Summary
Представлено здесь протокол, чтобы вызвать диффузную черепно-мозговую травму с помощью боковой жидкости ударные устройства следуют сбор содержания caecum для анализа кишечного микробиома.
Abstract
Все больше данных свидетельствует о том, что микробиота-кишка-мозг оси играет важную роль в патогенезе заболеваний головного мозга. Несколько исследований также показывают, что черепно-мозговые травмы вызывают изменения в микрофлоре кишечника. Однако механизмы, лежащие в основе двунаправленной регуляции оси мозга и кишечника, остаются неизвестными. В настоящее время существует несколько моделей для изучения изменений в микрофлоре кишечника после черепно-мозговой травмы. Таким образом, представленное исследование сочетает в себе протоколы для индуцирования черепно-мозговой травмы с помощью боковой жидкости ударные устройства и анализа образцов caecum после травмы для исследования изменений в микрофлоре кишечника. Изменения состава микрофлоры кишечника после черепно-мозговой травмы определяются с помощью секвенирования 16S-rDNA. Этот протокол является эффективным методом изучения взаимосвязи между энтерическими микроорганизмами и черепно-мозговой травмой.
Introduction
Травматическая черепно-мозговая травма (TBI) является глобальной проблемой общественного здравоохранения и основной причиной смерти и инвалидности у молодых людей1,2. TBI вызывает много смертей каждый год, и выжившие испытывают различные физические, психиатрические, эмоциональные и когнитивные нарушения. Таким образом, ТБИ является тяжелым бременем для семьи пациента и социальных ресурсов. TBI включает в себя как первичную черепно-мозговую травму, которая происходит во время травмы и любые вторичные травмы головного мозга, которые развиваются часов до нескольких месяцев после первоначальной травмы. Вторичная травма головного мозга опосредована несколькими биохимическими каскадами, которые не только вредны для мозга, но и оказывают значительное негативное воздействие на различные системы органов, в ключая желудочно-кишечную систему3.
В настоящее время существует три модели, чтобы вызвать TBI в экспериментах на животных: травма жидкости ударных, контроль коркового воздействия (CCI), и ускорение падения веса. Боковая травма перкуссия жидкости (LFPI) является наиболее часто используемой моделью для установления диффузной черепно-мозговой травмы (DAI)4. Устройство производит черепно-мозговую травму через краниэктомию, применяя краткое давление жидкости импульс анетицирует сяртам. Этот пульс создается ударом маятника. LFPI является воспроизводимым и управляемым методом моделирования для исследования TBI.
Микробиом определяется как коллективные геномы всех микроорганизмов, которые находятся в организме человека. Кишечные микробы, в частности, не только играют важную роль в кишечной гомеостаза и функции, но и регулировать многие аспекты физиологии хозяина и функционирования других органов5. В последние годы, есть все больше доказательств того, что указывает на то, что кишечная микробиота регулировать развитие мозга и функции через мозг кишки осей6. Нарушение микрофлоры кишечника было связано с несколькими расстройствами функции мозга, включая болезнь Паркинсона, расстройства настроения, и аутизм7. В последнее время доклинические исследования также сообщили, что острая черепно-мозговая травма может вызвать изменения в микрофлоре кишечника8,9.
Исследование Treangen et al.10 выявило значительное уменьшение трех видов микробов и увеличение двух видов микробов после ТБИ, индуцированного ТБИ. Эти данные свидетельствуют о том, что модуляция кишечной микробиоты может быть терапевтическим методом в управлении TBI. Тем не менее, механизмы, лежащие в основе черепно-мозговой травмы вызванных кишечника изменения микрофлоры остаются неизвестными. По этой причине требуется относительно простая и эффективная модель изучения изменений в микрофлоре кишечника после TBI. Таким образом, настоящее исследование представляет собой протокол для изучения изменений в микрофлоре кишечника после TBI у мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все выполненные процедуры были одобрены Экспериментальным комитетом по этике животных Университета Чжэцзяна. Все инструменты и материалы, используемые в хирургии, являются стерильными. TBI proceudre занимает около 20 минут.
