבור 1 h כל אחד טהור (100%) שבילי.
- לצנן את הדגימות עד 4 ° צ' (למשל, במקרר מוגן מעבדה).
- הכנת פתרון הלבנה (5% H2O2 ב meoh) על ידי, למשל, דילול 30% H2O 2 מלאי פתרון ב 1:6 טהור (100%) . והירגע בארבע מעלות צלזיוס
- הסר את 100% MeOH מתוך דגימות קירור ולהוסיף 4 מ ל של פתרון הלבנת מקורר (5% H2O2 ב meoh). המלון משלב בין לילה ב -4 ° c.
- החלף את הפתרון הלבנת עבור 4 מ ל של 80% MeOH ו-דגירה עבור 1 h. המשך להשתמש בסדרה המוכנה של פתרונות MeOH בסדר יורד עבור 1 h כל אחד עד הדגימות כבר מודבטים עבור 1 h ב 4 מ ' של 20% MeOH.
- שטוף את דגימות 1x עבור 1 h עם 4 מ ל של PBS.
3. כתמים חיסוני
הערה: בצע את כל שלבי הדגירה עם תנודה עדינה, ואם לא צוין אחרת, בטמפרטורת החדר. . להגן על הדגימות מהאור כדי למנוע גידול בחיידקים, להוסיף נאן3 לריכוז הסופי של 0.02% לפתרונות בסעיף זה. דגימות רקמות הן חדירות נוספות על ידי טיפול עם דטרגנטים nonionic טריטון X-100 ו רצף 20. סרום רגיל משמש לחסימת כריכת נוגדנים שאינה ספציפית. גליצין והפארין מתווספים להפחתת הרקע האימונוולאבילינג14.
- לשטוף את הדגימות 2x עבור 1 h כל אחד ב 4 מ ל של 0.2% טריטון X-100/PBS.
- הפריית הדגימות עבור 2 ימים ב 37 ° c עם 4 מ ל של 0.2% טריטון X-100/20% DMSO/0.3 M גליצין/PBS.
- לחסום את הקשירה לא ספציפית של נוגדנים על ידי הדגירה של דגימות עבור 2 ימים ב 37 ° c ב 4 מ ל של 0.2% טריטון X-100/10% DMSO/6% סרום רגיל/PBS.
הערה: השימוש בסרום רגיל מאותו מינים הנוגדן המשני הועלה כדי להשיג תוצאות החסימות האידיאליות. - מודדת את הדגימות 2 מ ל של פתרון הנוגדן העיקרי (3% סרום רגיל/5% DMSO/לפטין [PBS-רצף 20 עם הפארין] + נוגדן ראשי/נוגדנים) במשך 5 ימים ב 37 ° c. לרענן את פתרון הנוגדן העיקרי לאחר 2.5 ימים.
- עבור לפטין, ליצור מחדש את מלח הפארין נתרן במים מזוקקים לעשות 10 מ"ג/mL פתרון מניות (לאחסן את הפתרון, מצוטט, ב 4 ° c). הוסף את הפתרון מניות ל 0.2% רצף 20/PBS לריכוז הסופי של 10 μg/mL.
הערה: בחירת דילול הנוגדן הנכון עשוי לדרוש אופטימיזציה. בדרך כלל, ריכוזי אימונוהיסטוכימיה סטנדרטיים הם נקודת התחלה טובה.
- עבור לפטין, ליצור מחדש את מלח הפארין נתרן במים מזוקקים לעשות 10 מ"ג/mL פתרון מניות (לאחסן את הפתרון, מצוטט, ב 4 ° c). הוסף את הפתרון מניות ל 0.2% רצף 20/PBS לריכוז הסופי של 10 μg/mL.
- רוחצים את הדגימות ליום אחד ב-4 מ ל של פטין, החלפת מאגר הכביסה לפחות 4x – 5x במהלך היום והשארת הכביסה הסופית על הלילה.
- מודדת את הדגימות 2 מ ל של פתרון נוגדן משני (3% סרום רגיל/לפטין + נוגדן/נוגדנים משני) עבור 5 ימים ב 37 ° c. לרענן את פתרון הנוגדן המשני לאחר 2.5 ימים.
- לדלל את הנוגדן/נוגדנים משני ב 1:500 בפתרון נוגדן משני (כלומר, 4 μL ב 2 מ ל).
