Summary
溶媒除去された器官の究極の3Dイメージングのような新しい、免疫染色互換組織クリアリング技術は、狂犬病ウイルス脳感染症とその複雑な細胞環境の3D可視化を可能にします。厚い、抗体標識された脳組織スライスは、画像深さを高め、共焦点レーザー走査顕微鏡による3D解析を可能にするために光学的に透明に作られています。
Abstract
免疫標識による組織や臓器の感染過程の可視化は、現代の感染生物学における重要な方法である。臓器組織内の病原体の分布、栄養学、および豊富さを観察し、研究する能力は、疾患の発症と進行に関する重要なデータを提供します。従来の顕微鏡検査法を用いて、免疫標識は、パラフィン埋め込みまたは凍結サンプルから得られる薄いセクションに主に制限される。しかし、これらの薄い部分の限られた2D画像面は、感染した器官の複雑な構造および感染の細胞コンテキストに関する重要な情報の喪失につながる可能性がある。現代の多色、免疫染色互換組織クリアリング技術は、ウイルスに感染した臓器組織の大量の3D画像スタックを研究するための比較的高速かつ安価な方法を提供します。組織を有機溶媒にさらすことで、光学的に透明になります。これはサンプルの屈折率指数と一致し、最終的には光散乱の大幅な減少につながります。従って、長い自由な働く間隔の目的と組み合わせて、サイズの1 mmまでの大きいティッシュセクションは高リゾリューションの慣習的な共焦点レーザースキャン顕微鏡(CLSM)によってイメージ化することができる。ここでは、ウイルス病因、広がり、トロピズム、神経侵襲などのトピックを研究するために、感染した脳における狂犬病ウイルス分布を可視化するために、組織クリア後に深部組織イメージングを適用するプロトコルについて説明する。
Introduction
従来の組織学の技術は、主に複雑な3D環境に2D洞察しか提供できない臓器組織の薄い部分に依存しています。原理的には実現可能ですが、シリアルシンセクションからの3D再構成は、取得した画像1のシリコアライメントのスライスおよびその後の両方に対して、厳しい技術的パイプラインを必要とします。さらに、マイクロトームスライス後のZボリュームのシームレスな再構成は、非重なり合う画像平面、染色バリエーション、物理的な画像登録によって引き起こされる最適でない画像登録のために、機械的および計算的なアーティファクトの両方が残る可能性があるため、重要です。例えば、マイクロトームブレードによる組織の破壊。対照的に、無傷の厚い組織サンプルの純粋な光学スライスは重なり合うイメージ平面の獲得(オーバーサンプリング)を可能にし、それによって、3D再建を促進する。これは、複雑な細胞集団(例えば、周囲のグリア細胞および免疫細胞の文脈における神経ネットワーク)における感染プロセスの分析に非常に有益である。しかしながら、厚い組織切片の固有の障害は、組織への光散乱および限られた抗体の浸透を含む。近年、これらの問題を克服するために様々な技術が開発され、最適化されています2,3,4,5,6,7,8,9,10歳,11歳,12歳,13.本質的に、標的組織は、水性2、3、4、5、6、7のいずれかの治療によって光学的に透明に変わる 、8、9または有機溶媒ベースの10、11、12、13溶液。3DISCO(溶媒クリア臓器の3Dイメージング)11、12およびその後継uDISCO(溶媒クリア臓器の究極の3Dイメージング)13の導入は、比較的高速でシンプルで安価なツールを提供しました。優秀なクリアリング機能。クリアリングプロトコルの主な構成要素は、有機溶媒テルトブタノール(TBA)、ベンジルアルコール(BA)、ベンジル安息香酸ベンゾエート(BB)、およびジフェニルエーテル(DPE)です。iDISCO(溶媒クリア臓器の免疫標識可能な3Dイメージング)14の開発と添加は、互換性のある免疫染色プロトコルであり、既存の方法に対する別の利点を構成し、抗原の深部組織標識を可能にした関心のあるだけでなく、免疫染色サンプルの長期保存。したがって、iDISCO14とuDISCO13の組み合わせは、従来のCLSMを使用して、大きな組織切片(最大1mm)における抗体標識タンパク質の高解像度イメージングを可能にします。