1. Уход за животными
- Используйте в этом эксперименте мышей C57BL/6J (20-25 г веса) от 5 до 6 недель.
- Поддерживайте мышей на свет/темном цикле 12 ч/12 ч и убедитесь, что они получают пищу и воду ad libitum. Обеспечить одинаковое количество пищи и воды как для фиктивных, так и для групп ТБИ на протяжении всего исследования.
- Приложить все усилия, чтобы свести к минимуму боль и дискомфорт животных.
2. Индукция черепно-мозговой травмы
- Вводят кетамин (80-100 мг/кг)/ксилазин (10 мг/кг) IP для анестезии. Проверьте глубину анестезии с помощью глазного рефлекса или болевого рефлекса. Используйте искусственные слезы или мазь для глаз, чтобы держать глаза от высыхания.
- После анестезии, положить мышь в лежачем положении. Используйте температурную грелку для поддержания температуры на уровне 37 градусов по Цельсию во время операции и в течение 30 минут после TBI.
- Бритье волос области разреза.
- Дезинфицировать кожу головы с 70% этанола с помощью трех чередующихся скрабы, а затем инициировать кожу головы в сагиттальной плоскости.
- Используйте щипцы, чтобы утянуть разрез с обеих сторон и немного отделить периостеум.
- Используйте маркер, чтобы нарисовать круг (3 мм в диаметре) на правой теменной области черепа, 2 мм от средней линии.
- Просверлите череп с помощью электрической дрель. Убедитесь, что этот шаг работает осторожно, чтобы защитить dura от повреждения.
- Снимите костной лоскут и разоблачите небольшое костное окно (3 мм в диаметре).
- Поместите пластиковую канюлу (внутренний диаметр 2,5 мм, длина 8 мм) над краниотомией и цемента канюли к черепу с помощью зубного акрила.
- Заполните канюлю стерильным 0,9% NaCl (нормальный солен) с помощью шприца (5 мл), чтобы убедиться, что в канюле нет пузырьков.
- Включите осциллоскоп и усилитель и убедитесь, что трубка высокого давления боковой жидкости ударных травмы (LFPI) устройство не имеет пузырьков воздуха. Проверьте устройство, доставив около 10 импульсов, пока оно не даст устойчивый сигнал. Отрегулируйте угол исходного положения маятника, чтобы достичь интенсивности пульса около 2,0 атм.
- Подключите канюль травмы к устройству LFPI. Побудить черепно-мозговую травму, нажав на курок и выпустив маятник. Затем получить пульс и передать его в дюру через всю закрытую заполненную жидкостью трубную систему.
- Оперируйте мышей в фиктивной группе с той же хирургической процедурой. Не выполняйте LFPI.
3. Послеоперационное лечение
- После индуцирования черепно-мозговой травмы, удалить пластиковые канюли и шов разреза. Во время операции вводят бупренорфин (2 мг/кг) СЗ или ИС, а затем каждые 6-12 ч в течение трех дней.
- Положите мышь на грелку, пока она не будет амбулаторной. Установите температуру грелки до 37 градусов по Цельсию для ускорения анестезии реанимации.
- Положите мышь обратно в клетку и управлять пищей и водой объявление libitum.
4. Лапаротомия и коллекция образцов из caecum
- Эвтаназия мышей CO2 с последующим вывихом шейки матки в соответствующие временные моменты.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте, выбранные точки времени были 1 ч, 6 ч, 1 d, 3 d, и 7 d посттравматическая черепно-мозговая травма для анализа динамической эволюции кишечной микробиоты. - Удалите волосы с поверхности живота. Дезинфекция брюшной полости с 70% этанола.
- Поместите стерильную драпировку над мышью. Сделайте разрез из нижней части живота средней линии, чуть выше prepuce у мышей мужского пола.
- После того, как кишечник подвергается, найти cecum и аккуратно отделил его от других кишечных путей. Избегайте схватив cecum с зубчатыми или острыми щипками. Используйте травматические щипцы, такие как щипцы Adson с serrations.
