Summary
מוצג כאן הוא פרוטוקול לגרום לטשטוש פגיעה מוחית טראומטית באמצעות מכשיר הקשה לרוחב הכלי נקישה ואחריו אוסף של תוכן caecum לניתוח microbiome בטן.
Abstract
העלאת ראיות מראה כי הציר מיקרוביוטה-המוח-בטן ממלא תפקיד חשוב בפתוגנזה של מחלות המוח. מספר מחקרים גם להדגים כי פציעות במוח טראומטי לגרום לשינויים במעיים מיקרוביוטה. עם זאת, מנגנונים המשמשים את הוויסות הדו-כיווני של ציר המוח-המעיים נותרים בלתי ידועים. כיום, מספר דגמים קיימים ללימוד השינויים מיקרוביוטה במעיים לאחר פגיעה מוחית טראומטית. לכן, המחקר המוצג משלב פרוטוקולים לגרימת נזק מוחי טראומטי באמצעות התקן כלי הקשה נוזל לרוחב וניתוח של דגימות caecum לאחר הפציעה עבור חקירת שינויים מיקרובידום הבטן. שינויים של הרכב המעיים מיקרוביוטה לאחר פגיעה מוחית טראומטית נקבעים באמצעות שינוי רצף של 16 s-rDNA. פרוטוקול זה מספק שיטה אפקטיבית ללימוד היחסים בין מיקרואורגניזמים בידור ופגיעה מוחית טראומטית.
Introduction
פגיעה מוחית טראומטית (tbi) היא בעיית בריאות הציבור העולמי והגורם המוביל למוות ונכות אצל מבוגרים צעירים1,2. TBI גורמת למקרי מוות רבים מדי שנה, והניצולים חווים מגוון של לקויות פיזיות, פסיכיאטריות, רגשיות וקוגניטיביות. לכן, TBI הוא נטל כבד למשפחתו של המטופל ולמשאבי החברה. TBI מערבת הן את הפגיעה המוחית העיקרית המתרחשת בזמן הטראומה וכל פציעות מוחי משני המתפתחים שעות לחודשים לאחר הפציעה הראשונית. פגיעה מוחית משנית מתווכת על ידי כמה מפלים ביוכימיים, אשר אינם מזיקים רק למוח אלא גם יש השפעות שליליות משמעותיות על מערכות איברים שונים, כולל מערכת העיכול3.
כיום, ישנם שלושה דגמים כדי לגרום TBI בניסויים בבעלי חיים: פגיעה בכלי הקשה של נוזל, שליטה השפעה קורטיקלית (CCI), והאצת ירידה במשקל. פציעה לרוחב הכלי הקשה (LFPI) היא המודל הנפוץ ביותר להקמת פגיעה מוחית מפוזר (DAI)4. המכשיר מייצר פגיעה מוחית באמצעות כריתת גולגולת על ידי החלת דופק קצר של לחץ נוזלי על השכבה השלמה. הדופק נוצר על ידי השביתה של המטוטלת. LFPI היא שיטת מידול מתוכמת ולשליטה עבור מחקר TBI.
המיקרובידום מוגדר הגנום הקולקטיבי של כל המיקרואורגניזמים השוכנים בגוף האדם. חיידקים מעיים במיוחד לא רק לשחק תפקיד חשוב בהומאוסטזיס מעיים פונקציה אלא גם לווסת היבטים רבים של הפיזיולוגיה המארחת ותפקוד של איברים אחרים5. בשנים האחרונות, יש הגדלת ראיות המציינת כי מיקרוביוטה המעיים להסדיר את התפתחות המוח ותפקוד באמצעות צירי המוח-בטן6. השיבוש של המעיים מיקרוביוטה נקשר להפרעות בתפקוד המוח כולל מחלת פרקינסון, הפרעות במצב הרוח, ואוטיזם7. לאחרונה, מחקרים פרה-קליניים דיווחו גם כי פגיעה במוח חריפה יכול לגרום לשינויים במעיים microbiota8,9.
