Summary
这里介绍的是一种使用横向流体打击装置诱导弥漫性创伤性脑损伤的协议，然后收集胆囊成分进行肠道微生物群落分析。
Abstract
越来越多的证据表明，微生物-胃脑轴在脑疾病的发病机制中起着重要的作用。几项研究还表明，创伤性脑损伤导致肠道微生物群的变化。然而，大脑-肠轴的双向调节背后的机制仍然未知。目前，研究创伤性脑损伤后肠道微生物群变化的模型很少。因此，提出的研究结合了利用横向流体打击装置诱导创伤性脑损伤的规程，并分析损伤后的卡库姆样本，以研究肠道微生物群的改变。创伤性脑损伤后肠道微生物群的改变使用16S-rDNA测序确定。本方案为研究肠道微生物与创伤性脑损伤的关系提供了一种有效的方法。
Introduction
创伤性脑损伤（TBI）是一个全球性的公共卫生问题，是青少年死亡和残疾的主要原因。TBI每年导致许多死亡，幸存者经历各种身体、精神、情感和认知障碍。因此，TBI 是患者家庭和社会资源的沉重负担。TBI 既包括创伤时发生的原发性脑损伤，也涉及在最初受伤后数小时至数月出现的任何继发性脑损伤。继发性脑损伤由几个生化级联介，不仅对大脑有害，而且对各种器官系统，包括胃肠道系统3有显著的负面影响。
目前，动物实验中诱导TBI的模型有三种：流体撞击损伤、控制皮质冲击（CCI）和降压加速度。横向流体打击损伤（LFPI）是建立扩散性脑损伤（DAI）最常用的模型4。该设备通过颅骨切除术对完好的杜拉施加短暂的流体压力脉冲来产生脑损伤。此脉冲由钟摆的敲击产生。LFPI是TBI研究的一种可重复、可控的建模方法。
微生物群被定义为存在于人体中的所有微生物的集体基因组。特别是肠道微生物不仅在肠道平衡和功能中起着重要作用，而且调节宿主生理和其他器官功能的许多方面。近年来，越来越多的证据表明，肠道微生物群通过脑-肠轴6调节大脑发育和功能。肠道微生物群的中断与几个大脑功能障碍有关，包括帕金森病、情绪障碍和自闭症7。最近，临床前研究也报道，急性脑损伤可诱发肠道微生物群8、9的变化。
Treangen等人10年的一项研究发现，在CCI诱导的TBI之后，三种微生物物种明显减少，两种微生物物种增加。这一证据表明，肠道微生物群的调制可能是TBI管理的一种治疗方法。然而，脑损伤引起的肠道微生物群变化背后的机制仍然未知。因此，需要一个相对简单有效的模型来研究TBI后肠道微生物群的变化。因此，本研究提出了一种检查小鼠TBI后肠道微生物群变化的协议。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有程序均经浙江大学实验动物伦理委员会批准。手术中使用的所有仪器和材料都是无菌的。TBI 的代理大约需要 20 分钟。
1. 动物护理
- 在本实验中使用5至6周大的雄性C57BL/6J小鼠（20-25克重量）。
- 使小鼠保持在12小时/12小时光/暗周期，并确保它们获得食物和水。在整个研究中，为假人和TBI组提供相同数量的食物和水。
- 竭尽全力尽量减少动物的痛苦和不适。
2. 创伤性脑损伤的诱导
- 注射氯胺酮（80-100毫克/千克）/西拉津（10毫克/千克）IP进行麻醉。使用眼反射或疼痛反射测试麻醉深度。使用人工眼泪或润滑剂眼膏，防止眼睛干燥。
- 麻醉后，将鼠标置于易感位置。在手术期间和 TBI 后，使用温度控制的加热垫将温度保持在 37°C。
- 割去切口区域的头发。
- 使用三个交替磨砂剂用 70% 乙醇对头皮进行消毒，然后在下垂平面上切开头皮。
- 使用钳子缩回两侧的切口，并稍微分离渗漏。
- 使用标记在头骨的右端区域绘制一个圆（直径 3 毫米），距离中线 2 mm。
- 用电钻钻头骨。确保此步骤小心操作，以防止杜拉损坏。
- 拆下骨瓣并露出一个小骨窗（直径为 3 mm）。
- 将塑料损伤管（内径 = 2.5 mm，长度 = 8 mm）放在颅骨上，并使用牙科丙烯酸将管状水泥到头骨上。
- 使用注射器（5 mL）向管状物中注入无菌 0.9% NaCl（正常盐水），以确保管中没有气泡。
- 打开示波器和放大器，确保横向流体冲击损伤 （LFPI） 装置的高压管无气泡。通过传递大约 10 个脉冲来测试设备，直到其发出稳定信号。调整钟摆起始位置的角度，达到约2.0安分姆的脉冲强度。
- 将伤害管连接到 LFPI 设备。通过拉动扳机和松开钟摆来诱发脑损伤。然后，获得一个脉冲，并通过整个封闭的流体填充管系统将其传输到Dura。
- 使用相同的外科手术操作假组中的小鼠。不要执行 LFPI。
3. 术后治疗
- 引起脑损伤后，取出塑料管，缝合切口。在手术期间，施用丁丙诺啡（2mg/kg）SQ或IP，此后每6-12小时服用一次，为期三天。