- Вырезать caecum с острыми ножницами.
- Извлеките содержимое caecum вручную на стерильную повязку и храните содержимое в микроцентрифуговых трубках 1,5 мл.
- Храните содержимое caecum при -80 градусах По Цельсию до анализа микробиома.
5. Извлечение ДНК и секвенирование и анализ данных 16S-rDNA
-
Изоляция ДНК от кала
ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступный набор изоляции ДНК (Таблица материалов) был использован для этого эксперимента.- Используйте скальпель, чтобы очистить 300 мг кала в 2 мл микроцентрифуговой трубки и поместите трубку на лед.
- Добавьте 1 мл подавляемого буфера к каждому образцу. Vortex непрерывно в течение 1 мин или до тех пор, пока кала образец тщательно гомогенизированы.
- Centrifuge образец на максимальной скорости в течение 1 мин, чтобы гранулы частиц кала.
- Пипетка 2 л протеиназа K в новую микроцентрифугную трубку 2 мл. Пипет каст 600 л супернатанта от шага 5.1.3 в микроцентрифугную трубку 2 мл, содержащую протеиназа K. Затем добавьте 600 л буфера 1 и вихрь на 15 с.
- Инкубировать образец при 70 градусах по Цельсию в течение 10 мин.
- Добавьте 600 л 100% этанола в лизат (коэффициент 1:1) и смешайте путем вихря. Центрифуги на максимальной скорости кратко удалить капли из внутренней крышки трубки.
- Нанесите 600 л lysate на колонку спина. Центрифуга на максимальной скорости в течение 1 мин. Отбросьте поток через. Повторите этот шаг еще раз. Затем перенесите колонку в новую трубку для сбора 2 мл.
- Откройте колонку спина и добавьте 500 зл. Центрифуга на максимальной скорости в течение 1 мин. Снимите колонку и поместите ее в новую трубку для сбора 2 мл.
- Добавьте в колонку 500 кл.л. буфера 3. Центрифуга на максимальной скорости в течение 3 мин. Отбросьте поток через. Повторите процесс центрифугации один раз, чтобы обеспечить буфер 3 полностью eluted.
- Поместите вращательную колонку в новую трубку 2 мл трубки сбора и пипетка 200 Л. буфера 4 непосредственно на мембрану. Инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре (RT), затем центрифуги на максимальной скорости в течение 1 мин, чтобы elute ДНК.
-
16S-rDNA секвенирования и анализа данных
- Используйте 20-30 нг ДНК для генерации ампиконов.
- Используйте коммерчески доступные грунтовки, предназначенные для относительно сохранимых регионов, граничащих с гиперпеременными регионами V3 и V4 бактерий 16S rDNA. В настоящем исследовании были использованы форвардные праймеры, содержащие последовательность "CCTACGGRRCASCASCAGKVRVGAAT" и реверсивные грунтовки, содержащие последовательность "GGACTACNVGGGTWTCTAATCC".
- Сделайте смесь реакций ПЦР, добавив 2,5 л буфера 1, 2 зл и dNTPs, 1 зл и l каждой грунтовки, 0,5 л ДНК-полимеразы и 20 нг шаблонДНК в трубке. Используйте ddH2O, чтобы настроить систему реакции до 25 Л.
- Установите параметры реакции ПЦР следующим образом: выполните предденатурацию при 94 градусах по Цельсию в течение 3 мин один раз. Выполните денатурацию при 94 градусах по Цельсию на 5 с, аннеал при 57 градусах по Цельсию на 90 с, расширяйте при 72 градусах по 10 с и повторяйте это 24x.
- Выполните секвенирование PE250/300 в паре в соответствии с инструкцией производителя и используйте пакет анализа данных для анализа данных 16S rRNA.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте секвенирование ДНК и анализ данных были в первую очередь выполнены профессиональной компанией по секвенированию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Создание TBI показано на рисунке 1. После анестезии и дезинфекции, кожа головы была разрезана sagittally(рисунок 1A). Краниотомия (3 мм в диаметре) была трефина в череп над правой теменной коры с электрической дрелью, dura была сохранена в целости и сохранности(Рисунок 1B, C). Пластиковая канюля травмы была помещена над окном кости и зацементирована к черепу с помощью зубного акрила(рисунок 1D).