מחקר של Treangen ואח '10 מצאו ירידה משמעותית בשלושה מינים מיקרוביאלית וגדל בשני מינים מיקרוביאלית אחרי tbi המושרה של CCI. הוכחה זו מצביעה על כך שאפנון של מיקרוביוטה עשוי להיות שיטה טיפולית בניהול TBI. עם זאת, המנגנונים המשמשים לפגיעה במוח המושרה שינויים מיקרוביוטה עדיין לא ידוע. מסיבה זו, מודל פשוט ויעיל יחסית של לימוד השינויים במעיים מיקרוביוטה לאחר TBI נדרש. לכן, המחקר הנוכחי מציג פרוטוקול לבחון שינויים במעיים מיקרוביוטה לאחר TBI בעכברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים שבוצעו אושרו על ידי הוועדה הניסיונית לאתיקה בעלי חיים של אוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג. כל המכשירים והחומרים המשמשים בניתוח הם עקרים. התהליך של המשך. לוקח בערך 20 דקות
1. טיפול בבעלי חיים
- השתמש 5 עד 6-שבוע בן זכר C57BL/6J עכברים (20-25 g של משקל) בניסוי זה.
- לשמור על עכברים על מחזור אור/12 h 12/כהה, ולוודא שהם מקבלים מזון ומים libitum המודעה. לספק את אותם כמויות של מזון ומים הן קבוצות הדמה ו TBI במהלך המחקר.
- לעשות את כל המאמצים כדי למזער את הכאב בעלי חיים ואי נוחות.
2. אינדוקציה של פגיעה מוחית טראומטית
- הזרקת קטמין (80-100 מ"ג/ק"ג)/xylazine (10 מ"ג/ק"ג) IP עבור הרדמה. בדוק את עומק ההרדמה באמצעות רפלקס העין או רפלקס הכאב. השתמש בדמעות מלאכותיות או משחה עין סיכה כדי לשמור על העיניים מפני ייבוש.
- לאחר הרדמה, לשים את העכבר בתנוחה נוטה. השתמש במשטח חימום מבוקר טמפרטורה כדי לשמור על הטמפרטורה ב-37 ° c במהלך הניתוח ובמשך 30 דקות אחרי TBI.
- . תגלח את השיער באזור החתך
- לחטא את הקרקפת עם 70% אתנול באמצעות שלושה חלוקים לסירוגין, ולאחר מכן בטעות את הקרקפת במישור משונן.
- השתמש מלקחיים לסגת את החתך משני הצדדים ולהפריד את קרום החזה מעט.
- השתמש בסמן כדי לצייר מעגל (3 מ"מ קוטר) על האזור הקודקודית הימנית של הגולגולת, 2 מ"מ הרחק מקו האמצע.
- לקדוח את הגולגולת עם מקדחה חשמלית. ודא ששלב זה מופעל בזהירות כדי להגן על השכבה הפגומה.
- הסירו את כנף העצם וחשפו חלון עצם קטן (3 מ"מ קוטר).
- מניחים צינורית של פציעה מפלסטיק (קוטר פנימי = 2.5 מ"מ, אורך = 8 מ"מ) על פתיחת הגולגולת ובטון הצינורית לגולגולת באמצעות אקריליק שיניים.
- מלא את הצינורית בעזרת מזרק (5 מ ל) 0.9 סטרילי (מתמיסת מלח רגילה) המשתמשת במזרק (3 מ"ל) כדי להבטיח שאין בועות בצינורית.
- הפעילו את האולוסקופ ואת המגבר והקפידו שצינור הלחץ הגבוה של פציעת ההקשה בנוזל הרוחבי (LFPI) יהיה חופשי מבועות האוויר. בדוק את המכשיר על ידי אספקת כ 10 פולסים עד שהוא נותן אות קבוע. כוונן את זווית מיקום המטוטלת כדי להגיע לעוצמת פעימה של כ-2.0 כספומט.
