Summary
ここに提示されるのは、横液パーカッション装置を用いて拡散性外傷性脳損傷を誘導するプロトコルであり、続いて腸内微生物叢分析のためのcaecum含有量の収集である。
Abstract
増加する証拠は、微生物叢-腸-脳軸が脳疾患の病因に重要な役割を果たしていることを示しています。いくつかの研究はまた、外傷性脳損傷が腸内微生物叢に変化を引き起こすことを示しています。しかし、脳腸軸の双方向調節の根底にあるメカニズムは未知のままである。現在、外傷性脳損傷後の腸内微生物叢の変化を研究するためのモデルはほとんどない。したがって、今回の研究では、横液パーカッション装置を用いて外傷性脳損傷を誘発するプロトコルと、腸内微生物叢の変化を調べた後のケカムサンプルの分析を組み合わせたものである。外傷性脳損傷後の腸内微生物叢組成物の変化は、16S-rDNAシーケンシングを用いて決定される。このプロトコルは、腸内微生物と外傷性脳損傷との関係を研究するための効果的な方法を提供する。
Introduction
外傷性脳損傷(TBI)は、世界的な公衆衛生上の問題であり、若年成人の死亡および障害の主な原因である1,2.TBIは毎年多くの死を引き起こし、生存者は様々な身体的、精神的、感情的、認知障害を経験します。したがって、TBIは患者の家族や社会資源に大きな負担です。TBIは、外傷時に発生する一次脳損傷と、最初の損傷の後に数時間から数ヶ月に発症する二次脳損傷の両方を含む。二次脳損傷は、脳に有害であるだけでなく、消化器系3を含む様々な臓器系に重大な悪影響を及ぼすいくつかの生化学的カスケードによって媒介される。
現在、動物実験でTBIを誘導するモデルは、流体パーカッション損傷、制御皮質衝撃(CCI)、体重減少加速の3つのモデルがあります。横液パーカッション傷害(LFPI)は、拡散性脳損傷(DAI)4を確立するために最も一般的に使用されるモデルである。装置は無傷の硬膜に短い流体圧力の脈拍を加えることによって頭蓋切開を通して脳損傷を作り出す。このパルスは振り子のストライクによって作成されます。LFPIはTBI研究のための再生可能で制御可能なモデリング方法である。
マイクロバイオームは、人体に存在するすべての微生物の集合的ゲノムとして定義されます。特に腸内微生物は、腸恒常性および機能において重要な役割を果たすだけでなく、宿主生理学および他の器官の機能の多くの側面を調節する5。近年、腸内微生物叢が脳腸軸6を介して脳の発達と機能を調節することを示す証拠が増えている。腸内細菌叢の破壊は、パーキンソン病、気分障害、および自閉症7を含むいくつかの脳機能障害にリンクされています。最近、前臨床研究はまた、急性脳損傷が腸内微生物叢8、9の変化を誘発しうることも報告されている。
Treangen et al.10による研究では、3つの微生物種で有意な減少が見られ、CCI誘発TBI後の2つの微生物種の増加が見られた。この証拠は、腸内微生物叢の変調がTBI管理における治療方法でありうっていう。しかし、脳損傷によって引き起こされる腸内微生物叢の変化の根底にあるメカニズムは未知のままである。このため、TBI後の腸内微生物叢の変化を研究する比較的単純で効率的なモデルが必要である。そこで本研究は、マウスにおけるTBI後の腸内微生物叢の変化を調べるプロトコルを提示する。
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Protocol
行われたすべての手順は、浙江大学の実験動物倫理委員会によって承認されました.手術に使用されるすべての器械および材料は無菌である。TBIプロセドレは約20分かかります。
1. 動物の世話
- この実験では、5~6週齢の雄C57BL/6Jマウス(体重20~25g)を使用します。
- 12時間/12時間の光/暗いサイクルでマウスを維持し、彼らは食べ物と水のアドリビタムを受け取ることを確認してください。研究を通じてシャムとTBIグループの両方に同じ量の食料と水を提供します。
- 動物の痛みや不快感を最小限に抑えるためにあらゆる努力をしてください。
2. 外傷性脳損傷の誘導
- 麻酔のためのケタミン(80-100 mg/kg)/キシラジン(10 mg/kg)IPを注入します。目の反射または痛み反射を使用して麻酔の深さをテストします。人工涙剤や潤滑剤の目のチントを使用して、目が乾燥するのを防ぐ。
- 麻酔の後、マウスを傾向のある位置に置きます。手術中に37°Cで温度を維持し、TBI後30分間温度を維持するために温度制御された加熱パッドを使用してください。
- 切開部の毛を剃ります。