Процедура боковой жидкости ударных показано на рисунке 2. Перед запуском устройство было протестировано, доставив около 10 импульсов, пока не даст устойчивый сигнал. Угол маятника был скорректирован в исходное положение, чтобы достичь интенсивности пульса около 2,0 атм(рисунок 2A). Канюла была заполнена стерильным нормальным сольным раствором. Затем канюля была подключена к устройству LFPI(рисунок 2B). Повреждение мозга было вызвано созданием импульса в закрытую полость черепа(рисунок 2C).
Лапаротомия и caecum фекальные образцы сбора показаны на рисунке 3. Лапаротомия была выполнена на нижней части живота и вдоль средней линии(рисунок 3A). Caecum был идентифицирован и мягко разделены(Рисунок 3B, C). Caecum обычно расположен в нижней правой части живота. Затем он был разрезан острыми ножницами(рисунок 3D). Содержимое caecum(рисунок 3E) были извлечены и хранятся в 1,5 мл труб(рисунок 3F). Образцы фекальных образцов были немедленно сохранены при -80 градусов по Цельсию перед дальнейшим использованием.
16S-rDNA секвенирования продемонстрировали снижение разнообразия caecum микробиоты у мышей 3 дней после TBI, наиболее распространенные таксны в caecum содержание обмана и TBI группы были показаны в Рисунок 4. В анализе секвенирования 16S был проведен тест на сумму ранга Уилкоксона для оценки различий между ТБИ и фиктивными группами, и значение p было меньше 0,05. Неметрическое многомерное масштабирование (NMDS) также показало измененный состав caecum микробиоты после TBI(рисунок 5).
Рисунок 1 : Создание TBI. (A) После анестезии и дезинфекции, кожа головы была разрезана. (B) Оперировать цирцинат краниотомии на черепе над правой теменной коры. (C) Держите дюру нетронутыми. (D) Цемент пластиковые канюли травмы черепа с помощью акрила зубов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Процедура боковой жидкости ударных. (A) Корректировка угла стартового положения маятника. (B) Заполнение канюли стерильным нормальным сольем, затем подключение канюли к устройству LFPI. (C) Индукция травмы мозга путем выпуска маятника и создания импульса в закрытой полости черепа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Лапаротомия и caecum фекальные образцы коллекции. (A)Начало лапаротомии из нижней части живота и вдоль средней линии. (B, C) Идентификация caecum и последующее (мягкое) удаление. (D) Резка цекума острыми ножницами. (E) Извлечение содержимого caecum. (F) Хранение образцов содержания кекума в 1,5 мл Eppendorf труб. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Сравнение разнообразия микрофлоры caecum. Наиболее обильные таксонва по содержанию caecum обмана и TBI группы продемонстрировали снижение разнообразия caecum микробиоты у мышей 3 дней после TBI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 : Анализ NMDS. Неметрическое многомерное масштабирование (NMDS) показало измененный состав caecum microbiota после TBI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представлен простой и эффективный протокол для определения изменений в микрофлоре цекалы после TBI у мышей. Индукция черепно-мозговой травмы и сбор образцов содержания цекума являются важнейшими частями протокола.
Несмотря на исследователи изучили изменения кишечной микробиоты после TBI, черепно-мозговая травма, используемая в этих исследованиях были CCI-8 и падение веса / воздействие индуцированных моделей9. Тем не менее, модель CCI в основном реплицирует ушиб мозга, и модель падения веса может страдать от некоторых неточностей. Среди всех существующих моделей черепно-мозговой травмы, LFPI является наиболее часто используемой моделью, которая включает в себя фокусные и диффузные черепно-мозговыетравмы 11,12 и реплицирует многие важные функции, наблюдаемые в клинических пациентов TBI. Ключевые шаги на протяжении всего процесса включают защиту дюры и поддержание канюли герметичной. Однако, как краниотомия, так и конглетинация требуют работы квалифицированного исполнителя, что может быть ограничением этого протокола. Тем не менее, LFPI по-прежнему является простым, стабильным и точным методом. Таким образом, TBI у мышей был индуцирован с помощью LFPI в этом исследовании, что делает протокол более репрезентативным и ценным в исследованиях черепно-мозговой травмы.