- חברו את צינורית הפציעה להתקן LFPI. לגרום לפגיעה במוח על ידי משיכת ההדק ושחרור המטוטלת. לאחר מכן, השיגו דופק והעבר אותו לדורא דרך מערכת האבובים המלאה בנוזלים.
- להפעיל את העכברים בקבוצה המזויף עם הליך כירורגי זהה. אל תבצע את ה-LFPI.
3. טיפול לאחר ניתוח
- לאחר גרימת פגיעה במוח, הסר את צינורית הפלסטיק ותפר את החתך. במהלך הניתוח מנהל בופרינורטין (2mg/ק"ג) מ"ר או IP ולאחר מכן כל 6-12 h במשך שלושה ימים.
- הנח את העכבר על משטח חימום עד שהוא אמבולטורי. הגדר את הטמפרטורה של משטח החימום כדי 37 ° צ' כדי להאיץ החייאה הרדמה.
- לשים את העכבר בכלוב ולנהל מזון ומים libitum המודעה.
4. לפרוטומיה ואוסף דגימות מהcaecum
- המתת חסד העכברים על ידי CO2 ואחריו פריקה צוואר הרחם על נקודות הזמן המתאימות.
הערה: בניסוי זה, נקודות הזמן שנבחרו היו 1 h, 6 h, 1 d, 3 ד, ו -7 ד פוסט טראומטי פגיעה במוח כדי לנתח את האבולוציה הדינמית של מיקרוביוטה בטן. - להסיר את השיער מפני השטח של הבטן. לחטא את הבטן עם 70% אתנול.
- מניחים את העטוף הסטרילי על העכבר. לחתוך את הבטן התחתונה באמצע, ממש מעל הראש בעכברים הזכרים.
- לאחר חשיפת המעיים, אתרו את המעי הסטום והפרידו אותו בעדינות מפני מעיים אחרים. הימנע אוחז את מעי עם שיניים או מלקחיים חדים. השתמש במלקחיים מרועטיים, כגון מלקחיים של אדסון בסרפי.
- חותכים את הקסטה. עם מספריים חדים
- לחלץ את התוכן caecum באופן ידני על ההלבשה סטרילי ולאחסן את התוכן בצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.
- אחסן את תוכן caecum בשעה-80 ° c עד ניתוח מיקרובידום.
5. הפקת דנ א ו-16S-rDNA ניתוח נתונים
-
בידוד של דנ א מצואה
הערה: ערכת בידוד DNA זמינה מסחרית (טבלת חומרים) שימש לניסוי זה.- השתמש אזמל כדי לגרד 300 מ"ג של צואה בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 2 mL ומניחים את השפופרת על הקרח.
- הוסף 1 מ ל של מאגר מעכב לכל דוגמה. מערבולת ברציפות במשך 1 דקות או עד דגימת צואה הוא הומוגניים ביסודיות.
- צנטריפוגה את המדגם במהירות המקסימלית עבור 1 דקות כדי לצנפה את חלקיקי הצואה.
- פיפטה 2 μL של מחקר. לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש Pipet 600 μL של supernatant משלב 5.1.3 לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל המכילים פרוטטינואז K. לאחר מכן, להוסיף 600 μL של מאגר 1 ו מערבולת עבור 15 s.
- מודקון את המדגם ב 70 ° c עבור 10 דקות.
- הוסף 600 μL של 100% אתנול לליפוסט (1:1 יחס) ו לערבב על ידי vortexing. צנטריפוגה במהירות המקסימלית לזמן קצר כדי להסיר טיפות מתוך מכסה הצינור.
- החל 600 μL של הליפוסט לעמודת הסחרור. צנטריפוגה במהירות המירבית עבור 1 דקות. למחוק את הזרימה. . חזור על השלב הזה עוד פעם אחת לאחר מכן, העבר את העמודה לצינור אוסף חדש של 2 מ"ל.