- רוחצים את הדגימות ליום אחד כמתואר בשלב 3.5, ומשאירים את השטיפה הסופית בלילה.
4. מכתים גרעיני
הערה: בצע את כל שלבי הדגירה עם תנודה עדינה, ואם לא צוין אחרת, בטמפרטורת החדר. . להגן על הדגימות מהאור אם אין כתמים גרעיניים נדרש או את הספקטרום עירור/הפליטה של ל-PRO-3 נדרש עבור עירור או זיהוי של fluorophore אחר, לדלג על שלב זה.
- לדלל את הכתם חומצות גרעין ל-PRO-3 ב 1:1000 בשנת לפטין ו-דגירה את דגימות 4 מ ל של פתרון מכתים גרעיני עבור 5 h.
- רוחצים את הדגימות ליום אחד כמתואר בשלב 3.5, ומשאירים את השטיפה הסופית בלילה.
הערה: לאחר הניקוי ניתן לאחסן את הדגימות ב-PBS ב-4 ° צ' עד לניקוי אופטי.
5. ניקוי רקמות
הערה: בצע את כל שלבי הדגירה עם תנודה עדינה, ואם לא צוין אחרת, בטמפרטורת החדר. . להגן על הדגימות מהאור דגימות הרקמה מיובשות בסדרה מדורגת של פתרונות יפורסמו. כאשר החיסוני דורש פתרונות מימית, כל הליכי הצביעת צריך להסתיים לפני ניקוי רקמות. סיווג אופטי והתאמת מדד השבירה מושגת על ידי טיפול עם תערובת של BA, BB, ו DPE. הפתרון סליקה בתוספת עם DL-α-tocopherol כמו נוגד חמצון13.
- הכינו 30% (v/v), 50%, 70%, 80%, 90% ו-96% מפתרונות יפורסם במים מזוקקים. למשל, עבור 30% יפורסם, להוסיף 15 מ ל של 100% יפורסם עד 35 mL של מים מזוקקים בכלי האיטום המתאים ולערבב ידי היפוך.
הערה: יפורסם בנקודת התכה של 25 עד 26 ° c; לכן, הוא נוטה להיות מוצק בטמפרטורת החדר. כדי להכין פתרונות יפורסמו, לחמם את הבקבוק האטום היטב ב 37 ° c בחממה או באמבט מים. - מייבשים את הדגימות עם 4 מ ל של כל ריכוז של הסדרה המוכנה של פתרונות יפורסם בסדר עולה עבור 2 h כל אחד. השאירו את ה-96% יפורסם בלילה.
- מייבשים את הדגימות עוד יותר בטהור (100%) יפורסם במשך 2 שעות
- הכנת ניקוי פתרון BABB-D15.
הערה: BABB-D15 הוא שילוב של BA ו-BB (BABB) אשר מעורבב עם DPE ביחס של x: 1, שבו x מצוין שם הפתרון, במקרה זה 15.- עבור BABB, מערבבים תואר ראשון בשני חלקים ב-BB.
- מערבבים BABB ו DPE ביחס של 15:1.
- הוסף 0.4 vol% DL-α-tocopherol (ויטמין E).
הערה: לדוגמה, עבור 20 מ ל של BABB-D15, לערבב 6.25 mL של BA עם 12.5 mL של BB. להוסיף 1.25 mL של DPE ומוסף אותו עם 0.08 mL של DL-α-tocopherol.
- נקה את הדגימות בניקוי התמיסה עד שהן שקופות באופן שקוף (2 – 6 שעות).
- הדגימות ניתן לאחסן ב 4 ° c ב BABB-D15, מוגן מפני אור, עד הרכבה והדמיה.
6. הרכבה לדוגמה
- באמצעות מדפסת תלת-ממד, הדפס את חדר ההדמיה ואת המכסה (חומר: copolyester [CPE], זרבובית: 0.25 מ"מ, גובה שכבה: 0.06 מ"מ, עובי קיר: 0.88 מ"מ, ספירת קירות: 4, infill: 100%, אין מבנה תמיכה; קובץ STL ניתן למצוא בחומרים המשלימים של פרוטוקול זה).
- הכנס את חדר ההדמיה (איור 2).
- הר שמיכות עגול (קוטר: 30 מ"מ) על חדר ההדמיה עם RTV-1 (חדר אחד-מרכיב-הטמפרטורה-בטמפרטורת המים) סיליקון גומי. מסירים את גומי הסיליקון העודף בעזרת ספוגית כותנה במים ומרפאת לילה.
