Summary
Präsentiert hier ist ein Protokoll, um diffuse traumatische Hirnverletzungen mit einem lateralen Fluid Percussion-Gerät gefolgt von der Sammlung des Caecum-Gehalts für Darm-Mikrobiom-Analyse induzieren.
Abstract
Zunehmende Erkenntnisse zeigen, dass die Mikrobiota-Darm-Gehirn-Achse eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von Hirnerkrankungen spielt. Mehrere Studien zeigen auch, dass traumatische Hirnverletzungen Veränderungen der Darmmikrobiota verursachen. Jedoch, Mechanismen, die der bidirektionalen Regulation der Gehirn-Darm-Achse zugrunde liegen, bleiben unbekannt. Derzeit gibt es nur wenige Modelle für die Untersuchung der Veränderungen in Darm-Mikrobiota nach traumatischen Hirnverletzungen. Daher kombiniert die vorgestellte Studie Protokolle zur Induktion traumatischer Hirnverletzungen mit einem lateralen Fluid Percussion-Gerät und die Analyse von Caecum-Proben nach Verletzungen zur Untersuchung von Veränderungen im Darmmikrobiom. Veränderungen der Darmmikrobiotazusammensetzung nach traumatischen Hirnverletzungen werden mittels 16S-rDNA-Sequenzierung bestimmt. Dieses Protokoll bietet eine effektive Methode zur Untersuchung der Beziehungen zwischen enterischen Mikroorganismen und traumatischen Hirnverletzungen.
Introduction
Traumatische Hirnverletzungen (TBI) sind ein globales Problem der öffentlichen Gesundheit und die häufigste Todesursache bei jungen Erwachsenen1,2. TBI verursacht jedes Jahr viele Todesfälle, und Überlebende erleben eine Vielzahl von körperlichen, psychiatrischen, emotionalen und kognitiven Behinderungen. Daher ist TBI eine schwere Belastung für die Familiären und gesellschaftlichen Ressourcen eines Patienten. TBI beinhaltet sowohl die primäre Hirnverletzung, die zum Zeitpunkt des Traumas auftritt, als auch alle sekundären Hirnverletzungen, die Stunden bis Monate nach einer anfänglichen Verletzung entstehen. Sekundäre Hirnverletzungen werden durch mehrere biochemische Kaskaden vermittelt, die nicht nur schädlich für das Gehirn sind, sondern auch erhebliche negative Auswirkungen auf verschiedene Organsysteme haben, einschließlich des Magen-Darm-Systems3.
Derzeit gibt es drei Modelle, um TBI in Tierversuchen zu induzieren: Flüssigkeitspercussion-Verletzung, Kontrolle kortikaler Auswirkungen (CCI) und Gewichtsabnahmebeschleunigung. Lateral Fluid Percussion Injury (LFPI) ist das am häufigsten verwendete Modell, um diffuse Hirnverletzungen (DAI) zu etablieren4. Das Gerät verursacht Hirnverletzungen durch eine Kraniektomie, indem es einen kurzen Flüssigkeitsdruckimpuls auf die intakte Dura aufträgt. Dieser Impuls entsteht durch den Schlag des Pendels. LFPI ist eine reproduzierbare und kontrollierbare Modellierungsmethode für die TBI-Forschung.
Das Mikrobiom ist definiert als das kollektive Genom aller Mikroorganismen, die sich im menschlichen Körper befinden. Insbesondere Darmmikroben spielen nicht nur eine wichtige Rolle bei der Darmhomöostase und Funktion, sondern regulieren auch viele Aspekte der Wirtsphysiologie und der Funktion anderer Organe5. In den letzten Jahren, Es gibt zunehmend Hinweise, die darauf hindeuten, dass Darm-Mikrobiota reguliere Gehirnentwicklung und Funktion über Gehirn-Darm-Achsen6. Störung der Darmmikrobiota wurde mit mehreren Gehirnfunktionsstörungen einschließlich Parkinson-Krankheit, affektive Störungen, und Autismus7verbunden. Kürzlich, präklinische Studien haben auch berichtet, dass akute Hirnverletzungen Veränderungen in der Darmmikrobiotainduzierenkönnen 8,9.