すべての次元で臓器の複雑な構造の保存は、脳組織のために特に重要です。ニューロンは、その神経突起に基づいて非常に多様な3D形態を有する非常に不均一な細胞サブ集団を含む(マスランド15によってレビュー)。さらに、脳は多数のコンパートメントおよびサブコンパートメントから構成され、それぞれがグリア細胞およびニューロンを含む異なる細胞細胞亜集団およびその比率で構成される(von Bartheld et al.16によるレビュー)。神経型ウイルスとして、狂犬病ウイルス(RABV、Fooks et al.17によってレビュー)は、主にニューロンに感染し、その輸送機械を使用して、感染の一次部位から中枢神経系(CNS)に軸方向に沿って移動する。ここで説明するプロトコル(図1A)は、感染した脳組織から得られる大きな一貫性のある画像スタックにおけるRABVおよびRABV感染細胞の免疫染色支援検出および可視化を可能にする。これにより、感染環境の公平な3D高解像度評価が可能になります。これは、様々な種からの脳組織に適用可能であり、固定後、またはパラホルムアルデヒド(PFA)中のサンプルの長期保存後に行うことができ、数ヶ月間染色およびクリアされたサンプルの保存および再画像化を可能にする。
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Protocol
RABV感染、PFA固定アーカイブ脳材料が使用された。それぞれの動物実験研究は、メクレンブルク西部ポメラニア(LALFF M-V)の農業、食品安全、漁業のための国家オフィスの責任ある動物のケア、使用、倫理委員会によって評価され、許可を得て承認を得ました。7221.3-2.1-002/11 (マウス) および 7221.3-1-068/16 (フェレット)。動物実験で使用される一般的なケアおよび方法は、承認されたガイドラインに従って行われた。
注意:このプロトコルは、PFA、メタノール(MeOH)、過酸化水素(H2 O2)、アジ化ナトリウム(NaN3)、TBA、BA、BB、およびDPEを含む様々な有毒および/または有害物質を使用しています。MeOHおよびTBAは非常に可燃性である。適切な個人用保護具(ラボコート、手袋、目の保護具)を着用し、ヒュームフードで実験を行うことで、暴露を避けてください。適切な容器に別途廃棄物を回収し、現地の規制に従って処分します。狂犬病ウイルスは、バイオセーフティレベル(BSL)-2病原体として分類され、したがって、一般的にBSL-2条件下で処理することができます。エアロゾルを生成する手順、高いウイルス濃度で作業する手順、または新しいリッサウイルスを使用する手順を含むいくつかの活動は、BSL-3分類を必要とする場合があります。暴露前予防は、動物の世話人や実験室の労働者を含むリスクの高い人員に推奨されます18,19.地方自治体の規制を参照してください。
1. 脳組織の固定と断面
- リン酸緩衝生理食べ物(PBS[pH 7.4])で4%のPFAの適切な体積で脳サンプルを4°Cで48時間(概算組織対固定比1:10[v/v])で固定します。
- 組織サンプルをPBSで3倍に洗い、各洗浄で少なくとも30分間洗浄し、使用するまで4°Cで0.02%NaN3/PBSに保存します。
- ビブレーターを使用して組織を1mm厚のセクションに切り分けます(ブレードフィードレート:0.3~0.5mm/s、振幅:1mm、スライス厚さ:1,000μm)。
- 正しいスライス配列を保持するには、各組織部をマルチウェル細胞培養プレートのウェルに別々に保存します。0.02% NaN3/PBS を追加し、使用するまで 4 °C で組織セクションを格納します。
2. メタノールによるサンプル前処理
注:穏やかな振動ですべてのインキュベーションステップを実行し、そうでなければ、室温で示されていない場合。サンプルを光から保護します。サンプル前処理は、MeOHおよびH2O2への曝露による抗体拡散を改善し、組織の自己蛍光を減少させる全体的な目的を果たし、それぞれ14。
- 蒸留水に20%(v/v)、40%、60%、80%のMeOH溶液を準備します。例えば、20%MeOHの場合は、適切なシール可能な容器に蒸留水の40 mLに100%MeOHの10mLを追加し、それを反転して混合します。