- הר שמיכות עגול (קוטר: 22 מ"מ) על המכסה עם RTV-1 סיליקון גומי. מסירים את גומי הסיליקון העודף בעזרת מסיר כותנה מים ומרפא למשך הלילה.
- מניחים את המדגם בחדר הדמיה, להוסיף נפח קטן של BABB-D15, ולהוסיף את המכסה. למלא את החדר עם BABB-D15 דרך הים, באמצעות מחט תת-עורית (27 G x 3/4 אינטש [0.40 מ"מ x 20 מ"מ]).
- חבר את החלל ולאטום את חדר ההדמיה עם RTV-1 סיליקון גומי. לרפא לילה בחושך.
7. עיבוד תמונות והדמיה
- להגדיר את רכישת התמונה על ידי בחירת קווי לייזר בהתאמה להתאים fluorophores בשימוש. התאימו את טווחי הזיהוי של כל גלאי כדי למנוע חפיפה בין האותות בין הערוצים.
הערה: טווחי זיהוי למופת עבור אלקסה Fluor 488, אלקסה Fluor 568, ו-PRO-3 הם 500 – 550 ננומטר, 590 – 620 ננומטר, ו 645 – 700 ננומטר, בהתאמה. - בחרו בפרמטרי הרכישה, הגדירו את הגבול העליון והתחתון של מחסנית z, ורכשו את מחסנית התמונה.
הערה: פרמטרים לרכישת מופת הם סריקה רציפה עם גודל פיקסל של 60-90 ננומטר, גודל z-step של 0.5 μm, קו ממוצע של 1, מהירות סריקה של 400 Hz, וגודל חריר של יחידה אוורירית 1. - עבד את מחסנית התמונה באמצעות תוכנת ניתוח התמונה המתאימה (לדוגמה, פיג'י) כדי ליצור הקרנות תלת-ממד או לבצע ניתוחים מעמיקים.
הערה: בשל גודלו הגדול של קבצי התמונה הנרכשים, השימוש בתחנת עבודה הוא בדרך כלל הכרחי.- פתח את קבצי הרכישה או התמונה בפיג (קובץ | פתח | בחר קבצים).
- . אם נשתמש, למשל בחרו או בטלו את הבחירה באפשרויות הרצויות בחלון הדו ' תבניות ביולוגיות '. הצג מחסנית עם היפר-מחסנית. מלבד זאת, לא נחוצים בחירות או קרציות מסוימות. לחץ על אישור.
- אם הקובץ מכיל ערימות תמונות מרובות, בחר את אלה שניתן לנתח ולאשר על-ידי הקשה על אישור.
- בצע תיקון אקונומיקה על-ידי פיצול התמונה הממוזגת לערוצים בודדים (תמונה | צבע | הכלי ערוצים, ולאחר מכן בחר עוד | פצל ערוצים). עבור כל ערוץ, בחר תיקון אקונומיקה (תמונה | כוונן | תיקון אקונומיקה) ובחר יחס פשוט (עוצמת רקע: 0.0).
הערה: במקרים מסוימים, לדוגמה, כאשר אין ריקבון ליניארי של האות או שהאות חלש מדי, היחס הפשוט עלול להיכשל. לחלופין, נסה התאמה מעריכית או דלג על תיקון האקונומיקה. - כוונן את הבהירות והניגודיות עבור כל אחד מהערוצים באמצעות המחוונים (תמונה | כוונן | בהירות | ניגודיות).
- מזג את הערוצים (תמונה | צבע | מיזוג ערוצים), ליצור שילוב (תמונה | צבע | הכלי ערוצים, ולאחר מכן בחר עוד | הפוךללא משולב) והמר אותו לתבנית RGB (תמונה | צבע | הכלי ערוצים, ולאחר מכן בחר עוד | המיר ל-RGB).
- במקרה הצורך, שנה את גודל מחסנית התמונה כדי להקטין את זמן החישוב ואת גודל הקובץ (תמונה | כוונן | גודל, שתי האפשרויות תיקתק בתוספת אינטרפולציה בלבד).
- יצירת הקרנה תלת-ממדית (תמונה | ערימות | פרוייקט תלת-ממדי). בחרו ' נקודת מבריק כשיטת הקרנה ' וקבעו את מרווח הפרוסה כדי להתאים לגודל ה-z של מחסנית התמונה שנרכשה. לאיכות מרבית, קבעו את התוספת של זווית הסיבוב ל- 1 והפעל אינטרפולציה. שנה את הסיבוב הכולל, סף השקיפות והאטימות לפי הצורך.