- 3つの交互のスクラブを使用して70%のエタノールで頭皮を消毒し、その後、矢状面で頭皮を切開します。
- 鉗子を使用して両側の切開を撤回し、骨膜をわずかに分離します。
- マーカーを使用して、頭蓋骨の右頭頂部に円(直径3mm)を描き、中間線から2mm離します。
- 電気ドリルで頭蓋骨をドリルします。この手順は、デュラが損傷しないように注意深く操作されていることを確認します。
- ボーン フラップを取り外し、小さなボーン ウィンドウ (直径 3 mm) を露出します。
- プラスチック傷害カニューレ(内径=2.5mm、長さ=8mm)を頭蓋切開の上に置き、歯科用アクリルを使用して頭蓋骨にカニューレをセメントします。
- カニューレにシリンジ(5mL)を使用して無菌0.9%NaCl(通常の生理生理)でカニューレを充填し、カニューレに気泡がないことを確認します。
- オシロスコープとアンプの電源を入れ、横液パーカッション損傷(LFPI)装置の高圧チューブに気泡がないことを確認します。安定した信号が出るまで約10パルスを送り、デバイスをテストします。振り子の開始位置の角度を調整して、約 2.0 atm のパルス強度に達します。
- 傷害カニューレをLFPIデバイスに接続します。引き金を引いて振り子を放出して脳損傷を誘発する。次に、パルスを得て、閉じた流体充填チューブシステム全体を介してデュラに送信する。
- 同じ外科的処置でシャム群のマウスを操作する。LFPI を実行しないでください。
3. 手術後の治療
- 脳損傷を誘発した後、プラスチックカニューレを取り除き、切開部を縫合する。手術中にブプレノルフィン(2mg/kg)SQまたはIPを投与し、その後3日間6〜12時間ごとに投与する。
- マウスを歩行になるまで加熱パッドの上に置きます。麻酔蘇生を加速するために、加熱パッドの温度を37°Cに設定します。
- ケージにマウスを戻し、食べ物と水のアドリビタムを管理します。
4. 腹腔内および盲検からのサンプルコレクション
- CO2でマウスを安楽死させ、続いて対応する時点で子宮頸部脱臼を行う。
注:この実験では、選択された時間ポイントは、腸内微生物叢の動的進化を分析するために、1時間、6時間、1d、3d、および7d外傷後脳損傷であった。 - 腹部の表面から毛髪を取り除きます。70%のエタノールで腹部を消毒する。
- マウスの上に生殖不能のドレープを置きます。雄マウスのプレペスのすぐ上の下腹部中線から切開を行う。
- 腸が露出した後、盲腸を見つけ、他の腸管から穏やかに分離します。歯や鋭い鉗子で盲検をつかまないようにしてください。Adson鉗子のような外傷性鉗子を使用する。
- 鋭いはさみでカカムを切ります。
- 無菌ドレッシングに手動でケカム内容物を抽出し、1.5mLマイクロ遠心管に内容物を保存します。
- マイクロバイオーム分析まで-80°Cでカカム内容物を保存します。
5. DNA抽出と16S-rDNAシーケンシングとデータ解析
-
FECからのDNAの分離
注:この実験には市販のDNA単離キット(材料の表)を使用しました。- メスを使用して、2 mLマイクロ遠心管で300mgの便を掻き取り、チューブを氷の上に置きます。
- 各サンプルに1 mLの阻害バッファーを追加します。渦は1分間連続的に、または便料サンプルが完全に均質化されるまで続行する。
- 最大速度でサンプルを遠心分離し、1分間、便の粒子をペレットします。
- ピペット2 μLのプロテインサーゼKを新しい2mLマイクロ遠心管に入れた。ステップ5.1.3からプロテインサーゼKを含有する2mLマイクロ遠心管に上清のピペ状600μL。次に、バッファ1の600 μLと15sの渦を加えます。
- 試料を70°Cで10分間インキュベートします。
- 100%エタノールの600μLをリサート(1:1比)に加え、渦で混ぜます。チューブのふたの内側から滴を取り除くために、最高速度で短時間遠心分離機。
- ライサテの600 μLをスピンカラムに塗布します。最大速度で1分間遠心分離機は、フロースルーを破棄します。この手順をもう一度繰り返します。次に、カラムを新しい2 mL回収管に移します。
- スピンカラムを開き、バッファ2の500 μLを追加します。1分間の最高速度で遠心分離機カラムを取り外し、新しい2 mLコレクションチューブに入れます。
- 列にバッファ 3 の 500 μL を追加します。最大速度で3分間遠心分離機は、フロースルーを破棄します。遠心分離プロセスを 1 回繰り返して、バッファ 3 が完全に elfus であることを確認します。