Eine Studie von Treangen et al.10 fand signifikante Abnahmen bei drei mikrobiellen Arten und Erhöht bei zwei mikrobiellen Arten nach CCI-induziertem TBI. Diese Beweise deuten darauf hin, dass die Modulation von Darmmikrobiota eine therapeutische Methode im TBI-Management sein kann. Jedoch, die Mechanismen zugrunde Hirnverletzung-induzierte Darm-Mikrobiota Veränderungen bleiben unbekannt. Aus diesem Grund ist ein relativ einfaches und effizientes Modell zur Untersuchung der Veränderungen der Darmmikrobiota nach TBI erforderlich. Daher präsentiert die vorliegende Studie ein Protokoll zur Untersuchung von Veränderungen in Darmmikrobiota nach TBI bei Mäusen.
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Protocol
Alle durchgeführten Verfahren wurden von der Experimental Animal Ethics Committee der Zhejiang University genehmigt. Alle Instrumente und Materialien, die in der Chirurgie verwendet werden, sind steril. Das TBI-Proceudre dauert ca. 20 Minuten.
1. Tierpflege
- Verwenden Sie 5- bis 6 Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse (20-25 g Gewicht) in diesem Experiment.
- Halten Sie Mäuse auf einem 12 h/12 h Licht/Dunkel-Zyklus, und stellen Sie sicher, dass sie Nahrung und Wasser ad libitum erhalten. Stellen Sie die gleichen Mengen an Nahrung und Wasser sowohl für die Schein- als auch für die TBI-Gruppe während der gesamten Studie bereit.
- Machen Sie alle Anstrengungen, um die Schmerzen und Beschwerden der Tiere zu minimieren.
2. Induktion traumatischer Hirnverletzungen
- Injektion Ketamin (80-100 mg/kg)/Xylazin (10 mg/kg) IP zur Anästhesie. Testen Sie die Tiefe der Anästhesie mit einem Augenreflex oder Schmerzreflex. Verwenden Sie künstliche Tränen oder Schmiermittel Augensalbe, um die Augen vor dem Trocknen zu halten.
- Nach der Anästhesie, setzen Sie die Maus in anfällige Position. Verwenden Sie ein temperaturgeregeltes Heizkissen, um die Temperatur während der Operation und 30 min nach TBI bei 37 °C zu halten.
- Rasieren Sie die Haare des Schnittbereichs.
- Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit 70% Ethanol mit drei abwechselnden Peelings, dann incise die Kopfhaut in einer sagittalen Ebene.
- Verwenden Sie Zangen, um den Einschnitt auf beiden Seiten zurückzuziehen und das Periost leicht zu trennen.
- Verwenden Sie einen Marker, um einen Kreis (3 mm Durchmesser) auf dem rechten parietalen Bereich des Schädels, 2 mm von der Mittellinie entfernt, zu zeichnen.
- Bohren Sie den Schädel mit einem elektrischen Bohrer. Stellen Sie sicher, dass dieser Schritt sorgfältig durchgeführt wird, um die Dura vor Beschädigungen zu schützen.
- Entfernen Sie die Knochenklappe und legen Sie ein kleines Knochenfenster (3 mm Durchmesser) zur Bedeckung.
- Legen Sie eine Plastikverletzungskanüle (Innendurchmesser = 2,5 mm, Länge = 8 mm) über die Kraniotomie und zementieren Sie die Kanüle mit einem Zahnacryl zum Schädel.
- Füllen Sie die Kanüle mit sterilen 0,9% NaCl (normale Saline) mit einer Spritze (5 ml), um sicherzustellen, dass es keine Blasen in der Kanüle.