- サンプルを合理的な大きさの容器(例えば、5mL反応管)に移す。このプロトコルで使用される試薬に対して化学的に耐性のある材料を使用するように注意してください。例えば、ポリプロピレンは適しているが、ポリスチレンは適していないことに注意してください。
注:このプロトコルの体積仕様は、5 mL反応管を参照してください。別の容器を使用する場合は、それに応じて音量を調整します。 - 調製された一連のMeOH溶液の各濃度の4mLでサンプルを1時間の昇順でインキュベートする。
- サンプルを純粋な(100%)でそれぞれ1時間2xインキュベートするメタノール。
- サンプルを4°C(例えば、実験室で安全な冷蔵庫で)冷却します。
- 漂白液(MeOHで5%H2O2)を調剤し、例えば、純度(100%)で1:6で30%H2O2ストック溶液を希釈するMeOH、4°Cで冷やします。
- 冷蔵サンプルから100%MeOHを取り出し、4mLのチルド漂白液(MeOHではH2O2)を添加します。4°Cで一晩インキュベートします。
- 漂白液を80%MeOHの4mLと交換し、1時間インキュベートし、20%MeOHの4mLでサンプルが1時間インキュベートされるまで、各1時間の降下順序で調製された一連のMeOH溶液を使用し続けます。
- サンプルを1時間1xで洗浄し、4 mLのPBSで洗浄します。
3. 免疫染色
注:穏やかな振動ですべてのインキュベーションステップを実行し、そうでなければ、室温で示されていない場合。サンプルを光から保護します。微生物の増殖を防ぐために、このセクションの溶液に0.02%の最終濃度にNaN3を追加します。組織試料は、非イオン性洗剤トリトンX-100および第二性20による処理によりさらに透過化される。正常な血清は、非特異的抗体結合をブロックするために使用される。グリシンおよびヘパリンは、免疫標識の背景14を減少させるために添加される。
- 0.2%トリトンX-100/PBSの4 mLでサンプルを1時間2x洗浄します。
- 0.2%トリトンX-100/20%DMSO/0.3 Mグリシン/PBSの4 mLで37°Cで2日間サンプルを透過化します。
- 0.2% トリトン X-100/10% DMSO/6% 正常な血清/PBS の 4 mL で 37 °C で 2 日間サンプルをインキュベートすることにより、抗体の非特異的結合をブロックします。
注:理想的なブロッキング結果を達成するために二次抗体が上げられた同じ種からの正常な血清を使用する。 - 一次抗体溶液の2mL(3%正常血清/5%DMSO/PTwH[ヘパリン付きPBS-Tween 20]+一次抗体/抗体)で5日間37°Cでサンプルをインキュベートします。2.5日後に一次抗体溶液をリフレッシュします。
- PTwHの場合、蒸留水中のヘパリンナトリウム塩を再構成し、10mg/mLのストック溶液を作ります(この溶液を保存し、アリクォートし、4°C)。ストック溶液を0.2%のツイエン20/PBSに10 μg/mLの最終濃度に加えます。
注:正しい抗体希釈を選択するには、最適化が必要な場合があります。一般に、標準的な免疫組織化学濃度は良い出発点です。
- PTwHの場合、蒸留水中のヘパリンナトリウム塩を再構成し、10mg/mLのストック溶液を作ります(この溶液を保存し、アリクォートし、4°C)。ストック溶液を0.2%のツイエン20/PBSに10 μg/mLの最終濃度に加えます。
- PTwHの4mLで1日サンプルを洗浄し、一日の間に少なくとも4x-5xの洗浄バッファーを交換し、一晩で最終的な洗浄を残します。
- 2mLの二次抗体溶液(3%正常血清/PTwH+二次抗体/抗体)でサンプルを37°Cで5日間インキュベートします。2.5日後に二次抗体溶液をリフレッシュします。
- 二次抗体/抗体を二次抗体溶液中で1:500で希釈する(すなわち、2mLで4μL)。
- ステップ3.5に記載されているように1日間サンプルを洗浄し、一晩で最終洗浄を残します。
4. 核染色
注:穏やかな振動ですべてのインキュベーションステップを実行し、そうでなければ、室温で示されていない場合。サンプルを光から保護します。核染色が不要な場合、またはTO-PRO-3の励起波長/発光スペクトルが別の蛍光色素の励起または検出に必要な場合は、この手順をスキップします。
