Summary
É apresentado aqui um protocolo para induzir ferimento de cérebro traumático difuso usando um dispositivo de percussão fluido lateral seguido pela coleção do índice do cécum para a análise do microbioma do intestino.
Abstract
O aumento da evidência mostra que o eixo microbiota-intestino-cérebro desempenha um papel importante na patogênese das doenças cerebrais. Vários estudos também demonstram que as lesões cerebrais traumáticas causam alterações na microbiota intestinal. No entanto, os mecanismos subjacentes à regulação bidirecional do eixo cérebro-intestino permanecem desconhecidos. Atualmente, existem poucos modelos para estudar as mudanças na microbiota intestinal após lesão cerebral traumática. Portanto, o estudo apresentado combina protocolos para induzir lesão cerebral traumática usando um dispositivo de percussão de fluido lateral e análise de amostras de cécum após lesão para investigar alterações no microbioma intestinal. Alterações da composição da microbiota intestinal após lesão cerebral traumática são determinadas usando o sequenciamento 16S-rDNA. Este protocolo fornece um método eficaz para estudar as relações entre micro-organismos enteric e ferimento de cérebro traumático.
Introduction
A lesão cerebral traumática (TCE) é um problema global de saúde pública e a principal causa de morte e incapacidade em adultos jovens1,2. O TBI causa muitas mortes a cada ano, e os sobreviventes experimentam uma variedade de deficiências físicas, psiquiátricas, emocionais e cognitivas. Portanto, o TBI é um fardo pesado para os recursos familiares e societais de um paciente. TBI envolve tanto a lesão cerebral primária que ocorre no momento do trauma e quaisquer lesões cerebrais secundárias que desenvolvem horas a meses após a lesão inicial. Lesão cerebral secundária é mediada por várias cascatas bioquímicas, que não são apenas prejudiciais para o cérebro, mas também têm efeitos negativos significativos em vários sistemas de órgãos, incluindo o sistema gastrointestinal3.
Atualmente, existem três modelos para induzir TBI em experimentos com animais: lesão de percussão fluida, controle do impacto cortical (CCI) e aceleração da queda de peso. A lesão de percussão de fluido lateral (LFPI) é o modelo mais comumente utilizado para estabelecer lesão cerebral difusa (DAI)4. O dispositivo produz ferimento de cérebro através de um craniectomy aplicando um pulso de pressão fluido breve à dura intacta. Este pulso é criado pela greve do pêndulo. O LFPI é um método de modelagem reprodutível e controlável para pesquisa de TBI.
O microbioma é definido como os genomas coletivos de todos os microrganismos que residem no corpo humano. Micróbios intestinais, em particular, não só desempenham um papel importante na homeostase intestinal e função, mas também regulam muitos aspectos da fisiologia do hospedeiro e do funcionamento de outros órgãos5. Nos últimos anos, há uma evidência crescente que indica que a microbiota intestinal regula o desenvolvimento cerebral e função através de eixos cerebrais-intestino6. A perturbação da microbiota intestinal tem sido associada a vários distúrbios da função cerebral, incluindo a doença de Parkinson, transtornos do humor e autismo7. Recentemente, estudos pré-clínicos também relataram que a lesão cerebral aguda pode induzir alterações na microbiota intestinal8,9.
Um estudo realizado por Treangen et al.10 encontrou reduções significativas em três espécies microbianas e aumentos em duas espécies microbianas após TCE induzida por ICC. Essa evidência indica que a modulação da microbiota intestinal pode ser um método terapêutico no manejo da TBI. No entanto, os mecanismos subjacentes às alterações da microbiota intestinal induzida por lesão cerebral permanecem desconhecidos. Por esta razão, um modelo relativamente simples e eficiente de estudar as mudanças na microbiota intestinal após TBI é necessária. Portanto, o presente estudo apresenta um protocolo para examinar alterações na microbiota intestinal após TCE em camundongos.
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Protocol
Todos os procedimentos realizados foram aprovados pelo Comitê experimental de ética animal da Universidade de Zhejiang. Todos os instrumentos e materiais utilizados na cirurgia são estéreis. O armazenado de TBI toma aproximadamente 20 minutos.
1. cuidados com os animais
- Use camundongos masculinos de 5 a 6 semanas de idade C57BL/6J (20-25 g de peso) neste experimento.
- Manter camundongos em um 12 h/12 h de luz/ciclo escuro, e certifique-se que recebem alimentos e água ad libitum. Forneça as mesmas quantidades de alimento e de água aos grupos do Sham e do TBI durante todo o estudo.
- Faça todos os esforços para minimizar a dor e o desconforto dos animais.
2. indução de traumatismo cranioencefálico
- Injetar cetamina (80-100 mg/kg)/xilazina (10 mg/kg) IP para anestesia. Teste a profundidade da anestesia usando um reflexo do olho ou reflexo da dor. Use lágrimas artificiais ou pomada de olho lubrificante para manter os olhos de secagem.
- Após a anestesia, coloque o mouse em posição prona. Use uma almofada de aquecimento temperatura-controlada para manter a temperatura em 37 ° c durante a cirurgia e por 30 minutos após TBI.
- Raspar o cabelo da área da incisão.
- Desinfecte o couro cabeludo com 70% de etanol usando três esfrega alternadas e, em seguida, incite o couro cabeludo em um plano sagital.
- Use fórceps para retrair a incisão em ambos os lados e separar o periósteo ligeiramente.
- Use um marcador para desenhar um círculo (3 mm de diâmetro) na área parietal direita do crânio, a 2 mm de distância da linha média.
- Perfure o crânio com uma broca elétrica. Assegure-se de que esta etapa esteja operada com cuidado para proteger o dura de ser danificado.
