Summary
여기에 제시된 프로토콜은 직감 미생물군유전체 분석을 위한 케이쿰 함량의 수집에 이어 측면 유체 타악기 장치를 사용하여 확산 외상성 뇌 손상을 유도하는 프로토콜이다.
Abstract
증가하는 기록은 microbiota 창자 두뇌 축이 뇌 질환의 병인에 있는 중요한 역할을 한다는 것을 보여줍니다. 여러 연구는 또한 외상성 뇌 손상 창 자 microbiota에 변화를 일으킬 보여줍니다. 그러나, 두뇌 창 자 축의 양방향 조절 기본 메커니즘 알 수 없는 남아. 현재, 몇몇 모형은 외상성 두뇌 상해 후에 창자 microbiota에 있는 변경을 공부를 위해 존재합니다. 따라서, 제시된 연구 결과는 직감 microbiome에 있는 변경을 조사하기 위한 상해 다음 의 외액 타악기 장치 및 caecum 견본의 분석을 사용하여 외상성 뇌 손상을 유도하기 위한 프로토콜을 결합합니다. 외상성 뇌 손상 후 창 자 microbiota 조성물의 변경 16S-rDNA 시퀀싱을 사용 하 여 결정 됩니다. 이 프로토콜은 장내 미생물과 외상성 뇌 손상 사이의 관계를 연구하기위한 효과적인 방법을 제공합니다.
Introduction
외상성 뇌 손상 (TBI)은 글로벌 공중 보건 문제이며 젊은 성인의 사망과 장애의 주요 원인1,2. TBI는 매년 많은 죽음을 일으키고, 생존자는 신체적, 정신적, 정서적, 인지 적 장애의 다양한 경험. 따라서 TBI는 환자의 가족 및 사회 자원에 무거운 부담입니다. TBI는 외상의 시간에 발생하는 기본 뇌 손상과 초기 부상 다음 달에 시간을 개발하는 보조 뇌 손상을 모두 포함한다. 이차 뇌 손상은 여러 생화학 적 캐스케이드에 의해 매개되며, 이는 뇌에 해로울뿐만 아니라 위장 시스템을 포함한 다양한 장기 시스템에 상당한 부정적인 영향을 미칩니다3.
현재 동물 실험에서 TBI를 유도하는 세 가지 모델이 있습니다: 유체 타악기 손상, 대조피질 충격(CCI), 체중 감소 가속. 측면 유체 타악기 손상 (LFPI)은 확산 뇌 손상 (DAI)를 확립하기 위해 가장 일반적으로 사용되는모델4. 이 장치는 손상되지 않은 경도에 짧은 유체 압력 펄스를 적용하여 두개골 절제술을 통해 뇌 손상을 일으킵니다. 이 펄스는 진자의 파업에 의해 생성됩니다. LFPI는 TBI 연구를 위한 재현 가능하고 제어 가능한 모델링 방법입니다.
미생물군유전체는 인체에 있는 모든 미생물의 집단 게놈으로 정의됩니다. 특히 장내 미생물은 장 항상성 및 기능에 중요한 역할을 할뿐만 아니라 숙주 생리학및 다른 장기의 기능의 많은 측면을 조절합니다5. 최근 몇 년 동안, 창 자 microbiota 뇌-창 자 축을 통해 뇌 개발 및 기능을 조절 하는 것을 나타내는 증가 증거가 있다6. 창 자 microbiota의 중단 파 킨 슨 병을 포함 하 여 여러 뇌 기능 장애에 연결 되었습니다., 기분 장애, 그리고 자폐증7. 최근, 전임상 연구는 또한 급성 뇌 손상이 장내 미생물의 변화를 유도할 수 있다고보고8,9.
Treangen외. 10 에 의해 연구 발견 3 미생물 종에서 상당한 감소를 발견 하 고 CCI 유도 된 TBI 후 두 개의 미생물 종에서 증가. 이 증거는 창 자 microbiota의 변조 TBI 관리에 치료 방법 수 있습니다 나타냅니다. 그러나, 뇌 손상 유도 창 자 microbiota 변경 기본 메커니즘 알 수 없는 남아. 이러한 이유로, TBI 가 필요한 후 창 자 microbiota에 변화를 공부의 상대적으로 간단 하 고 효율적인 모델. 따라서, 본 연구는 마우스에서 TBI 후 창 자 microbiota에 변화를 검사 하는 프로토콜을 제시 한다.