- スピンカラムを新しいチューブ2 mLコレクションチューブに入れ、バッファー4のピペット200 μLを膜上に直接置きます。室温(RT)で1分間インキュベートし、その後、DNAを溶出させるために1分間の最高速度で遠心分離機を行います。
-
16S-rDNAシーケンシングとデータ解析
- アンプリコンを生成するには、20~30 ngのDNAを使用します。
- 細菌16S rDNAのV3およびV4超可変領域に隣接する比較的保存された領域用に設計された市販のプライマーを使用してください。本研究では、配列「CCTACGGRRBGCASCAGKVRGAAT」および配列を含むリバースプライマー「GGACTACNVGGWTWTACTACC」を含む前方プライマーを用いた。
- バッファー1の2.5 μL、dNTPの2μL、各プライマーの1 μL、DNAポリメラーゼの0.5 μL、およびチューブ内のテンプレートDNAの20ngを加えて、PCR反応を混合します。ddH2O を使用して、反応システムを 25 μL に調整します。
- PCR反応パラメータを次のように設定する:94°Cで予め3分間脱退を行う。5sの94 °Cで脱退を行い、90sの57°Cでアニールを行い、10sのために72°Cで延長し、この24倍を繰り返します。
- 製造元の指示に従って PE250/300 ペアエンド シーケンスを実行し、16S rRNA データ分析に QIIME データ分析パッケージを使用します。
注:この実験では、DNAシーケンシングとデータ分析は、主に専門のシーケンシング会社によって行われました。
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Representative Results
TBI の確立を図 1 に示します。麻酔および消毒の後、頭皮を矢状に切開した(図1A)。開頭術(直径3mm)を電気ドリルで右頭蓋皮質上の頭蓋骨にトレフィンし、硬膜をそのままに保った(図1B,C)。プラスチック損傷カニューレを骨窓の上に置き、歯科アクリルを使用して頭蓋骨に接その他のセメントを付けた(図1D)。
横液パーカッションの手順を図2に示す。装置を開始する前に、安定した信号を与えるまで約10パルスを送ることによって試験した。振り子の角度を開始位置に調整し、約2.0atmのパルス強度に達した(図2A)。カニューレは無菌正常生理理生理で満たされた。次に、カニューレはLFPIデバイスに接続されました(図2B)。脳損傷は、閉じた頭蓋腔内にインパルスを作り出すことによって誘発された(図2C)。
腹腔内および精液のフェカルサンプルコレクションを図3に示す。腹腔内膜には下腹部と中線に沿って行った(図3A)。caecumを同定し、穏やかに分離した(図3B、C)。カセムは通常、腹部の右下部に位置しています。その後、鋭いはさみで切開した(図3D)。caecum(図3E)の内容物を抽出し、1.5mLチューブ(図3F)に保存した。フェカルサンプルは、さらなる使用前に-80°Cで直ちに保存した。
16S-rDNAシーケンシングは、TBIの3日後にマウスにおけるカエカム微生物叢の多様性の減少を実証し、シャムおよびTBI群のカカム内容物において最も豊富なタキサを図4に示した。ウィルコクソンランク合計検定は、16Sシーケンシング解析におけるTBIとシャム基の微生物叢差を評価するために行われ、p値は0.05未満であった。非メートル法多次元スケーリング(NMDS)はまた、TBI後のカカム微生物叢の組成の変化を示した(図5)。
図 1: TBIの設立(A)麻酔および消毒後、頭皮を切開した。(B)右頭蓋皮質の上に頭蓋骨の周頭開頭術を操作する。(C)デュラはそのままにしておきます。(D)歯科アクリルを用いて頭蓋骨にプラスチック傷害カニューレをセメント化する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:横液パーカッションの手順。(A)振り子の開始位置角度の調整。(B)無菌正常生理生殖不能でカニューレを充填し、次に、カニューレをLFPI装置に接続する。(C)振り子の放出による脳損傷誘導および閉じた頭蓋腔へのインパルスの作成。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 腹腔および精液のフェカルサンプルコレクション。(A)下腹部および中線に沿った腹腔切除術の開始。(B,C)盲液とその後の(穏やかな)除去の同定。(D)鋭いはさみでカカムを切断する。(E)カエカムの内容物の抽出。