- PTwHで1:1,000の核酸染色TO-PRO-3を希釈し、5時間核染色溶液の4mLでサンプルをインキュベートします。
- ステップ3.5に記載されているように1日間サンプルを洗浄し、一晩で最終洗浄を残します。
注:洗浄後、サンプルは光学クリアリングまで4°CでPBSに保存することができます。
5. 組織クリア
注:穏やかな振動ですべてのインキュベーションステップを実行し、そうでなければ、室温で示されていない場合。サンプルを光から保護します。組織サンプルはTBAの等級シリーズで脱水される。免疫染色には水溶液が必要なため、組織の除去前にすべての染色手順を完了する必要があります。光学クリアランスと屈折率の一致は、BA、BB、およびDPEの混合物による処理によって達成される。クリアリング溶液は、抗酸化剤13としてDL−α-トコフェロールを補充する。
- 蒸留水に30%(v/v)、50%、70%、80%、90%、96%のTBA溶液を調剤します。例えば、30%TBAの場合、適切なシール可能な容器に蒸留水の35 mLに100%TBAの15 mLを追加し、反転して混合します。
注:TBAは25-26 °Cの融点を有する;したがって、室温で固体になる傾向があります。TBA溶液を調製するために、密封されたボトルをインキュベーターまたは水浴で37°Cで加熱します。 - 調製された一連のTBA溶液の各濃度の4mLでサンプルを2時間の昇順で脱水します。96% TBA を一晩放置してください。
- 純粋な(100%)でサンプルをさらに脱水する2時間のTBA。
- クリアリングソリューションBABB-D15を準備します。
注: BABB-D15 は BA と BB (BABB) の組み合わせで、x :1 の比率で DPE と混合され、この場合は 15 でxが指定されます。- BABBの場合は、1部のBAを2つのパーツBBと混ぜます。
- BABBとDPEを15:1の比率で混合します。
- 0.4 vol%DL-α-トコフェロール(ビタミンE)を加えます。
注:例えば、BABB-D15の20 mLの場合、BAの6.25 mLをBBの12.5 mLと混合します。DPEの1.25 mLを追加し、DL-α-トコフェロールの0.08 mLでそれを補います。
- 光学的に透明になるまで(2~6時間)、クリアリング溶液のサンプルをクリアします。
- サンプルはBABB-D15の4 °Cで貯えることができる、取付けおよびイメージ投射まで光から保護される。
6. サンプル取り付け
- 3Dプリンターを使用して、イメージングチャンバと蓋(材料:コポリエステル[CPE]、ノズル:0.25mm、層高さ:0.06mm、壁厚さ:0.88mm、壁面数:4、インフィル:100%、サポート構造なし、対応する。STLファイルは、このプロトコルの補足資料で見つけることができます)。
- 撮像室を組み立てる(図2)。
- RTV-1(1成分室温加硫)シリコーンゴムを使用して、イメージングチャンバに丸いカバースリップ(直径:30mm)を取り付けます。水で濡れた綿棒で余分なシリコーンゴムを取り除き、一晩硬化します。
- RTV-1シリコーンゴムで蓋に丸いカバースリップ(直径:22mm)を取り付けます。水で濡れた綿棒で余分なシリコーンゴムを取り除き、一晩硬化します。
- サンプルをイメージングチャンバに入れ、少量のBABB-D15を加え、蓋を挿入します。低皮針(27 G x 3/4インチ[0.40 mm x 20 mm])を使用して、入り江を通してBABB-D15でチャンバーを充填します。
- 入り込みとRTV-1シリコーンゴムでイメージングチャンバを密封します。暗闇の中で一晩治療する。
7. 画像処理・画像処理
- 使用する蛍光色素に合わせてそれぞれのレーザー線を選択して画像集録を設定します。各検出器の検出範囲を調整して、チャネル間の信号の重複を防ぎます。
注:Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 568、およびTO-PRO-3の例示的な検出範囲は、それぞれ500~550nm、590~620nm、645~700nmです。 - 取得パラメータを選択し、Z スタックの上下の境界線を定義し、イメージ スタックを取得します。