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Protocol
수행 된 모든 절차는 절강 대학의 실험 동물 윤리위원회에 의해 승인되었다. 수술에 사용되는 모든 기기와 재료는 멸균됩니다. TBI 프로세드에는 약 20분이 소요됩니다.
1. 동물 관리
- 이 실험에서 5-6주 령 남성 C57BL/6J 마우스(체중 20-25 g)를 사용하십시오.
- 12 h/12 h의 빛/어두운 주기에 마우스를 유지 하 고 그들은 음식과 물 광고 리비툼을 받을 수 있는지 확인. 연구 기간 내내 샴과 TBI 그룹 모두에게 동일한 양의 음식과 물을 제공합니다.
- 동물의 고통과 불편함을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울인다.
2. 외상성 뇌 손상의 유도
- 마취를 위해 케타민 (80-100 mg/kg)/자일라진(10 mg/kg) IP를 주입하십시오. 눈 반사 또는 통증 반사를 사용하여 마취의 깊이를 테스트합니다. 인공 눈물이나 윤활유 눈 연고를 사용하여 눈이 마르지 않도록 하십시오.
- 마취 후, 마우스를 경향이있는 위치에 놓습니다. 온도 조절 식 가열 패드를 사용하여 수술 중 37 °C에서 온도를 유지하고 TBI 후 30 분 동안 유지하십시오.
- 절개 부위의 모발을 면도합니다.
- 세 번의 교대 스크럽을 사용하여 70 % 에탄올로 두피를 소독 한 다음 시상 면에서 두피를 절개하십시오.
- 집게를 사용하여 양쪽절개를 철회하고 섬막을 약간 분리합니다.
- 마커를 사용하여 중간선에서 2mm 떨어진 두개골의 오른쪽 정수리 영역에 원(직경 3mm)을 그립니다.
- 전기 드릴로 두개골을 드릴. 이 단계가 손상되지 않도록 조심스럽게 작동해야 합니다.
- 뼈 플랩을 제거하고 작은 뼈 창 (직경 3mm)을 노출합니다.
- 플라스틱 손상 캐뉼라 (내부 직경 = 2.5 mm, 길이 = 8mm)를 개두술 위에 놓고 치과 아크릴을 사용하여 두개골에 캐뉼러를 시멘트하십시오.
- 캐뉼라에 거품이 없는지 확인하기 위해 주사기(5mL)를 사용하여 멸균 0.9% NaCl(일반 식염수)으로 캐뉼라를 채웁니다.
- 오실로스코프와 앰프를 켜고 측면 유체 타악기 손상(LFPI) 장치의 고압 튜브에 기포가 없는지 확인합니다. 일정한 신호가 공급될 때까지 약 10펄스를 전달하여 장치를 테스트합니다. 진자 시작 위치의 각도를 조정하여 약 2.0 atm의 펄스 강도에 도달합니다.
- 부상 캐뉼라를 LFPI 장치에 연결합니다. 방아쇠를 당기고 진자 방출을 통해 뇌 손상을 유발합니다. 그런 다음, 펄스를 얻어 전체 폐쇄 된 유체 충전 튜브 시스템을 통해 듀라로 전송합니다.
- 동일한 외과 적 시술로 가짜 그룹에서 마우스를 수술하십시오. LFPI를 수행하지 마십시오.
3. 수술 후 치료
- 뇌 손상을 유발 한 후 플라스틱 캐뉼라를 제거하고 절개를 봉합하십시오. 수술 중 buprenorphine 관리 (2mg/kg) SQ 또는 IP 그리고 그 후 모든 6-12 3 일 동안 시간.
- 가열 패드에 마우스를 놓고 외래가 될 때까지 놓습니다. 가열 패드의 온도를 37 °C로 설정하여 마취 소생술을 가속화합니다.
- 케이지에 마우스를 다시 넣고 음식과 물 광고 리비텀을관리합니다.
4. 개복술 및 샘플 수집
- 마우스를CO2로 안락사시키고 그 다음에 해당 시점에서 자궁 경부 탈구를 한다.