(F)1.5 mLエッペンドルフチューブに含有体サンプルを保存する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: カエカム微生物叢多様性の比較シャムおよびTBI群のカカム含有量における最も豊富なタキサは、TBIの3日後にマウスにおけるカカム微生物叢の多様性の減少を示した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: NMDS 分析。非メートル法多次元スケーリング(NMDS)は、TBI後のカカム微生物叢の組成の変化を示した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、マウスのTBI後のセカル微生物叢の変化を決定するための簡単で効率的なプロトコルです。脳損傷の誘導とカエカム含有量サンプルの収集は、プロトコルの重要な部分です。
TBIに続く腸内微生物叢の変化を研究した研究者にもかかわらず、これらの研究で使用される脳損傷はCCI-8および体重低下/衝撃誘発モデル9であった。しかし、CCIモデルは主に脳挫傷を複製し、体重減少モデルはいくつかの不正確さに苦しむかもしれません。すべての既存の脳損傷モデルの中で、LFPIは、焦点および拡散性脳損傷11、12を含む最も一般的に使用されるモデルであり、臨床TBI患者で観察される多くの重要な特徴を複製する。プロセス全体の主要なステップは、硬膜の保護とカニューレの気密性を維持することが含まれます。しかし、開頭術と凝集の両方は、このプロトコルの制限でありうたく熟練した演奏者の操作を必要とする。ただし、LFPI は依然として単純で安定した正確な方法です。したがって、マウスのTBIは、本研究でLFPIを用いて誘導され、脳損傷研究においてプロトコルがより代表的かつ価値のあるプロトコルとなる。
腸内微生物叢分析のために、その非侵襲性および利便性のためにfecalサンプルが使用された。それにもかかわらず、フェカルサンプリングにはいくつかの制限があります。まず、一定の時点で各マウスで採取される便の量が少なくて、16S-rDNA分析を行うにはFECの量が不十分な場合があります。第二に、外傷後胃腸機能障害のために、脳損傷後の急性期(本研究では1時間後の損傷)の間に採取が困難である。加えて、証拠は、フェカル微生物叢組成物が他の腸セグメント13において微生物叢と異なっていることを示している。そこで、本研究では腸内微生物叢分析のためにカセム内容物を採取した。Caecum含有量サンプリングは、マウスを犠牲にする必要があり、この方法は、脳損傷誘発性腸機能障害の研究における重要な研究側面である組織学的および免疫学的検査のための腸管のサンプリングを可能にする。さらに、この方法は、ジェジュナム、回腸、結腸を含む他の消化管における微生物叢の変化を調べるために使用することができる。結論として、このプロトコルは腸内微生物叢におけるTBI誘発変化を研究するための理想的な方法である。
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Disclosures
著者は、彼女の技術的な指導のためにBaohong Wangに心から感謝します。
Acknowledgments
著者は何も開示していない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA isolation kit | QIAGEN | 51604 | For fast purification of genomic DNA from stool samples |
| Gene analysis service | GENEWIZ | Gene analyse service | |
| Heating pad | Shanghai SAFE Biotech Co. | TR-200 | heating pad |
| Injector | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | injector | |
| LFPI device | Virginia Commonwealth University |
FP302 | LFPI device |
| Micro cranial drill | RWD Life Science | 78061 | Micro cranial drill |
| Povidone Iodine | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | Povidone Iodine |
References
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