- Schalten Sie das Oszilloskop und den Verstärker ein und stellen Sie sicher, dass das Hochdruckrohr der LFPI-Vorrichtung (Lateral Fluid Percussion Injury) frei von Luftblasen ist. Testen Sie das Gerät, indem Sie etwa 10 Impulse liefern, bis es ein stetiges Signal aussendet. Stellen Sie den Winkel der Pendelstartposition so ein, dass eine Pulsintensität von etwa 2,0 atm erreicht wird.
- Schließen Sie die Verletzungskanüle an das LFPI-Gerät an. Induzieren Sie Hirnverletzungen, indem Sie den Auslöser ziehen und das Pendel loslassen. Dann erhalten Sie einen Impuls und übertragen Sie ihn über das gesamte geschlossene, mit Flüssigkeit gefüllte Schlauchsystem an die Dura.
- Betreiben Sie die Mäuse in der Scheingruppe mit dem gleichen chirurgischen Verfahren. Führen Sie den LFPI nicht aus.
3. Post-Chirurgie-Behandlung
- Nach der Induktion der Hirnverletzung, entfernen Sie die Kunststoffkanüle und Verschließen Sie den Schnitt. Während der Operation verabreichen Buprenorphin (2mg/kg) SQ oder IP und danach alle 6-12 h für drei Tage.
- Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen, bis es ambulant ist. Stellen Sie die Temperatur des Heizkissens auf 37 °C ein, um die Anästhesiezung zu beschleunigen.
- Legen Sie die Maus wieder in den Käfig und verabreichen Sie Nahrung und Wasser ad libitum.
4. Laparotomie und Probensammlung aus dem Caecum
- Euthanisieren Sie die Mäuse durch CO2, gefolgt von zervikalen Dislokationen zu den entsprechenden Zeitpunkten.
HINWEIS: In diesem Experiment waren die ausgewählten Zeitpunkte 1 h, 6 h, 1 d, 3 d und 7 d posttraumatische Hirnverletzungen, um die dynamische Entwicklung der Darmmikrobiota zu analysieren. - Entfernen Sie das Haar von der Oberfläche des Bauches. Desinfizieren Sie den Bauch mit 70% Ethanol.
- Legen Sie einen sterilen Vorhang über die Maus. Machen Sie einen Schnitt von der unteren Bauchmittellinie, knapp über der Präbiss in den männlichen Mäusen.
- Nachdem der Darm exponiert ist, lokalisieren Sie das Cecum und trennen Sie es sanft von anderen Darmtrakten. Vermeiden Sie es, das Cecum mit verzahnten oder scharfen Zangen zu greifen. Verwenden Sie atraumatische Zangen, wie Z. B. Adson-Zangen mit Serrationen.
- Schneiden Sie das Caecum mit einer scharfen Schere.
- Den Caecuminhalt manuell auf sterile Verbande extrahieren und in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen aufbewahren.
- Bewahren Sie den Caecumgehalt bei -80 °C bis zur Mikrobiomanalyse auf.
5. DNA-Extraktion und 16S-rDNA-Sequenzierung und Datenanalyse
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Isolierung von DNA aus Kot
HINWEIS: Für dieses Experiment wurde ein handelsübliches DNA-Isolationskit (Materialtabelle) verwendet.- Verwenden Sie ein Skalpell, um 300 mg Kot in einem 2 ml Mikrozentrifugenrohr zu kratzen und legen Sie das Rohr auf Eis.
- Fügen Sie jeder Probe 1 ml Inhibitionspuffer hinzu. Wirbel kontinuierlich für 1 min oder bis die Fäkalienprobe gründlich homogenisiert ist.
- Zentrifugieren Sie die Probe mit der maximalen Geschwindigkeit von 1 min, um die Fäkalienpartikel zu pelleten.