- פתח את עמודת הספין והוסף 500 μL של מאגר 2. צנטריפוגה במהירות המירבית עבור 1 דקות. הסר את העמודה והציבו אותו בשפופרת אוסף חדשה של 2 מ"ל.
- הוסף 500 μL של מאגר 3 לתוך העמודה. צנטריפוגה במהירות המירבית עבור 3 דקות. למחוק את הזרימה. חזור על התהליך הצנטריפוגה פעם אחת כדי להבטיח את מאגר 3 הוא חומק לחלוטין.
- מניחים את עמודת הספין לתוך צינור חדש 2 מ ל צינור ופיפטה 200 μL של מאגר 4 ישירות על הקרום. מודטה עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן צנטריפוגה במהירות המירבית עבור 1 דקות כדי להייוט DNA.
-
שנות הרצף וניתוח נתונים של 16S-rDNA
- השתמש 20-30 ng של DNA כדי ליצור הגברה.
- השתמש בצבעי יסוד זמינים מסחריים המיועדים לאזורים שאינם שמרו יחסית, הגובלים באזורי ההיפר-משתנים של V3 ו-V4 של חיידקים 16S rDNA. שימשו את הרצף הקדמי המכיל את "הסדרה" CCTACGGRGVGAAT "והפוך את התחל המכיל את הרצף" GGACTACNCGGGTWCC "במחקר הנוכחי.
- הפוך את התגובות PCR לתערובת על ידי הוספת 2.5 μL של מאגר 1, 2 μL של dNTPs, 1 μL של כל פריימר, 0.5 μL של DNA פולימראז, ו 20 ng של DNA תבנית בשפופרת. השתמש ddH2O כדי לכוונן את מערכת התגובה 25 μl.
- הגדר את הפרמטרים של תגובת ה-PCR כדלקמן: בצע את הקדם-הדנטורציה ב-94 ° צ' למשך 3 דקות פעם אחת. לבצע דנטורציה ב 94 ° c עבור 5 s, לספח ב 57 ° צ' עבור 90 s, להאריך ב 72 ° צ' עבור 10 s, ולחזור על זה 24x.
- בצע ברצף מזווג PE250/300 בהתאם להוראה של היצרן ולהשתמש QIIME ניתוח נתונים חבילת עבור ניתוח נתונים rRNA של 16S.
הערה: בניסוי זה, רצפי DNA וניתוח נתונים נעשו בעיקר על ידי החברה רצף מקצועי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הקמת TBI מופיעה באיור 1. לאחר הרדמה חיטוי, הקרקפת היה מsagittally (איור 1A). פתיחת גולגולת (בקוטר 3 מ"מ) הייתה מחוגלת לתוך הגולגולת על קליפת המוח הימנית עם מקדחה חשמלית, השכבה הייתה שלמה (איור 1B, C). מעבר לחלון העצם הונחה צינורית פלסטיק והיא הייתה מבטון לגולגולת בעזרת אקריליק שיניים (איור 1D).
התהליך של כלי הקשה לנוזלים לרוחב מוצג באיור 2. לפני תחילת המכשיר נבדק על ידי אספקת 10 פולסים עד שהוא נותן אות קבוע. זווית המטוטלת הותאמה לתנוחת ההתחלה כדי להגיע לעוצמת הפעימה של כ-2.0 כספומט (איור 2 א). הצינורית היתה מלאה בתמיסת. המלח הרגילה הסטרילית לאחר מכן הצינורית הייתה מחוברת להתקן LFPI (איור 2B). פגיעה מוחית נגרמה על ידי יצירת דחף לתוך חלל הגולגולת סגור (איור 2C).
באיור 3מוצגים אוסף הדגימות של הלפרוטומיה והקאנום. האונה בוצעה על הבטן התחתונה ולאורך קו האמצע (איור 3A). Caecum זוהה והופרד בעדינות (איור 3B, C). Caecum ממוקם בדרך כלל בחלק הימני התחתון של הבטן. לאחר מכן הוא הונצח במספריים חדים (איור 3D). תכולת caecum (איור 3E) חולצו ואוחסנו בצינורות 1.5 ML (איור 3e). דגימות צואה אוחסנו באופן מיידי ב-80 ° c לפני שימוש נוסף.