Для анализа микрофлоры кишечника для его неинвазивности и удобства использовались фекальные образцы. Тем не менее, существуют некоторые ограничения фекальной выборки. Во-первых, количество кала, собранного в каждой мыши в определенный момент времени, невелико, а количество кала может быть недостаточным для проведения 16S-rDNA анализа. Во-вторых, из-за посттравматической желудочно-кишечной дисфункции, образцы кала трудно собрать во время острой фазы после черепно-мозговой травмы (1 ч после травмы в этом исследовании). Кроме того, данные показали, что фекальные составы микробиоты отличается от микробиоты в других кишечных сегментах13. Таким образом, caecum содержание были собраны для анализа кишечной микробиоты в этом исследовании. Caecum содержание выборки требует, чтобы мыши приносятся в жертву, и этот метод позволяет для отбора проб кишечного тракта для гистологических и иммунологических исследований, которые являются важными аспектами исследования в исследованиях мозга травмы индуцированной дисфункции кишечника. Кроме того, этот метод может быть использован для исследования изменений микробиоты в других желудочно-кишечных трактах, включая jejunum, ileum, и толстой кишки. В заключение, этот протокол является идеальным методом для изучения TBI-индуцированных изменений в микрофлоре кишечника.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы искренне благодарят Baohong Wang за ее техническое руководство.
Acknowledgments
Авторам нечего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA isolation kit | QIAGEN | 51604 | For fast purification of genomic DNA from stool samples |
| Gene analysis service | GENEWIZ | Gene analyse service | |
| Heating pad | Shanghai SAFE Biotech Co. | TR-200 | heating pad |
| Injector | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | injector | |
| LFPI device | Virginia Commonwealth University |
FP302 | LFPI device |
| Micro cranial drill | RWD Life Science | 78061 | Micro cranial drill |
| Povidone Iodine | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | Povidone Iodine |
References
- Cheng, P., et al. Trends in traumatic brain injury mortality in China, 2006-2013: A population-based longitudinal study. 14, e1002332 (2017).
- Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
- Gaddam, S. S., Buell, T., Robertson, C. S.
- Kabadi, S. V., et al. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
- Fung, T. C., Olson, C. A., Hsiao, E. Y. Interactions between the microbiota, immune and nervous systems in health and disease. Nature Neuroscience. 20, 145-155 (2017).
- Collins, S. M., Surette, M., Bercik, P. The interplay between the intestinal microbiota and the brain. Nature Reviews Microbiology. 10, 735-742 (2012).
- Cryan, J. F., Dinan, T. G. Mind-altering microorganisms: the impact of the gut microbiota on brain and behaviour. Nature Reviews Neuroscience. 13, 701-712 (2012).
- Nicholson, S. E., et al. Moderate Traumatic Brain Injury Alters the Gastrointestinal Microbiome in a Time-Dependent. Shock. , (2018).
- Houlden, A., et al. Brain injury induces specific changes in the caecal microbiota of mice via altered autonomic activity and mucoprotein production. Brain, Behavior, and Immunity. 57, 10-20 (2016).
- Treangen, T. J., et al. Traumatic Brain Injury in Mice Induces Acute Bacterial Dysbiosis Within the Fecal Microbiome. Frontiers in Immunology. 9, 2757 (2018).
- Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral fluid percussion: model of traumatic brain injury in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Thompson, H. J., et al. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. Journal of Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).
- Pang, W., Vogensen, F. K., Nielsen, D. S., Hansen, A. K. Faecal and caecal microbiota profiles of mice do not cluster in the same way. Laboratory Animals. 46, 231-236 (2012).