- במקרה הצורך, הזמן את הניגודיות והבהירות באמצעות המרת ההטלה התלת-ממדית חזרה לתבנית של 8 סיביות (תמונה | סוג | 8 סיביות). השתמש במחוונים המתאימים (תמונה | כוונן | בהירות | ניגודיות) והמרה מפני ערימת התמונות לתבנית RGB כמתואר בשלב 7.3.4.
- שמרו את ההטלה התלת-ממדית. טיף קובץ (תבנית קובץ תמונה) ו. קובץ AVI (תבנית קובץ וידאו).
- פתח את קבצי הרכישה או התמונה בפיג (קובץ | פתח | בחר קבצים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השילוב של iDISCO14 ו udisco13 בשילוב עם clsm ברזולוציה גבוהה מספק תובנות עמוקות לתוך הרזולוציה הטמפורלית ואת הפלסטיות של זיהום rabv של רקמת המוח והקשר הסלולר המקיף.
שימוש חיסוני של ראפופרוטאין (P), שכבות מורכבות של תאים עצביים נגועים יכול להיות דמיינו בחלקים עבים של מוחות העכבר (איור 3). לאחר מכן, התחזיות 3D חלקה של ערימות התמונה הנרכש ניתן לשחזור (איור 3A, B, הלוח הימני; איור אנימציה 1). יש לנקוט טיפול כאשר משתמשים בנוגדנים עיקריים ובנוגדנים משניים כנגד המינים שחומר העוגב מקורו בו. השימוש אנטי עכבר נוגדנים IgG על רקמת המוח העכבר הביא כתמים ברורים של מערכת כלי הדם (איור 3B, הפאנל השמאלי). בגלל ברזולוציה גבוהה ערימות התמונה נרכשים עם, זיהום יכול להיות מוערך עד רמת תא בודד (איור 4), המאפשר הטענות על, למשל, שפע והפצה של אנטיגן בתוך התא (איור 4ג ).
מלבד רקמת מוח העכבר, ניתן להחיל את הפרוטוקול גם על רקמת מוח ממינים אחרים של בעלי חיים (למשל, חמוסים) (איור 5; איור אנימציה 2). מקטעים שנלקחו מתאים שונים של מוח חמוס נגוע חשף מידה שונה של זיהום RABV (איור 5a-D).
כאשר המוח כולל אוכלוסיות משנה רבות ושונות, הבידול בין אוכלוסיות אלה חיונית. ניתן להשתמש בנוגדנים המכוונים נגד סמני תא, הערכת הזהות התאית של תאים נגועים ושכנים. למשל, אסטרוציטים יכול להיות הבדיל באמצעות הביטוי של חלבון חומצי glibrillary (GFAP) (איור 6א, ג; איור אנימציה 3), בעוד neurites יכול להיות מוכתם במיוחד עבור חלבון מיקרוכדורית 2 (MAP2) (איור 6B, D; איור אנימציה 4). במקביל, חלבונים ויראליים, במקרה זה, rabv נוקלאופרוטאין (N), יכול להיות מוכתם כדי להעריך את הקשר בין תאים נגועים לבין האוכלוסייה התאית מודגש.