注:例示的な取得パラメータは、60-90 nmのピクセルサイズ、0.5 μmのZステップサイズ、ライン平均1、スキャン速度400Hz、および1 Airyユニットのピンホールサイズを持つシーケンシャルスキャンです。 - 適切な画像解析ソフトウェア(フィジーなど)を使用して画像スタックを処理し、3D投影を生成したり、詳細な解析を実行したりできます。
注: 取得したイメージ・ファイルのサイズが大きいため、通常はワークステーションの使用が必要です。- フィジーで取得ファイルまたはイメージ ファイルを開く (ファイル|開く|ファイルを選択してください)。
- たとえば、 を使用する場合は、 を使用します。LIF ファイルは、[生体フォーマット] ダイアログ ウィンドウで目的のオプションを選択または選択解除します。ハイパースタックを使用してスタックを表示します。それ以外は、特定の選択や目盛りは必要ありません。[OK]を押します。
- ファイルに複数のイメージ スタックが含まれている場合は、分析対象の画像を選択し、[OK]を押して確認します。
- マージしたイメージを個別のチャンネルに分割して漂白剤補正を行う (画像|色|チャンネル ツールを選択し、[その他]を選択します |チャンネルを分割します)。チャンネルごとに漂白剤補正を選択(画像|調整|漂白剤補正)を選択し、単純比(背景強度:0.0)を選択します。
注:例えば、信号の線形減衰がない場合や、信号が全体的に弱すぎると、単純比が失敗する場合があります。または、指数フィットを試すか、漂白剤補正をスキップしてください。 - スライダーを使用して各チャンネルの明るさとコントラストを調整します (画像|調整|明るさ|コントラスト)。
- チャンネルをマージする (画像|色|チャンネルをマージし、コンポジットを作る (画像|色|チャンネル ツールを選択し、[その他]を選択します |コンポジットを作成し、RGB 形式に変換します (画像|色|チャンネル ツールを選択し、[その他]を選択します |RGB に変換します)。
- 必要に応じて、画像スタックのサイズを変更して計算時間とファイルサイズを小さくします (画像|調整|サイズ、両方のオプションがチェックとバイリニア補間)。
- 3D 投影を生成する (画像|スタック|3Dプロジェクト)。投影方法として[最も明るい点]を選択し、取得した画像スタックのZステップサイズに合わせてスライス間隔を設定します。品質を高めるには、回転角度の増分を1に設定し、補間を有効にします。必要に応じて、回転の合計、透明度のしきい値、および不透明度を変更します。
- 必要に応じて、3D投影を 8 ビット形式に戻してコントラストと明るさを戻します (画像|タイプ|8ビット)。それぞれのスライダーを使用する (画像|調整|明るさ|コントラスト)ステップ 7.3.4 で説明したように、イメージ スタックを RGB 形式に再変換します。
- 3D 投影を として保存します。TIF ファイル (イメージ ファイル形式) および .AVIファイル(ビデオファイル形式)。
- フィジーで取得ファイルまたはイメージ ファイルを開く (ファイル|開く|ファイルを選択してください)。
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Representative Results
iDISCO14およびuDISCO13の組み合わせは高リゾリューションCLSMと結合され、脳組織および周囲の細胞文脈のRABV感染の時空間的な決断および可塑性に深い洞察を提供する。
RABVリンタンパク質(P)の免疫染色を用いて、感染した神経細胞の複雑な層をマウス脳の厚い部分で可視化することができる(図3)。その後、取得した画像スタックのシームレスな3D投影を再構築することができます(図3A、B、右パネル;アニメーション図1)臓器材料が起源の種に対して一次抗体および二次抗体を使用する場合は注意が必要です。マウス脳組織上の抗マウスIgG抗体の使用は、血管系の明確な染色をもたらした(図3B、左パネル)。画像スタックが高い解像度で取得されるため、感染は単細胞レベル(図4)まで評価でき、例えば細胞内の抗原の豊富さと分布をアサーションすることができます(図4C)).
