Imágenes 3D de alta resolución de la infección por el virus de la rabia en el tejido cerebral con disolventes

Resumen

Las nuevas técnicas de limpieza de tejidos compatibles con la inmunomancha, como la imagen 3D definitiva de órganos con disolventes, permiten la visualización 3D de la infección cerebral del virus de la rabia y su complejo entorno celular. Las rebanadas gruesas de tejido cerebral con etiqueta de anticuerpos se hacen ópticamente transparentes para aumentar la profundidad de la imagen y permitir el análisis 3D mediante microscopía de escaneo láser confocal.

Resumen

La visualización de los procesos de infección en tejidos y órganos mediante inmunoetiquetado es un método clave en la biología moderna de la infección. La capacidad de observar y estudiar la distribución, el tropismo y la abundancia de patógenos dentro de los tejidos de órganos proporciona datos fundamentales sobre el desarrollo y la progresión de la enfermedad. Mediante métodos de microscopía convencionales, el inmunoetiquetado se limita principalmente a secciones delgadas obtenidas de muestras congeladas o incrustadas en parafina. Sin embargo, el plano de imagen 2D limitado de estas secciones delgadas puede conducir a la pérdida de información crucial sobre la estructura compleja de un órgano infectado y el contexto celular de la infección. Las modernas técnicas multicolores y compatibles con la inmunomancha ahora proporcionan una manera relativamente rápida y económica de estudiar pilas de imágenes 3D de gran volumen de tejido orgánico infectado por virus. Al exponer el tejido a disolventes orgánicos, se vuelve ópticamente transparente. Esto coincide con los índices de refracción de la muestra y, finalmente, conduce a una reducción significativa de la dispersión de la luz. Por lo tanto, en combinación con objetivos de larga distancia de trabajo libre, grandes secciones de tejido de hasta 1 mm de tamaño se pueden tomar imágenes mediante microscopía de escaneo láser confocal convencional (CLSM) a alta resolución. Aquí, describimos un protocolo para aplicar imágenes de tejido profundo después de la limpieza del tejido para visualizar la distribución del virus de la rabia en cerebros infectados con el fin de estudiar temas como la patogénesis del virus, la propagación, el tropismo y la neuroinvasión.

Introducción

Las técnicas de histología convencionales se basan principalmente en secciones delgadas de tejidos de órganos, que pueden proporcionar intrínsecamente sólo información 2D en un entorno 3D complejo. Aunque es factible en principio, la reconstrucción 3D a partir de secciones delgadas en serie requiere tuberías técnicas exigentes tanto para el corte como para posteriores en la alineación de silico de las imágenes adquiridas¹. Además, la reconstrucción sin fisuras de los volúmenes z después del corte del microtomo es fundamental, ya que los artefactos mecánicos y computacionales pueden permanecer debido al registro de imágenes subóptimo causado por....

Protocolo

Se utilizó material cerebral archivado fijado por la PFA infectado por RABV. Los respectivos estudios experimentales en animales fueron evaluados por el comité responsable de cuidado, uso y ética de los animales de la Oficina Estatal de Agricultura, Seguridad Alimentaria y Pesca en Mecklemburgo-Pomerania Occidental (LALFF M-V) y obtuvieron la aprobación con permisos 7221.3-2.1-002/11 (ratones) y 7221.3-1-068/16 (ferrets). Los cuidados generales y los métodos utilizados en los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices aprobadas.

ADVERTENCIA: Este protocolo utiliza diversas sustancias tóxicas y/o nocivas, inc....

Resultados

La combinación de iDISCO¹⁴ y uDISCO¹³ junto con CLSM de alta resolución proporciona una visión profunda de la resolución espaciotemporal y la plasticidad de la infección RABV del tejido cerebral y el contexto celular circundante.

Mediante la inmunoutilización de la fosfoproteína RABV (P), se pueden visualizar capas complejas de células neuronales infectadas en secciones gruesas del cerebro del ratón (Figura3). Poster.......