איור 1 : עיקרון בסיסי וזרימת עבודה של הפרוטוקול. (א) ייצוג גרפי של זרימת העבודה המבוססת על הפרוטוקולים מרייר ואח '14 ו-Pan et al.13. (ב) שתי פרוסות מוחית מופת, אחת לפני (פאנל שמאלי) ואחת אחרי הטיפול עם ממיסים אורגניים (הפאנל הימני). הניקוי הופך את הרקמה לשקופה, כפי שנצפה בטקסט הקריא. הנתח המוח הנקי מוטבע בחדר הדמיה 3D-מודפס (הלוח הימני). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : איור טכני של תא הדמיה מודפס 3D. (א) התפוצץ להציג את הציור של חדר ההדמיה. קווים מקווקווים (נקודה-מקווקו) מדגישים את הרכיבים שיש לטעון זה לזה באמצעות גומי סיליקון RTV-1. הקווים המקווקו מייצגים הוראות להרכבה הבאה של התא. (ב) CAD (עיצוב בעזרת מחשב) הקובץ של חדר ההדמיה. . המתאים הקובץ STL כדי להדפיס את חדר ההדמיה ניתן למצוא את החומרים המשלימים. (ג) חדר הדמיה מורכב במלואו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : רקמות עמוקות הדמיה של רקמת מוח העכבר הנגוע RABV. (A ו- B) עכברים נדבקו עם וירוס רחוב רקומביננטי פנינו. RABV צביעת P (ירוק) חושף שכבות עצבי מזוהם עם גדול, מסובכת neurite תחזיות בתוך רקמת המוח נקי. גרעינים היו מוכתמים נגד-PRO-3 (כחול). (ב) השימוש fluorophore מתויג אנטי עכבר נוגדנים משניים (אדום) על רקמת העכבר תוצאות תיוג ברורים של מערכת כלי הדם. שחזור תלת-ממד של ערימות התמונה הנרכש מאפשר התבוננות מזוויות צפייה שונות (A ו- B, ימין לוחות). קנה מידה ברים = 60 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : רכישת תמונות ברזולוציה גבוהה מאפשרת הערכות מורכבות עד לרמה של תא בודד. המוח היה גזור העכבר הנגוע עצוב L16. (A) מכתים כתמים (ירוק) מדגיש תא העצב נגוע בנפרד. (B ו- C) פירוט התמונות והתחזיות מדגימים כי ניתן לבצע ניתוחים מעמיקים של שפע אנטיגן, הפצה ולוקליזציה. גרעינים היו מוכתמים נגד-PRO-3 (כחול). קנה מידה ברים = 20 יקרומטר (A), 5 יקרומטר (ג). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5 : רקמות עמוק הדמיה של רקמת המוח הנגועה RABV. . חמוסים נפגעו מרחוב הכלבים (A–D) פרוסות מאזורים מסוימים של המוח נלקחו, החיסונית של RABV P (ירוק), ומנוקה בצורה אופטית. תחזיות להפגין כי התאים הנגועים בחלקים שונים של המוח שונים בכמות ומורפולוגיה. יתרה מזאת, הם מדגישים את תחולתה של הפרוטוקול לרקמות האחרות מאשר העכבר נגזר. גרעינים היו מוכתמים נגד-PRO-3 (כחול). קנה מידה ברים = 60 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6 : האימונולונציה רב צבעי מאפשר כתמים של סמנים סלולריים. רקמת המוח פרוסות מן חמוסים נגועים עם הכלב RABV שימשו והוא מוכתם עבור RABV N (אדום) ו או (A ו C) gfap (ירוק) או (ב ו D) MAP2 (ירוק). ואילו gfap הוא סמן אסטרוציט, MAP2 מדגיש במיוחד neurites. גרעינים היו מוכתמים נגד-PRO-3 (כחול). (C ו -D) בחלק התחתון, מתוארים שיחלי פרוסה אחת של תצוגות הפירוט הממוספרות מהתחזיות הממוזגות. סולם ברים = 15 יקרומטר (A ו- B) 10 יקרומטר (C ו -D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור אנימציה 1:3D שחזורים והתחזיות פירוט של ערימות תמונה מהמוח הנגוע RABV. התחזיות נוצרו מערימות התמונה שתוארו באיור 3. (A ו C) אנימציות של כל z-ערימות בהתאמה. (ב) הקרנה מפורטת של שחזור תלת-ממדי של חלק מערימת z של האזורים המסומנים בתחילת הווידאו. (ד) הקרנה מפורטת של tomogram של חלק מערימת z של האזורים המסומנים בתחילת הסרטון. ירוק = RABV P; אדום = IgG העכבר; כחול = גרעינים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