참고: 본 실험에서, 선택한 시점은 1시간, 6시간, 1d, 3d, 7d의 외상 후 뇌 손상으로 장내 미생물의 역동적인 진화를 분석하였다. - 복부 표면에서 머리카락을 제거하십시오. 70 % 에탄올로 복부를 소독하십시오.
- 마우스 위에 멸균 드레이프를 놓습니다. 남성 마우스의 prepuce 바로 위에, 하복부 중간선에서 절개를합니다.
- 창장이 노출 되면 소실을 찾아 다른 장관에서 부드럽게 분리하십시오. 이빨이나 날카로운 집게로 묘지를 잡지 마십시오. 세레이션이 있는 Adson 집게와 같은 외상성 집게를 사용합니다.
- 날카로운 가위로 케이컴을 잘라냅니다.
- 멸균 드레싱에 수동으로 케이컴 내용물을 추출하고 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에 내용물을 보관하십시오.
- 미생물군유전체 분석전까지 캐컴 함량을 -80°C에 보관합니다.
5. DNA 추출 및 16S-rDNA 시퀀싱 및 데이터 분석
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대변에서 DNA의 격리
참고: 시판되는 DNA 절연키트(물자 표)를이 실험에 사용하였다.- 메스를 사용하여 2 mL 미세 원심 분리튜브에 300 mg의 대변을 긁어 얼음에 튜브를 놓습니다.
- 각 샘플에 1 mL의 억제 버퍼를 추가합니다. 소용돌이는 1 분 동안 또는 대변 샘플이 철저히 균질화 될 때까지 계속합니다.
- 배설물 입자를 펠렛하기 위해 1 분 동안 최대 속도로 샘플을 원심 분리합니다.
- 피펫 2 μL의 단백질나제 K를 새로운 2 mL 마이크로원지지 튜브에 넣습니다. 피펫 600 μL단계 5.1.3으로부터 단백질나아제 K를 함유하는 2 mL 마이크로원지튜브로 한다. 그런 다음 버퍼 1의 600 μL과 15 s의 와류를 추가합니다.
- 샘플을 70°C에서 10분 동안 배양합니다.
- 600 μL의 100% 에탄올을 리세이트(1:1 비율)에 넣고 와류로 섞습니다. 튜브 뚜껑 안쪽에서 방울을 제거하기 위해 최대 속도로 잠시 원심 분리기.
- 600 μL의 리세이트를 스핀 컬럼에 적용합니다. 원심분리기는 최대 속도로 1분 간 사용하십시오. 이 단계를 한 번 더 반복합니다. 그런 다음 컬럼을 새로운 2mL 수집 튜브로 옮김을 전송합니다.
- 스핀 컬럼을 열고 버퍼 2의 500 μL을 추가합니다. 원심분리기는 최대 1분 동안 열을 제거하고 새로운 2mL 수집 튜브에 놓습니다.
- 버퍼 3의 500 μL을 열에 추가합니다. 최대 속도3분으로 원심분리기를 사용해 흐름을 폐기합니다. 버퍼 3이 완전히 용출되었는지 확인하기 위해 원심 분리 과정을 한 번 반복합니다.
- 스핀 컬럼을 새로운 튜브 2 mL 수집 튜브에 넣고 버퍼 4의 피펫 200 μL을 멤브레인에 직접 놓습니다. 실온 (RT)에서 1 분 동안 배양 한 다음 DNA를 용해시키기 위해 최대 속도로 원심 분리기를 1 분 동안 배양하십시오.
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16S-rDNA 시퀀싱 및 데이터 분석
- 20-30 ng의 DNA를 사용하여 앰플리곤을 생성하십시오.
- 박테리아 16S rDNA의 V3 및 V4 초가변 영역과 접한 비교적 보존된 영역을 위해 설계된 시판되는 프라이머를 사용한다. 서열을 포함하는 순방향 프라이머 "CCTACGRBGCGCASCAKVVGAAT" 및 서열을 포함하는 역프라이머 "GGACTACNVGGGTWCtTCTAATCC"를 본 연구에서 사용하였다.