マウスの脳組織とは別に、プロトコルは他の動物種(例えば、フェレット)からの脳組織にも適用することができます(図5;アニメーション図2)。感染したフェレット脳の異なる区画から採取したセクションは、RABV感染の様々な程度を明らかにした(図5A-D)。
脳は多くの異なる細胞細胞亜集団を含むので、これらの集団間の分化は不可欠である。細胞マーカーに対する抗体を用いて、感染細胞および隣接細胞の細胞同一性の評価が可能である。例えば、アストロサイトはグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)の発現によって分化することができる(図6A,C;アニメーション図3)、神経突起は微小管関連タンパク質2(MAP2)に特異的に染色することができるが(図6B,D;アニメーション図4)。同時に、ウイルスタンパク質は、この場合、RABVヌクレオタンパク質(N)を、感染細胞と強調された細胞下集団との関係を評価するために受け入れることができる。
図 1: プロトコルの基本原理とワークフロー。(A) Renier et al.14および Pan et al.13.(B) 2つの例示的なフェレット脳スライス、1つ前(左パネル)と有機溶媒による処理後の1つ(右パネル)。クリアリングは、その後読み取り可能なテキストによって観察可能として組織を光学的に透明にします。クリアされた脳のスライスは3Dプリントのイメージ投射部屋(右パネル)に埋め込まれる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:3Dプリントイメージングチャンバーの技術的なイラスト。(A) 撮像室の分解図図。点線は、RTV-1シリコーンゴムを使用して互いに取り付ける必要があるコンポーネントを強調表示します。破線は、チャンバの後続のアセンブリの指示を表します。(B) イメージングチャンバのCAD(コンピュータ支援設計)ファイル。対応する .イメージングチャンバを印刷するためのSTLファイルは、補足資料で見つけることができます。(C)十分に組み立てられたイメージ投射室。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: RABVに感染したマウス脳組織の深部組織イメージング(AおよびB)マウスは組換えバルパインストリートウイルスに感染した。 RABV P染色(緑)は、クリアされた脳組織内の大きく絡み合った神経突起を有する感染した神経層を明らかにする。核はTO-PRO-3(青色)で対抗した。(B) マウス組織上の蛍動管標識抗マウスIgG二次抗体(赤色)の使用は、血管系の明確な標識をもたらす。取得した画像スタックの3D再構成により、異なる視野角(AとB、右パネル)からの観察が可能になります。スケールバー = 60 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4:高解像度画像集録により、単一セルレベルまでの複雑な評価が可能です。脳はSAD L16 感染マウスから解剖した。(A) RABV P染色(緑色)は、個別に感染したニューロンを強調表示する。(BおよびC)詳細画像および投影は、抗原の豊富さ、分布、および局在化の詳細な分析が行うことができることを示している。 核はTO-PRO-3(青色)で対抗した。スケールバー = 20 μm (A) 、 5 μm (C)この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: RABV感染フェレット脳組織の深部組織イメージングフェレットは犬通りRABVに感染した。(A–D)脳の特定の領域からのスライスを採取し、RABV P(緑色)のために免疫染色し、光学的にクリアした。突起は、脳の異なる部分の感染細胞が量と形態が異なっていることを示しています。さらに、彼らは、マウス由来以外の組織へのプロトコルの適用性を強調する。核はTO-PRO-3(青色)で対抗した。スケールバー = 60 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6:多色免疫蛍光は、細胞マーカーのコスタ化を可能にする。イヌ通りRABVに感染したフェレットからの脳組織スライスを使用し、RABV N(赤色)および(AおよびC)GFAP(緑色)または(BおよびD)MAP2(緑色)のいずれかに共免疫染色した。 GFAPはアストロサイトマーカーであるのに対し、MAP2は特にニューライトを強調しています。核はTO-PRO-3(青色)で対抗した。(CおよびD)下部には、マージされた投影法から列挙された詳細ビューの単一スライス抽出が表示されます。スケールバー = 15 μm (AおよびB) 10 μm (CおよびD)この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
アニメーション図1:RABVに感染したマウス脳からの画像スタックの3D再構成と詳細投影。投影は、図 3で説明するイメージ スタックから生成されました。(AおよびC) それぞれの Z スタック全体のアニメーション。(B) ビデオの冒頭で強調表示されている領域の Z スタックの一部の 3D 再構成の詳細な投影。(D) ビデオの冒頭で強調表示された領域の Z スタックの一部のトモグラムの詳細な投影。緑 = RABV P;赤 = マウス IgG;青 = 核。このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。
アニメーション図2:RABV感染フェレット脳から取得した画像スタックの3D再構成。投影は、図 5で説明するイメージ スタックから生成されました。(A–D)ア釈は、同じ図を参照し、スライスから取られた脳のそれぞれの領域を記述します。緑 = RABV P;青 = 核。このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。