איור אנימציה 2:3D השחזורים של ערימות תמונה שנרכשו מהמוח של החמוס שנפגע RABV. התחזיות נוצרו מערימות התמונה שתוארו באיור 5. (A–D) הביאורים מתייחסים לאותה דמות ומתארים את החלקים המתאימים של המוח שממנו נלקחו הפרוסות. ירוק = RABV P; כחול = גרעינים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
איור אנימציה 3: הקרנה הדרגתית של הערוצים השונים של שחזור תלת-ממד של המוח המוכתם המזוהם של rabv מוכתם עם סמן מרקר אסטרוציט. התחזיות נוצרו מערימת התמונה המתוארת באיור 6א. התוספת הדרגתית של ערוצים מתחיל עם RABV N (אדום), לאחר הפעל את גרעיני התא (כחול) ו, לבסוף, GFAP (ירוק), בעוד החיסור הראשון מסיר RABV N, לאחר מכן את גרעיני התא, ובסופו של דבר GFAP. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
איור אנימציה 4: הקרנה הדרגתית של ערוצים שונים של שחזור תלת-ממד של המוח מושפע RABV מוכתם עם סמן עצבי MAP2. התחזיות נוצרו מערימת התמונה המתוארת באיור 6ב. התוספת הדרגתית של ערוצים מתחיל ב-RABV N (אדום), לאחר הפעל את גרעיני התא (כחול) ו, לבסוף, MAP2 (ירוק), בעוד החיסור הראשון מסיר את RABV N, לאחר מכן את גרעיני התא, ובסופו של דבר MAP2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התחייה ופיתוח נוסף של טכניקות ניקוי רקמות בשנים האחרונות2,3,4,5,6,7,8 , מיכל בן 10 , מיכל עשור , מיכל בן 11 , מיכל בן 12 , מיכל בן 13 , 14 נפתחו אפשרויות חדשות רבות להשגת ערימות תמונה בנפח גבוה של רקמת איברים. זה סיפק כלי ללא תחרות ורב עוצמה ללמוד, בין נושאים רבים אחרים, זיהום וירוס. שחזור תלת-ממד הבא של ערימות התמונה הללו מאפשר הטענות מתוחכמות, למשל, וירוס tropism, שפע, ומהלך הזמן של זיהום. פרוטוקול זה מתאר את ההדמיה בסיוע החיסונית של זיהום RABV ברקמת המוח נקי ממס.
קיימים מספר שלבים קריטיים בהכנה וברכישה של ערימות התמונה של הרקמה החיסונית. חשיפה ממושכת לכרכית יכולה להיות מסכה אפיכסקופים, ולכן התוצאה היא הפחתה בפחת של20,21,22. לפיכך, חשוב להגביל את זמני הקיבוע למינימום ההכרחי ולהעביר את הדגימות לפתרון המתאים (לדוגמה, PBS בתוספת 0.02% NaN3 לאחסון לטווח ארוך). עם זאת, כל הדימויים והתחזיות שסופקו כאן נרכשו מדגימות המוח המאוחסנות בארכיון, שחלקן אוחסנו בתחתית במשך שבועות, והדגש את תחולתה של הטכניקה לחומר העוגב שנחשף ל לחצי הדרך ל פרקי זמן ארוכים. תוצאות דומות הוכחו לדגימות המוח האנושי13. אחר, אם לא הכי, הצעד הקריטי הוא הדגירה של נוגדנים. ריכוזי נוגדנים צריכים להיבחר בזהירות. בעוד ברוב המקרים, ריכוזי IHC סטנדרטיים הם נקודת התחלה טובה לתיוג נוגדנים ברקמות עמוק, אנטיגנים מסוימים עשויים לדרוש אופטימיזציה נוספת של ריכוז הנוגדן. פרוטוקול זה ממחיש כי גם RABV N ו-P מדגים בקלות על ידי נוגדנים משומשים. בעוד MeOH טיפול מקדים בדרך כלל משפר את האימונואולבלינג, כמה אנטיגנים אינם תואמים את הטיפול הזה. עבור אלה, Renier ועמיתיו14 סיפק הטיפול האלטרנטיבי meoh-חינם לדוגמה. ניתוח ערימות התמונות הנרכשים דורש עוצמה חישובית מספקת. בשל גודל הקבצים הגדול של עד מספר ג'יגה-בתים למחסנית, יש צורך במחשבים רבי-עוצמה כדי לעבד את התמונות. Postprocessing כולל לעתים קרובות את החיסור של רעש הרקע תיקון אקונומיקה כדי לפצות על הרכישה-הקשורים הלבנת אפקטים. כאשר מדידת מרחקים, יש לזכור כי, כתופעת לוואי, הרקמה מתכווצת בתהליך הניקוי.