16S-rDNA רצף הפגין מגוון מופחת של caecum microbiota בעכברים 3 ימים לאחר TBI, מטקאה הנפוץ ביותר בתוכן caecum של קבוצות TBI הדמה הראו באיור 4. מבחן סכום הדירוג של Wilcoxon בוצע כדי להעריך הבדלים microbiota בין TBI וקבוצות הדמה בניתוח הרצף של 16, וערך p היה פחות מ 0.05. שינוי קנה מידה רב מימדי (NMDS) הראה גם הרכב שונה של caecum microbiota לאחר TBI (איור 5).
איור 1 : הקמת TBI. (א) לאחר הרדמה וחיטוי, הקרקפת היה מונצח. (ב) הפעלת פתיחת גולגולת מעגליות על הגולגולת מעל קליפת הקודקוד הימנית. (ג) לשמור על הדורא ללא פגע. (ד) מלט בצינורית הפציעה הפלסטית לגולגולת באמצעות אקריליק שיניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : ההליך של כלי הקשה נוזלי לרוחב. (א) התאמה של זווית מיקום המטוטלת. (ב) מילוי צינורית עם תמיסת מלח רגילה סטרילית, ולאחר מכן חיבור של צינורית למכשיר lfpi. (ג) לפגיעה במוח באמצעות שחרור המטוטלת ויצירת דחף לתוך חלל הגולגולת הסגור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : לפרוטומיה ולדוגמה caecum לדגימת צואה. (א) תחילת כריתת האונה מהבטן התחתונה ולאורך קו האמצע. (ב, ג) זיהוי של caecum ולאחר מכן (עדין) הסרה. (ד) חיתוך הcaecum עם מספריים חדים. (ה) חילוץ תוכן caecum. (ו) אחסון דגימות של תוכן caecum בצינורות 1.5 ML Eppendorf. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : השוואת הגיוון caecum מיקרוביוטה. הנפוץ ביותר מטקא בתוכן caecum של התחזות וקבוצות TBI הפגינו מגוון מופחת של caecum microbiota בעכברים 3 ימים לאחר TBI. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5 : ניתוח NMDS. שינוי קנה מידה רב-מימדי שאינו מטרי (NMDS) הראה הרכב שונה של caecum microbiota לאחר TBI. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מוצג כאן הוא פרוטוקול פשוט ויעיל כדי לקבוע שינויים במיקרוביוטה cecal לאחר TBI בעכברים. אינדוקציה של פגיעה מוחית ואיסוף של דגימות תוכן caecum הם חלקים קריטיים של הפרוטוקול.
למרות החוקרים לאחר שחקרו את השינויים של מיקרוביוטה בטן בעקבות TBI, הפגיעה במוח המשמש במחקרים אלה היו CCI-8 וירידה במשקל/ההשפעה מודלים9. עם זאת, מודל CCI בעיקר משכפל חבלה במוח, ומודל ירידה במשקל עלול לסבול ממספר אי-דיוקים. בין כל הדגמים הקיימים של פגיעה במוח, lfpi הוא המודל הנפוץ ביותר, אשר כולל פגיעה מוחית המוח מיקוד11,12 ו משכפל תכונות חשובות רבות נצפתה בחולים tbi קליני. הצעדים העיקריים לאורך התהליך כוללים הגנה על הדורא ושמירה על הצינורית האטומה. עם זאת, גם הפעלת הגולגולת וגם הקונגלוצינציה דורשים פעולה של מאמן מיומן, שעשוי להיות מגבלה של פרוטוקול זה. עם זאת, LFPI היא עדיין שיטה פשוטה, יציבה ומדויקת. לכן, TBI בעכברים המושרה באמצעות LFPI במחקר זה, מה שהופך את הפרוטוקול נציג יותר יקר ערך במחקר פגיעה במוח.