Discusión

El resurgimiento y desarrollo de técnicas de limpieza de tejidos en los últimos años^{2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13}

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
bencílico	fuerte Alfa Aesar	41218	Reactivo
aclarado Benzoato de bencilo	Sigma-Aldrich	BB6630-500ML	Reactivo de aclarante
Dimetilsulfóxido Carl	Roth	4720.2	Varios tampones Éter de
difenilo	Sigma-Aldrich	240834-100G	Reactivo de aclarado
DL-α-Tocoferol	Alfa Aesar	A17039	Suero antioxidante
burro	Bio-Rad	C06SBZ	Reactivo bloqueador
Glicina	Carl Roth	3908.2	Reducción de fondo
Suero de cabra	Merck	S26-100ML	Reactivo bloqueador
Heparina sal de sodio	Carl Roth	7692.1	Antecedentes reducción
Solución de peróxido de hidrógeno (30 %)	Carl Roth	8070.2	Blanqueo de muestras
Metanol	Carl Roth	4627.4	Pretratamiento
de muestras Paraformaldehído	Carl Roth	0335.3	Polvo cristalino para hacer solución fijadora
Azida de sodio	Carl Roth	K305.1	Prevención del crecimiento microbiano en soluciones madre
tert-Butanol	Alfa Aesar	33278	Deshidratación de muestras para la limpieza de tejidos
TO-PRO-3	Thermo Fisher	T3605	Tinción de ácido nucleico
Triton X-100	Carl Roth	3051.2	Detergente
Tween 20	AppliChem	A4974,0500	Detergente
Miscelánea
5 mL de reacción tubos	Eppendorf	0030119401	Tubos de muestra
Cubreobjetos, circular (diámetro: 22 mm)	Marienfeld	0111620	Parte de la cámara de imagen
Cobertor, circular (diámetro: 30 mm)	Marienfeld	0111700	Parte de la cámara de imagen
Aguja hipodérmica (27 G x & frac34; ” [0,40 mm x 20 mm])	B. Braun	4657705	Llenado de la cámara de imagen con solución de limpieza
RTV-1 caucho de silicona Wacker		Elastosil E43	Adhesivo para el montaje de la cámara de imagen
Ultimaker CPE 2,85 mm transparente	Ultimaker	8718836374869	filamento de copoliéster para impresora 3D para imprimir partes de la cámara de imagen
equipo técnico y software
Impresora 3D	Ultimaker	Ultimaker 2+	Impresión de la cámara de imagen Sistema automatizado
de inmersión en agua	Leica	15640019	Bomba de agua controlada por software
Agitador orbital de sobremesa	Elmi	DOS-20M	Incubación de muestras a temperatura ambiente (~ 150 rpm)Agitador
orbital de sobremesa, calefactado	New Brunswick Scientific	G24 Agitador ambiental	Incubación de muestras a 37 ° C (~ 150 rpm)
Microscopio de barrido láser confocal	Leica	DMI 6000 TCS SP5	Microscopio confocal invertido para la adquisición de imágenes
de muestras Fiji	NIH (ImageJ)	software de código abierto (v1.52h)	Paquete de procesamiento de imágenes basado en ImageJ
Objetivo de inmersión en agua de larga distancia de trabajo	Leica 15506360		HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2
Vibratome	Leica VT1200S		Estación de
trabajo	Dell	Precision 7920	CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB
strong>Primary antibodies
Goat anti-RABV N	Friedrich-Loeffler-Institut		Suero policlonal monoespecífico anti-RABV N de cabra, generado por inmunización de cabra con nucleoproteína N de RABV expresada por baculovirus y purificada con His-tag Dilución: 1:400
anti-GFAP	Dako	Z0334	(RRID:AB_10013382) Dilución: 1:100
anti-MAP2 de conejo	Abcam	ab32454	(RRID:AB_776174) Dilución: 1:250
Anti-RABV de conejo P 160-5	Friedrich-Loeffler-Institut		Suero policlonal monoespecífico de conejo anti-RABV P, generado por inmunización de conejos con fosfoproteína P RABV expresada por baculovirus y purificada con His-tag (ver referencia 23: Orbanz et al., 2010) Dilución: 1:1.000
anticuerpos secundarios
		conjugados fluoróforo	Altamente absorbido cruzado Dilución: 1:500
Burro anti-ratón IgG	Thermo Fisher Scientific	en función del fluoróforo conjugado	Alta absorción cruzada Dilución: 1:500
Burro anti-conejo IgG	Thermo Fisher Scientific	en función del fluoróforo conjugado	Altamente absorbido cruzado Dilución: 1:500
Cabra anti-ratón IgG	Thermo Fisher Científico	en función del fluoróforo conjugado	Alta absorción cruzada Dilución: 1:500
IgG anti-conejo de cabra	Thermo Fisher Scientific	en función del fluoróforo conjugado	Alta absorción cruzada Dilución: 1:500

de de : <Anticuerpo policlonal de conejo Anticuerpo policlonalburro anti-cabra IgG Thermo Fisher Scientific en función de