בהשוואה לפלטפורמות מיקרוסקופיה אחרות, כגון מיקרוסקופ מיקרופלורייט בגיליון אור (LFM) או שני פוטון בלייזר (2PLSM), CLSM יש את מרחק העבודה המוגבל ביותר. לכן, זה הכרחי כדי לעבור את האיברים של כינים 1 מ"מ עובי עבור הדמיה. בנוסף, CLSM יש את מהירות הרכישה האיטית ביותר בגלל הרזולוציה הגבוהה שלה הדמיה. השימוש במיקרוסקופ גיליון אור יאפשר הדמיה מהירה יותר של כמויות גדולות עד הדמיה מוחית שלמה, במקביל להקריב את רזולוציית התמונה. מגבלה נוספת היא העלייה הטבועה של הרקמה האוטומטית של רקמות עם הפחתת אורך הגל. זה מעבד את השימוש fluorophores וצבעים נרגש על ידי קו הלייזר ב 405 ננומטר, כולל צבע Hoechst, לא מעשי בלתי אפשרי.
ביחס שיטות אחרות לניקוי רקמות, היברידית של iDISCO14 ו udisco13 משלבת את התכונות החיוביות ביותר: הוא תואם מאוד עם כתמים חיסוני, תכליתי מאוד, יחסית מהיר וזול, יש מעולה יכולות סליקה, וזה אפשרי עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקד סטנדרטי. יתר על כן, פרוטוקול זה אינו מוגבל להכתמים וניקוי של רקמת המוח, אך ניתן גם להחיל על מגוון של רקמות רכות אחרות פתוגנים, הן נוירופולשנית ולא נוירופולשנית. לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן מייצג צינור לדימות תלת-ממד ברזולוציה גבוהה של רקמת המוח הנגועה RABV. 3D שחזורים של רקמת המוח נגוע יכול לשמש כדי לענות על מגוון רחב של שאלות בנוגע התקדמות המחלה RABV, פתוגנזה, והפלישה neuroinvasion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים מודים לתומס סי מטנלייטר ולוורנה טה קמפ על שקראו באורח קשה את כתב היד. עבודה זו היתה נתמכת על ידי יוזמת מצוינות פדרלית של קלנבורג מערב פומרניה והקרן החברתית האירופית (esf) מענק ko kt (esf/14-BM-A55-0002/16) ו מענק מחקר משותף בקיר על lyssaviruses ב פרידריך-לופלר-מכון (Ri-0372).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Clearing reagent |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Clearing reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Various buffers |
| Diphenyl ether | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Clearing reagent |
| DL-α-Tocopherol | Alfa Aesar | A17039 | Antioxidant |
| Donkey serum | Bio-Rad | C06SBZ | Blocking reagent |
| Glycine | Carl Roth | 3908.2 | Background reduction |
| Goat serum | Merck | S26-100ML | Blocking reagent |
| Heparin sodium salt | Carl Roth | 7692.1 | Background reduction |
| Hydrogen peroxide solution (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sample bleaching |
| Methanol | Carl Roth | 4627.4 | Sample pretreatment |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | Crystalline powder to make fixative solution |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | Prevention of microbial growth in stock solutions |
| tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Sample dehydration for tissue clearing |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Nucleic acid stain |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detergent |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Detergent |
| Miscellaneous | |||
| 5 mL reaction tubes | Eppendorf | 0030119401 | Sample tubes |
| Coverslip, circular (diameter: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Part of imaging chamber |
| Coverslip, circular (diameter: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Part of imaging chamber |
| Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Filling of the imaging chamber with clearing solution |
| RTV-1 silicone rubber | Wacker | Elastosil E43 | Adhesive for the assembly of the imaging chamber |
| Ultimaker CPE 2.85 mm transparent | Ultimaker | 8718836374869 | Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber |
| Technical equipment and software | |||
| 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Printing of imaging chamber |
| Automated water immersion system | Leica | 15640019 | Software-controlled water pump |
| Benchtop orbital shaker | Elmi | DOS-20M | Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm) |
| Benchtop orbital shaker, heated | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Inverted confocal microscope for sample imaging |
| Fiji | NIH (ImageJ) | open source software (v1.52h) | Image processing package based on ImageJ |
| Long working distance water immersion objective | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Sample slicing |
| Workstation | Dell | Precision 7920 | CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
| Primary antibodies | |||
| Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400 |
|
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100 |
| Rabbit anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250 |
| Rabbit anti-RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000 |
|
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
References
- Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction. Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Masland, R. H.
- von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
- Fooks, A. R., et al.
- WHO. WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. , No. 1012 (2018).
- CDC. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services. , (2009).
- Arnold, M. M., et al. Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens. Biotechnic & Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).
- Orbanz, J., Finke, S. Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters. Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).