- 将鼠标放在加热垫上，直到它处于流动。将加热垫的温度设置为 37°C，以加速麻醉复苏。
- 把老鼠放回笼子里，管理食物和水。
4. 腹腔切除术和从卡库姆收集的样品
- 用CO2对小鼠实施安乐死，随后在相应的时间点进行宫颈脱位。
注：在本实验中，所选时间点为1小时、6小时、1 d、3d和7d创伤后脑损伤，以分析肠道微生物群的动态演化。 - 从腹部表面取下头发。用70%乙醇消毒腹部。
- 在鼠标上放置无菌窗帘。从下腹部中线切开，正好高于雄性小鼠的腹肌。
- 肠道暴露后，找到cecum，并轻轻地将其与其他肠道分离。避免用齿或锋利的钳子抓住cecum。使用创伤性钳子，如带锯齿的 Adson 钳。
- 用锋利的剪刀剪开卡库姆。
- 将姜黄内容物手动提取到无菌敷料上，并将内容物储存在 1.5 mL 微离心管中。
- 将姜黄含量储存在-80°C，直到微生物群进行分析。
5. DNA提取和16S-rDNA测序和数据分析
-
从粪便中分离DNA
注：本实验使用了市售的DNA分离试剂盒（材料表）。- 使用手术刀在2 mL微离心管中刮取300毫克的粪便，并将管放在冰上。
- 在每个样品中加入1 mL的抑制缓冲液。涡流连续旋转1分钟或直到粪便样品完全均匀化。
- 以最大速度将样品离心 1 分钟，以颗粒粪便颗粒。
- 将蛋白酶 K 的移液器 2 μL 放入新的 2 mL 微离心管中。从步骤5.1.3移入含有蛋白酶K的2 mL微离心管中的上清液600μL。然后，添加600 μL的缓冲器1和涡旋15s。
- 在70°C下孵育样品10分钟。
- 将600μL的100%乙醇加入流合酶（1：1的比例），然后涡旋混合。以最高速度短暂离心，以清除管盖内侧滴。
- 将 600 μL 的莱沙施加到旋转柱上。以最大速度离心1分钟，丢弃流水。再重复此步骤一次。然后，将柱转移到新的 2 mL 收集管中。
- 打开旋转列并添加缓冲区 2 的 500 μL。以最大速度离心 1 分钟，取出柱子并将其放入新的 2 mL 收集管中。
- 将 500 μL 的缓冲区 3 添加到列中。以最大速度离心3分钟，丢弃流水。重复离心过程一次，以确保缓冲区 3 完全洗脱。
- 将旋转柱放入新的管 2 mL 收集管中，将缓冲器 4 的移液器 200 μL 直接放入膜上。在室温（RT）下孵育1分钟，然后以最大速度离心1分钟，以排出DNA。
-
16S-rDNA 测序和数据分析
- 使用20-30纳克的DNA产生放大子。
- 使用市售的引物，设计用于与细菌 16S rDNA 的 V3 和 V4 超可变区域接壤的相对保守的区域。本研究使用了含有序列"CCTACGGRRGGGGKVRVGAAT"的正向引物和含有序列"GGACTACNVGGGTWTATATCC"的反向引物。
- 通过在管中加入2.5μL的缓冲液1、2μL的dNTPs、每引物1μL、0.5μL的DNA聚合酶和20纳克的模板DNA，使PCR反应混合。使用 ddH2O 将反应系统调整到 25 μL。
- 设置PCR反应参数如下：在94°C下执行预变性3分钟一次。在94°C下进行5s的变性，在57°C下进行90s的退火，在72°C下延长10s，并重复24次。
- 根据制造商的说明执行 PE250/300 成对端测序，并使用 QIIME 数据分析包进行 16S rRNA 数据分析。
注：在本实验中，DNA测序和数据分析主要由专业测序公司完成。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TBI 的建立如图1所示。麻醉和消毒后，头皮被切口（图1A）。颅骨切除术（直径3毫米）用电钻在右皮质的颅骨上被挖到头骨中，杜拉保持完好无损（图1B，C）。在骨窗上放置了一个塑料损伤管，并用牙科丙烯酸固定在头骨上（图1D）。
横向流体打击的过程如图2所示。在启动设备之前，通过传递大约 10 个脉冲进行测试，直到它发出稳定信号。将钟摆的角度调整到起始位置，以达到约2.0 atm的脉冲强度（图2A）。管状充满了无菌的正常盐水。然后，导管连接到LFPI设备 （图 2B）。脑损伤是由形成冲动进入闭合的颅腔引起的（图2C）。
腹腔切除术和粪便粪便样本收集如图3所示。腹腔切除术是在下腹部和中线进行（图3A）。被识别并轻轻分离（图3B，C）。腹肌通常位于腹部的右下角。然后用锋利的剪刀（图3D）切开。caecum （图3E） 的内容被提取并储存在 1.5 mL 管中 （图 3F）。粪便样品在进一步使用前立即储存在-80°C。