- Pipette 2 l Proteinase K in ein neues 2 ml Mikrozentrifugenrohr. Pipetten Sie 600 l des Überstandes von Schritt 5.1.3 in das 2 ml Mikrozentrifugenrohr mit Proteinase K. Fügen Sie dann 600 l Puffer 1 und Wirbel für 15 s hinzu.
- Inkubieren Sie die Probe bei 70 °C für 10 min.
- Fügen Sie dem Lysat (1:1-Verhältnis) 600 l 100 % Ethanol hinzu und mischen Sie es durch Wirbeln. Zentrifuge mit der maximalen Geschwindigkeit kurz, um Tropfen aus der Innenseite des Rohrdeckels zu entfernen.
- Tragen Sie 600 l des Lysats auf die Spinspalte auf. Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 1 min. Entsorgen Sie den Durchfluss. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. Übertragen Sie dann die Säule in ein neues 2 ml-Sammelrohr.
- Öffnen Sie die Spin-Spalte, und fügen Sie 500 L Puffer 2 hinzu. Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 1 min. Entfernen Sie die Säule und legen Sie sie in ein neues 2 ml Sammelrohr.
- Fügen Sie der Spalte 500 L Puffer 3 hinzu. Zentrifuge bei der maximalen Geschwindigkeit für 3 min. Entsorgen Sie den Durchfluss. Wiederholen Sie den Zentrifugationsprozess einmal, um sicherzustellen, dass der Puffer 3 vollständig eluiert ist.
- Legen Sie die Spinsäule in ein neues Rohr 2 ml Sammelrohr und Pipette 200 l Puffer 4 direkt auf die Membran. 1 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren, dann zentrifugieren mit der maximalen Geschwindigkeit für 1 min, um die DNA zu entwerten.
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16S-rDNA-Sequenzierung und Datenanalyse
- Verwenden Sie 20-30 ng DNA, um Amplicons zu erzeugen.
- Verwenden Sie handelsübliche Primer, die für die relativ konservierten Regionen an grenzend an die hypervariablen V3- und V4-Regionen von Bakterien 16S rDNA entwickelt wurden. In der vorliegenden Studie wurden die Vorwärtsprimer mit der Sequenz "CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT" und Reverse Primer mit der Sequenz "GGACTACNVGGGTWTCTAATCC" verwendet.
- Machen Sie die PCR-Reaktionen mischung, indem Sie 2,5 l Puffer 1, 2 l dNTPs, 1 l jedes Primers, 0,5 l DNA-Polymerase und 20 ng Vorlagen-DNA in einem Rohr hinzufügen. Verwenden Sie ddH2O, um das Reaktionssystem auf 25 l einzustellen.
- Stellen Sie die PCR-Reaktionsparameter wie folgt ein: Führen Sie die Vordenaturierung bei 94 °C für 3 min einmal durch. Denaturierung bei 94 °C für 5 s, Aneal bei 57 °C für 90 s, bei 72°C für 10 s ausdehnen und 24x wiederholen.
- Führen Sie die PE250/300-Gekoppeltendsequenzierung gemäß der Anweisung des Herstellers durch und verwenden Sie das QIIME-Datenanalysepaket für die 16S rRNA-Datenanalyse.
HINWEIS: In diesem Experiment wurden die DNA-Sequenzierung und Datenanalyse in erster Linie von einem professionellen Sequenzierungsunternehmen durchgeführt.
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Representative Results
Die Einrichtung von TBI ist in Abbildung 1dargestellt. Nach Anästhesie und Desinfektion wurde die Kopfhaut sagittisch eingeschnitten (Abbildung 1A). Eine Kraniotomie (3 mm Durchmesser) wurde mit einem elektrischen Bohrer über den rechten parietalen Kortex in den Schädel gezerrt, die Dura wurde intakt gehalten (Abbildung 1B, C). Eine Plastikverletzungskanüle wurde über das Knochenfenster gelegt und mit Zahnacryl am Schädel zementiert (Abbildung 1D).