בדיקות מיקרו-מעיים, דגימות צואה שימשו עבור החלטיות שלה ונוחות. עם זאת, יש כמה מגבלות של דגימת צואה. ראשון, כמות הצואה שנאסף בכל עכבר בנקודת זמן מסוימת הוא קטן, ואת כמות הצואה עשוי להיות מספיק כדי לבצע ניתוח 16 s-rDNA. שנית, בשל תפקוד המערכת העיכול פוסט טראומטי, דגימות צואה קשה לאסוף במהלך השלב החריף לאחר פגיעה במוח (1 h לאחר פציעה במחקר זה). בנוסף, ראיות הראו כי הרכב microbiota צואה שונה מיקרוביוטה במקטעי מעיים אחרים13. לכן, תוכן caecum נאספו לניתוח מיקרוביוטה בטן במחקר זה. הדגימה התוכן caecum דורש כי העכברים הם הקריבו, ושיטה זו מאפשרת דגימה של מערכת העיכול עבור בדיקות היסטולוגית ואימונולוגיים, שהם היבטים מחקריים חשובים במחקרים של פגיעה במוח בתפקוד המעיים המושרה. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש כדי לחקור שינויים microbiota במערכת העיכול אחרים, כולל jejunum, ileum, ו המעי הגס. לסיכום, פרוטוקול זה הוא שיטה אידיאלית לחקר השינויים המושרה TBI במעיים מיקרוביוטה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים להודות בכנות Baohong וואנג על הדרכה טכנית שלה.
Acknowledgments
. למחברים אין מה לגלות
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA isolation kit | QIAGEN | 51604 | For fast purification of genomic DNA from stool samples |
| Gene analysis service | GENEWIZ | Gene analyse service | |
| Heating pad | Shanghai SAFE Biotech Co. | TR-200 | heating pad |
| Injector | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | injector | |
| LFPI device | Virginia Commonwealth University |
FP302 | LFPI device |
| Micro cranial drill | RWD Life Science | 78061 | Micro cranial drill |
| Povidone Iodine | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | Povidone Iodine |
References
- Cheng, P., et al. Trends in traumatic brain injury mortality in China, 2006-2013: A population-based longitudinal study. 14, e1002332 (2017).
- Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
- Gaddam, S. S., Buell, T., Robertson, C. S.
- Kabadi, S. V., et al. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
- Fung, T. C., Olson, C. A., Hsiao, E. Y. Interactions between the microbiota, immune and nervous systems in health and disease. Nature Neuroscience. 20, 145-155 (2017).
- Collins, S. M., Surette, M., Bercik, P. The interplay between the intestinal microbiota and the brain. Nature Reviews Microbiology. 10, 735-742 (2012).
- Cryan, J. F., Dinan, T. G. Mind-altering microorganisms: the impact of the gut microbiota on brain and behaviour. Nature Reviews Neuroscience. 13, 701-712 (2012).
- Nicholson, S. E., et al. Moderate Traumatic Brain Injury Alters the Gastrointestinal Microbiome in a Time-Dependent. Shock. , (2018).
- Houlden, A., et al. Brain injury induces specific changes in the caecal microbiota of mice via altered autonomic activity and mucoprotein production. Brain, Behavior, and Immunity. 57, 10-20 (2016).
- Treangen, T. J., et al. Traumatic Brain Injury in Mice Induces Acute Bacterial Dysbiosis Within the Fecal Microbiome. Frontiers in Immunology. 9, 2757 (2018).
- Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral fluid percussion: model of traumatic brain injury in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Thompson, H. J., et al. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. Journal of Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).
- Pang, W., Vogensen, F. K., Nielsen, D. S., Hansen, A. K. Faecal and caecal microbiota profiles of mice do not cluster in the same way. Laboratory Animals. 46, 231-236 (2012).