- 완충액 1, dNTP 2 μL, 각 프라이머의 1 μL, 0.5 μL의 DNA 폴리머라제 및 20 ng의 템플릿 DNA를 튜브에 추가하여 PCR 반응 혼합물을 만듭니다. ddH2O를 사용하여 반응 시스템을 25 μL로 조정합니다.
- 다음과 같이 PCR 반응 파라미터를 설정합니다: 3분 동안 94°C에서 사전 변성 수행. 5초동안 94°C에서 변성, 90초동안 57°C에서 어닐을 수행하고, 10초동안 72°C에서 연장하고, 이 것을 24배 반복합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 PE250/300 페어링 엔드 시퀀싱을 수행하고 16S rRNA 데이터 분석을 위해 QIIME 데이터 분석 패키지를 사용합니다.
참고: 이 실험에서 DNA 시퀀싱 및 데이터 분석은 주로 전문 시퀀싱 회사에 의해 수행되었습니다.
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Representative Results
TBI의 설립은 그림 1에나와 있습니다. 마취 및 소독 후, 두피를 상각시켰다(도 1A). 개두량(직경 3 mm)을 전동 드릴로 오른쪽 정수리 피질 위에 두개골 내로 트레핀하고, 두라를 그대로 유지하였다(도1B,C). 플라스틱 부상 캐뉼라를 뼈 창 위에 놓고 치과 아크릴을 사용하여 두개골에 시멘트(그림 1D).
측면 유체 타악기의 절차는 도 2에도시되어 있습니다. 장치를 시작하기 전에 꾸준한 신호를 줄 때까지 약 10 펄스를 전달하여 테스트했습니다. 진자의 각도는 약 2.0 atm의 펄스 강도에 도달하기 위해 시작 위치로 조정되었다(도2A). 캐뉼라를 멸균 정상 식염수로 채웠다. 이어서 캐뉼라를 LFPI 장치에 연결하였다(도2B). 뇌 손상은 폐쇄된 두개골 구멍 내로 임펄스를 생성함으로써 유도되었다(도2C).
개복술 및 케이쿰 대변 샘플 수집은 그림 3에나와 있습니다. 개복술은 하복부 및 중간선을 따라 수행하였다(도3A). 케이컴을 식별하고 부드럽게 분리하였다(도3B,C). caecum는 일반적으로 복부의 오른쪽 아래 부분에 있습니다. 그런 다음 날카로운 가위로 절개하였다(그림3D). 상기 케쿰의 내용물(도3E)을추출하여 1.5 mL튜브(도 3F)에저장하였다. 배설물 샘플을 추가 사용 전에 -80°C에서 즉시 보관하였다.
16S-rDNA 염기서열 분석은 TBI 3일 후 마우스에서 케쿰 미생물의 다양성 감소를 입증하였고, 가짜 및 TBI 군의 케쿰 함량에서 가장 풍부한 taxa는 도 4에나타났다. Wilcoxon 랭크 합계 시험은 16S 염기서열 분석에서 TBI와 sham 군 사이의 미생물 차이를 평가하기 위해 수행되었으며, p 값은 0.05 미만이었다. 비메트릭 다차원 스케일링(NMDS)은 또한 TBI 후 의 큐쿰 미생물의 변화된 조성을 나타내고있었다(도 5).
그림 1 : TBI 설립 (A)마취 및 소독 후 두피를 절개하였다. (B)오른쪽 정수리 피질 위에 두개골에 원두 개두를 작동합니다. (C)두라를 그대로 유지 합니다. (D)치과 아크릴을 사용하여 두개골에 플라스틱 부상 캐뉼라를 시멘트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 측면 유체 타악기의 절차. (A)진자 시작 위치 각도조정. (B)멸균 정상 식염수로 캐뉼라를 채운 다음 캐뉼라를 LFPI 장치에 연결합니다. (C)진자의 방출과 폐쇄 된 두개골 구멍에 충동을 생성하여 뇌 손상 유도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 개복술 및 케이쿰 배설물 샘플 컬렉션. (A)하복부와 중간선을 따라 개복술의 시작. (B, C) 케이쿰의 식별 및 후속 (부드러운) 제거. (D)날카로운 가위로 카쿰을 자르는 것. (E)케쿰의 내용물 추출. (F)1.5 mL 에펜도르프 튜브에 케이컴 함량 샘플을 저장한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 케쿰 미생물 다양성의 비교. 가짜 및 TBI 그룹의 카쿰 함량에서 가장 풍부한 taxa는 TBI 후 3 일 후에 마우스에서 케쿰 미생물의 감소된 다양성을 입증하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : NMDS 분석. 비메트릭 다차원 스케일링(NMDS)은 TBI 후 의 큐쿰 미생물의 변화된 조성을 나타내보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시된 것은 마우스에서 TBI 후에 세칼 미생물의 변화를 결정하는 간단하고 효율적인 프로토콜이다. 뇌 손상의 유도 및 caecum 내용 샘플의 수집은 프로토콜의 중요한 부분입니다.