Das Verfahren der lateralen Fluidpercussion ist in Abbildung 2dargestellt. Vor dem Start wurde das Gerät getestet, indem es etwa 10 Impulse lieferte, bis es ein stetiges Signal ausgibt. Der Winkel des Pendels wurde an die Ausgangsposition angepasst, um eine Pulsintensität von etwa 2,0 atm zu erreichen (Abbildung 2A). Die Kanüle wurde mit der sterilen normalen Saline gefüllt. Dann wurde die Kanüle an das LFPI-Gerät angeschlossen (Abbildung 2B). Eine Hirnverletzung wurde durch die Schaffung eines Impulses in die geschlossene Schädelhöhle induziert (Abbildung 2C).
Laparotomie und Caecum-Fäkalien-Probensammlung sind in Abbildung 3dargestellt. Die Laparotomie wurde am Unterbauch und entlang der Mittellinie durchgeführt (Abbildung 3A). Das Caecum wurde identifiziert und sanft getrennt (Abbildung 3B,C). Das Caecum befindet sich in der Regel im unteren rechten Teil des Bauches. Es wurde dann mit einer scharfen Schere eingeschnitten (Abbildung 3D). Der Inhalt von Caecum (Abbildung 3E) wurde extrahiert und in 1,5 ml-Rohren gelagert (Abbildung 3F). Fäkalproben wurden vor der weiteren Anwendung sofort bei -80 °C gelagert.
16S-rDNA-Sequenzierung zeigte eine reduzierte Vielfalt der Caecum-Mikrobiota bei Mäusen 3 Tage nach TBI, die am häufigsten vorkommende Taxa in Caecum-Gehalt von Schein- und TBI-Gruppen wurden in Abbildung 4gezeigt. Der Wilcoxon-Rangsummentest wurde durchgeführt, um Mikrobiota-Unterschiede zwischen TBI- und Scheingruppen in der 16S-Sequenzierungsanalyse zu bewerten, und der p-Wert war kleiner als 0,05. Die nicht-metrische mehrdimensionale Skalierung (NMDS) zeigte auch eine veränderte Zusammensetzung der Caecum-Mikrobiota nach TBI (Abbildung 5).
Abbildung 1 : Gründung von TBI. (A) Nach Anästhesie und Desinfektion wurde die Kopfhaut eingeschnitten. (B) Betreiben Sie eine zirkulatierte Kraniotomie auf dem Schädel über dem rechten parietalen Kortex. (C) Bewahren Sie die Dura intakt auf. (D) Zementieren Sie die Plastikverletzungskanüle am Schädel mit Zahnacryl. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Das Verfahren der lateralen Fluidpercussion. (A) Einstellung des Pendelstartwinkels. (B) Befüllen der Kanüle mit steriler Normalkochsel, dann Anschluss der Kanüle an die LFPI-Vorrichtung. (C) Hirnverletzungsinduktion durch Freisetzung des Pendels und Erzeugung eines Impulses in die geschlossene Schädelhöhle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Laparotomie und Caecum-Fäkalien-Probensammlung. (A) Beginn der Laparotomie aus dem Unterbauch und entlang der Mittellinie. (B,C) Identifizierung des Caecums und anschließende (sanfte) Entfernung. (D) Schneiden des Caecums mit scharfer Schere. (E) Extraktion des Inhalts von Caecum. (F) Lagerung der Caecum-Gehaltsproben in 1,5 mL Eppendorf-Rohren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : Der Vergleich der Cecum-Mikrobiota-Vielfalt. Am häufigsten gab es Taxa im Caecumgehalt von Schein- und TBI-Gruppen, die 3 Tage nach TBI eine geringere Vielfalt der Caecum-Mikrobiota bei Mäusen zeigten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5 : Die NMDS-Analyse. Nicht-metrische mehrdimensionale Skalierung (NMDS) zeigte eine veränderte Zusammensetzung der Caecum-Mikrobiota nach TBI. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Hier wird ein einfaches und effizientes Protokoll zur Bestimmung von Veränderungen der cecal microbiota nach TBI bei Mäusen vorgestellt. Die Induktion von Hirnverletzungen und die Entnahme von Caecum-Gehaltsproben sind wichtige Bestandteile des Protokolls.