アニメーション図3:RABVに感染したフェレット脳の3D再構成の異なるチャネルの段階的な投影は、アストロサイトマーカーGFAPを用いた。図6Aに記載されているイメージ スタックから投影が生成されました。チャネルの段階的な追加はRABV N(赤色)から始まり、その後細胞核(青)に続き、最後にGFAP(緑色)、減算は最初にRABV N、次に細胞核、そして最終的にはGFAPを除去します。このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。
アニメーション図4:神経マーカーMAP2を用いたRABV感染フェレット脳の3D再構成の異なるチャネルの段階的な投影。図6Bに記載の画像スタックから投影を生成した。チャネルの段階的な追加はRABV N(赤)で始まり、その後細胞核(青)に続き、最後にMAP2(緑色)、減算は最初にRABV N、次に細胞核、そして最終的にはMAP2を除去します。このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。
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Discussion
近年の組織浄化技術の復活とさらなる発展2,3,4,5,6,7,8,9,10歳,11歳,12歳,13歳,14は、臓器組織の大量の画像スタックを得るために多くの新しい可能性を開いた。これは、他の多くのトピックの中で、ウイルス感染を研究するための比類のない強力なツールを提供しました。これらの画像スタックのその後の3D再構築は、例えば、ウイルスのトロピズム、豊富さ、および感染の時間経過に関する洗練されたアサーションを可能にします。このプロトコルは、溶媒クリアされた脳組織におけるRABV感染の免疫標識支援可視化について説明する。
免疫標識された溶媒を取り除いた組織の画像スタックの調製および取得にはいくつかの重要なステップがあります。PFAへの長期暴露は、エピトープをマスクすることができ、したがって、抗原性20、21、22の減少をもたらす。したがって、固定時間を必要最小限に抑え、サンプルを適切な溶液に移す(例えば、PBSを長期保存用に0.02%NaN3で補充する)。しかし、ここで提供されるすべての代表的な画像と投影は、アーカイブされた脳サンプルから取得され、そのうちのいくつかは何週間もPFAに保存されており、PFAにさらされた臓器材料への技術の適用性を強調しています。時間の延長。同様の結果は、ヒト脳サンプル13について示されている。もう一つは、最も重要でない場合は、抗体インキュベーションである。抗体濃度は慎重に選択する必要があります。ほとんどの場合、標準的なIHC濃度は深部組織抗体標識の良い出発点であるが、一部の抗原は抗体濃度の追加最適化を必要とする場合がある。このプロトコルは、RABV NおよびPの両方が使用された抗体によって容易に検出できることを示す。MeOH前処理は通常免疫標識を改善しますが、一部の抗原はこの治療と互換性がありません。それらのために、Renierと同僚14は、代替MeOHフリーサンプル前処理を提供した。取得した画像スタックの解析には、十分な計算能力が必要です。ファイル サイズはスタックあたり最大数ギガバイトであるため、イメージを処理するには強力なコンピュータが必要です。後処理には、多くの場合、バックグラウンドノイズの減算と、取得に関連する漂白効果を補正するための漂白補正が含まれます。距離を測定する場合、副作用として、組織がクリアプロセス中に縮小していることを念頭に置く必要があります。
光シート蛍光顕微鏡(LSFM)や2光子レーザー走査顕微鏡(2PLSM)のような他の顕微鏡検査プラットフォームと比較して、CLSMは最も限られた作業距離を有する。したがって、画像化のために器官を厚さ1mmにプリスライスする必要がある。さらに、CLSMは高いイメージ投射分解能のために最も遅い集録速度を有する。光板顕微鏡を使用すると、画像分解能を犠牲にしながら、脳全体のイメージングまで大容量のイメージングを高速化できます。もう一つの制限は、波長の減少に伴う組織自己蛍光の固有の増加である。これは、405 nmでレーザーラインによって励起された蛍光色素および染料の使用をレンダリングし、ホエシュト染料を含む、不可能に非現実的である。
他の組織の清算の技術に関して、iDISCO14およびuDISCO13のハイブリッドは最も肯定的な属性を結合する:それは免疫染色と非常に互換性があり、非常に多目的、比較的速く、安価である、優秀な清算機能、および標準的な共焦点顕微鏡と実現可能である。さらに、このプロトコルは、脳組織の免疫染色およびクリアリングに限定されるものではなく、神経侵襲および非神経侵襲性の他の様々な軟部組織および病原体にも適用することができる。結論として、ここで説明するプロトコルは、RABVに感染した脳組織の高解像度3Dイメージングのためのパイプラインを表す。感染した脳組織の3D再構成は、RABV疾患の進行、病因、神経侵来に関する様々な質問に答えるために使用することができる。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者は、トーマス・C・メッテンライターとヴェレナ・テ・カンプが原稿を批判的に読んでくれたことに感謝しています。この研究は、メクレンブルク西部ポメラニア連邦優秀イニシアティブと欧州社会基金(ESF)グラント・コインフェクット(ESF/14-BM-A55-0002/16)およびリッサウイルスに関する内部共同研究助成金によって支援されました。フリードリヒ・ローフラー研究所(Ri-0372)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Clearing reagent |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Clearing reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Various buffers |
| Diphenyl ether | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Clearing reagent |
| DL-α-Tocopherol | Alfa Aesar | A17039 | Antioxidant |