16S-rDNA测序显示，在TBI后3天小鼠中，卡库姆微生物群的多样性降低，图4显示了假体组和TBI组中表黄素含量最丰富的分类。在16S测序分析中，对Wilcoxon排名总和测试进行了评估TBI和假组之间的微生物群差异，p值小于0.05。非公制多维缩放（NMDS）还显示，在TBI之后，卡库姆微生物群的组成发生了变化（图5）。
图 1：建立TBI。（A） 麻醉和消毒后，头皮被切开。（B） 在右额皮质层的颅骨上做一次圆环颅切除术。（C） 保持杜拉完好无损.（D） 使用牙科丙烯酸将塑料损伤管固定在头骨上。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：横向流体打击的程序。（A） 调整钟摆起始位置角度。（B） 用无菌正常盐水填充管条，然后将导管连接到 LFPI 设备。（C） 通过释放钟摆和产生脉冲进入闭合的颅腔而引来脑损伤。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3：腹腔切除术和粪便样本收集。（A） 从下腹部和中线开始腹腔切除术。（B，C）识别卡库姆和随后的（温和）去除。（D） 用锋利的剪刀切割卡库姆。（E） 提取卡库姆的内容。（F） 将卡库姆含量样品储存在1.5 mL Eppendorf管中。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4：卡莫姆微生物群多样性的比较。假和TBI组在假和TBI组中最丰富的分类表明，在TBI后3天小鼠中，卡库姆微生物群的多样性降低。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5：NMDS 分析。非公制多维缩放（NMDS）显示TBI后结垢微生物群的组成发生变化。请点击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这里介绍的是一个简单而有效的协议，用于确定小鼠TBI后头亚微生物群的变化。脑损伤的诱导和采集的囊中内容样本是协议的关键部分。
尽管研究人员研究了TBI后肠道微生物群的变化，但这些研究中使用的脑损伤是CCI-8和体重下降/撞击引起的模型9。然而，CCI模型主要复制脑挫伤，而降重模型可能会受到一些不准确的影响。在现有的脑损伤模型中，LFPI是最常用的模型，包括焦点和扩散性脑损伤11，12，并复制临床TBI患者观察到的许多重要特征。整个过程的关键步骤包括保护杜拉和保持导管密封。然而，颅内切除术和粘接都需要熟练表演者的操作，这可能是该协议的一个限制。然而，LFPI仍然是一个简单，稳定，准确的方法。因此，本研究采用LFPI诱导小鼠TBI，使该方案在脑损伤研究中更具代表性和价值。
对于肠道微生物群分析，粪便样本用于无创性和便利性。然而，粪便取样也有一些局限性。首先，在一定时间点，每只小鼠收集的粪便量很小，粪便量可能不足以进行16S-rDNA分析。其次，由于创伤后胃肠道功能障碍，在脑损伤后急性阶段（本研究中1小时后）难以收集粪便样本。此外，有证据表明，粪便微生物群成分不同于其他肠道13的微生物群。因此，本研究收集了肠微生物群分析的胆碱含量。Caecum含量采样要求牺牲小鼠，该方法允许对肠道进行组织学和免疫学检查的采样，这是脑损伤引起的肠道功能障碍研究的重要研究方面。此外，此方法可用于研究其他胃肠道（包括热宗、回肠和结肠）中的微生物群变化。总之，该方案是研究肠道微生物群TBI引起的变化的理想方法。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者衷心感谢王宝红的技术指导。
Acknowledgments
作者没有什么可透露的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA isolation kit | QIAGEN | 51604 | For fast purification of genomic DNA from stool samples |
| Gene analysis service | GENEWIZ | Gene analyse service | |
| Heating pad | Shanghai SAFE Biotech Co. | TR-200 | heating pad |
| Injector | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | injector | |
| LFPI device | Virginia Commonwealth University |
FP302 | LFPI device |