Obwohl Forscher die Veränderungen der Darmmikrobiota nach TBI untersucht haben, waren die in diesen Studien verwendeten Hirnverletzungen CCI-8 und Gewichtstropfen/Impact-induzierte Modelle9. Jedoch, das CCI-Modell reproduziert meist GehirnPrellung, und das Gewicht-Tropfen-Modell kann unter einigen Ungenauigkeiten leiden. Unter allen bestehenden Hirnverletzungsmodellen ist LFPI das am häufigsten verwendete Modell, das fokale und diffuse Hirnverletzungen11,12 umfasst und viele wichtige Merkmale repliziert, die bei klinischen TBI-Patienten beobachtet wurden. Zu den wichtigsten Schritten während des gesamten Prozesses gehören der Schutz der Dura und die Luftbeständigkeit der Kanüle. Sowohl die Kraniotomie als auch die Konglutination erfordern jedoch den Betrieb eines erfahrenen Ausführenden, was eine Einschränkung dieses Protokolls darstellen kann. LFPI ist jedoch immer noch eine einfache, stabile und genaue Methode. Daher wurde TBI bei Mäusen mit LFPI in dieser Studie induziert, was das Protokoll repräsentativer und wertvoller in der Hirnverletzungsforschung macht.
Für die Darmmikrobiota-Analyse wurden Fäkalienproben für seine Nicht-Invasivität und Bequemlichkeit verwendet. Dennoch gibt es einige Einschränkungen bei der Fäkalienprobenahme. Erstens ist die Menge an Kot, die in jeder Maus zu einem bestimmten Zeitpunkt gesammelt wird, gering, und die Menge an Kot kann nicht ausreichen, um 16S-rDNA-Analysen durchzuführen. Zweitens, aufgrund der posttraumatischen Magen-Darm-Dysfunktion, Kotproben sind schwierig, während der akuten Phase nach einer Hirnverletzung zu sammeln (1 h nach der Verletzung in dieser Studie). Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass sich die Zusammensetzung der fäkalen Mikrobiota von der Mikrobiota in anderen Darmsegmenten13unterscheidet. Daher wurden In dieser Studie Caecum-Inhalte für die Darmmikrobiota-Analyse gesammelt. Caecum-Gehaltsproben erfordern, dass Mäuse geopfert werden, und diese Methode ermöglicht die Probenahme von Darmtrakt für histologische und immunologische Untersuchungen, die wichtige Forschungsaspekte in Studien über Hirnverletzung-induzierte Darmfunktionsstörungen sind. Zusätzlich, Diese Methode kann verwendet werden, um Mikrobiota Veränderungen in anderen Magen-Darm-Trakte einschließlich der Jejunum, Ileum, und Dickdarm zu untersuchen. Zusammenfassend ist dieses Protokoll eine ideale Methode zur Untersuchung von TBI-induzierten Veränderungen in Darmmikrobiota.
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Disclosures
Die Autoren danken Baohong Wang aufrichtig für ihre technische Anleitung.
Acknowledgments
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA isolation kit | QIAGEN | 51604 | For fast purification of genomic DNA from stool samples |
| Gene analysis service | GENEWIZ | Gene analyse service | |
| Heating pad | Shanghai SAFE Biotech Co. | TR-200 | heating pad |
| Injector | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | injector | |
| LFPI device | Virginia Commonwealth University |
FP302 | LFPI device |
| Micro cranial drill | RWD Life Science | 78061 | Micro cranial drill |
| Povidone Iodine | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | Povidone Iodine |
References
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