연구원이 TBI를 따르는 창자 microbiota의 변경을 공부한 에도 불구하고, 이 연구 결과에 사용된 두뇌 상해는 CCI-8 및 무게 투하/충격 유도한 모형9이었습니다. 그러나, CCI 모형은 주로 두뇌 타박상을 복제하고, 무게 투하 모형은 약간 부정확성 때문에 손해를 입을 수 있습니다. 기존의 모든 뇌 손상 모델 중에서, LFPI는 가장 일반적으로 사용되는 모델이며, 이는 초점 및 확산 뇌 손상11,12를 포함하고 임상 TBI 환자에서 관찰된 많은 중요한 특징을 복제한다. 프로세스 전반에 걸친 주요 단계로는 두라 보호와 캐뉼라를 밀폐된 상태로 유지하는 것이 포함됩니다. 그러나, 개두술과 응집 둘 다 이 프로토콜의 한계일지도 모르다 숙련된 연기자의 조작을 요구한다. 그러나 LFPI는 여전히 간단하고 안정적이며 정확한 방법입니다. 따라서, 마우스에서 TBI는 이 연구에서 LFPI를 사용하여 유도되었고, 이는 뇌 손상 연구에서 프로토콜을 보다 대표적이고 가치 있게 만든다.
창자 microbiota 분석을 위해, 배설물 견본은 그것의 비 침습성과 편의를 위해 이용되었습니다. 그럼에도 불구하고 배설물 샘플링에는 몇 가지 제한사항이 있습니다. 첫째, 특정 시점에서 각 마우스에서 수집된 대변의 양이 작고, 대변의 양은 16S-rDNA 분석을 수행하기에 불충분할 수 있다. 둘째, 외상 후 위장 기능 장애로 인해 대변 샘플은 뇌 손상 후 급성 단계에서 수집하기가 어렵습니다 (이 연구에서 는 1 시간 후 부상). 또한, 증거는 배설물 microbiota 조성물 다른 장 세그먼트에서 microbiota와 다른 것을 보여 주었다13. 따라서, 이 연구에서 는 장내 미생물 분석을 위해 케이쿰 함량을 수집하였다. Caecum 내용 샘플링은 마우스가 희생되는 것을 요구하고, 이 방법은 두뇌 상해 유도한 창자 역기능의 연구 결과에 있는 중요한 연구 양상인 조직학및 면역학 시험을 위한 창자의 샘플링을 허용합니다. 추가적으로, 이 방법은 jejunum, ileum 및 결장을 포함하여 그밖 위장관에 있는 microbiota 변경을 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다. 결론적으로, 이 프로토콜은 창 자 microbiota에 TBI 유도 된 변화를 공부 하기 위한 이상적인 방법.
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Disclosures
저자는 진심으로 그녀의 기술 지도에 대한 바오홍 왕에게 감사드립니다.
Acknowledgments
저자는 공개 할 것이 없다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA isolation kit | QIAGEN | 51604 | For fast purification of genomic DNA from stool samples |
| Gene analysis service | GENEWIZ | Gene analyse service | |
| Heating pad | Shanghai SAFE Biotech Co. | TR-200 | heating pad |
| Injector | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | injector | |
| LFPI device | Virginia Commonwealth University |
FP302 | LFPI device |
| Micro cranial drill | RWD Life Science | 78061 | Micro cranial drill |
| Povidone Iodine | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | Povidone Iodine |
References
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