| Micro cranial drill | RWD Life Science | 78061 | Micro cranial drill |
| Povidone Iodine | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | Povidone Iodine |
References
- Cheng, P., et al. Trends in traumatic brain injury mortality in China, 2006-2013: A population-based longitudinal study. 14, e1002332 (2017).
- Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
- Gaddam, S. S., Buell, T., Robertson, C. S.
- Kabadi, S. V., et al. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
- Fung, T. C., Olson, C. A., Hsiao, E. Y. Interactions between the microbiota, immune and nervous systems in health and disease. Nature Neuroscience. 20, 145-155 (2017).
- Collins, S. M., Surette, M., Bercik, P. The interplay between the intestinal microbiota and the brain. Nature Reviews Microbiology. 10, 735-742 (2012).
- Cryan, J. F., Dinan, T. G. Mind-altering microorganisms: the impact of the gut microbiota on brain and behaviour. Nature Reviews Neuroscience. 13, 701-712 (2012).
- Nicholson, S. E., et al. Moderate Traumatic Brain Injury Alters the Gastrointestinal Microbiome in a Time-Dependent. Shock. , (2018).
- Houlden, A., et al. Brain injury induces specific changes in the caecal microbiota of mice via altered autonomic activity and mucoprotein production. Brain, Behavior, and Immunity. 57, 10-20 (2016).
- Treangen, T. J., et al. Traumatic Brain Injury in Mice Induces Acute Bacterial Dysbiosis Within the Fecal Microbiome. Frontiers in Immunology. 9, 2757 (2018).
- Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral fluid percussion: model of traumatic brain injury in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Thompson, H. J., et al. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. Journal of Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).
- Pang, W., Vogensen, F. K., Nielsen, D. S., Hansen, A. K. Faecal and caecal microbiota profiles of mice do not cluster in the same way. Laboratory Animals. 46, 231-236 (2012).