| Donkey serum | Bio-Rad | C06SBZ | Blocking reagent |
| Glycine | Carl Roth | 3908.2 | Background reduction |
| Goat serum | Merck | S26-100ML | Blocking reagent |
| Heparin sodium salt | Carl Roth | 7692.1 | Background reduction |
| Hydrogen peroxide solution (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sample bleaching |
| Methanol | Carl Roth | 4627.4 | Sample pretreatment |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | Crystalline powder to make fixative solution |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | Prevention of microbial growth in stock solutions |
| tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Sample dehydration for tissue clearing |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Nucleic acid stain |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detergent |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Detergent |
| Miscellaneous | |||
| 5 mL reaction tubes | Eppendorf | 0030119401 | Sample tubes |
| Coverslip, circular (diameter: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Part of imaging chamber |
| Coverslip, circular (diameter: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Part of imaging chamber |
| Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Filling of the imaging chamber with clearing solution |
| RTV-1 silicone rubber | Wacker | Elastosil E43 | Adhesive for the assembly of the imaging chamber |
| Ultimaker CPE 2.85 mm transparent | Ultimaker | 8718836374869 | Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber |
| Technical equipment and software | |||
| 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Printing of imaging chamber |
| Automated water immersion system | Leica | 15640019 | Software-controlled water pump |
| Benchtop orbital shaker | Elmi | DOS-20M | Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm) |
| Benchtop orbital shaker, heated | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Inverted confocal microscope for sample imaging |
| Fiji | NIH (ImageJ) | open source software (v1.52h) | Image processing package based on ImageJ |
| Long working distance water immersion objective | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Sample slicing |
| Workstation | Dell | Precision 7920 | CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
| Primary antibodies | |||
| Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400 |
|
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100 |
| Rabbit anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250 |
| Rabbit anti-RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000 |
|
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
References
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