- Retire a aba óssea e exponha uma pequena janela óssea (3 mm de diâmetro).
- Coloque uma cânula de ferimento de plástico (diâmetro interno = 2,5 mm, comprimento = 8 mm) sobre a craniotomia e cimente a cânula para o crânio usando um acrílico dental.
- Encha a cânula com estéril 0,9% NaCl (soro fisiológico normal) usando uma seringa (5 mL) para garantir que não há bolhas na cânula.
- Gire sobre o osciloscópio e o amplificador e assegure-se de que o tubo de alta pressão do dispositivo da lesão de percussão do fluido lateral (LFPI) esteja livre de bolhas de ar. Teste o dispositivo entregando aproximadamente 10 pulsos até que dê um sinal constante. Ajuste o ângulo da posição inicial do pêndulo para atingir uma intensidade de pulso de cerca de 2,0 ATM.
- Ligue a cânula de ferimento ao dispositivo LFPI. Induzir lesão cerebral puxando o gatilho e liberando o pêndulo. Em seguida, obter um pulso e transmiti-lo para a dura através de todo o sistema fechado de tubos cheios de fluido.
- Opere os camundongos no grupo simulado com o mesmo procedimento cirúrgico. Não execute o LFPI.
3. tratamento pós-cirúrgico
- Depois de induzir a lesão cerebral, retire a cânula plástica e sutura a incisão. Durante a cirurgia administrar buprenorfina (2mg/kg) SQ ou IP e depois de cada 6-12 h durante três dias.
- Coloque o mouse sobre uma almofada de aquecimento até que seja ambulatorial. Ajuste a temperatura da almofada de aquecimento a 37 ° c para acelerar a ressuscitação anestésica.
- Coloque o mouse de volta na gaiola e administrar alimentos e água ad libitum.
4. laparotomia e coleta de amostras do cécum
- Eutanizar os camundongos por CO2 seguido de luxação cervical nos pontos temporais correspondentes.
Nota: neste experimento, os pontos de tempo escolhidos foram de 1 h, 6 h, 1 d, 3 d e 7 d lesão cerebral pós-traumática para analisar a evolução dinâmica da microbiota intestinal. - Retire o cabelo da superfície do abdômen. Desinfecte o abdômen com 70% de etanol.
- Coloque um drapejar estéril sobre o mouse. Faça uma incisão da linha média do abdômen inferior, logo acima do prepúcio nos camundongos machos.
- Depois que os intestinos são expostos, localize o ceco e gentilmente separou-o de outros tratos intestinais. Evite agarrar o cálio com o fórceps dentado ou afiado. Use fórceps Atraumatic, tal como o fórceps de Adson com serrações.
- Corte o cécum com tesouras afiadas.
- Extraia o conteúdo do cécum manualmente no curativo estéril e armazene o conteúdo em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Armazene os índices do cécum em-80 ° c até a análise do microbioma.
5. extração de DNA e sequenciamento 16S-rDNA e análise de dados
-
Isolação do ADN das fezes
Nota: um kit de isolamento de DNA disponível comercialmente (tabela de materiais) foi utilizado para este experimento.- Use um bisturi para raspar 300 mg de fezes em um tubo de microcentrífuga de 2 mL e coloque o tubo no gelo.
- Adicione 1 mL de inibição de buffer para cada amostra. Vortex continuamente por 1 min ou até que a amostra de fezes seja completamente homogeneizada.
- Centrifugue a amostra na velocidade máxima por 1 minuto para pellet as partículas de fezes.
- Pipetar 2 μL de proteinase K para um novo tubo de microcentrífuga de 2 mL. Pipet 600 μL do sobrenadante do passo 5.1.3 para o tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo proteinase K. Em seguida, adicione 600 μL de buffer 1 e Vortex por 15 s.
- Incubar a amostra a 70 ° c durante 10 min.
- Adicionar 600 μL de 100% de etanol ao lisado (1:1 ratio) e misturar por vortexing. Centrifugue na velocidade máxima brevemente para remover gotas do interior da tampa do tubo.
- Aplique 600 μL do lisado na coluna de rotação. Centrifugar à velocidade máxima durante 1 min. descarte o fluxo. Repita este passo mais uma vez. Em seguida, transfira a coluna para um novo tubo de recolha de 2 mL.
- Abra a coluna de rotação e adicione 500 μL de buffer 2. Centrifugar à velocidade máxima durante 1 min. Retire a coluna e coloque-a num novo tubo de recolha de 2 mL.
- Adicione 500 μL de buffer 3 na coluna. Centrifugar à velocidade máxima durante 3 min. descarte o fluxo. Repita o processo de centrifugação uma vez para garantir que o tampão 3 esteja completamente eluído.
- Coloque a coluna de centrifugação num novo tubo de recolha de 2 mL de tubo e pipetar 200 μL de tampão 4 directamente para a membrana. Incubar por 1 minuto em temperatura ambiente (RT), em seguida, centrifugar na velocidade máxima por 1 min para eluir DNA.
-
sequenciamento 16S-rDNA e análise de dados
- Use 20-30 NG de DNA para gerar amplicons.
- Use os primers comercialmente disponíveis projetados para as regiões relativamente conservadas que limitam as regiões da hipervariável v3 e v4 das bactérias 16S rDNA. No presente estudo foram utilizados os primers Forward contendo a seqüência "CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT" e os primers reversos contendo a seqüência "GGACTACNVGGGTWTCTAATCC".
- Faça a mistura de reações de PCR adicionando 2,5 μL de tampão 1,2 μL de dNTPs, 1 μL de cada primer, 0,5 μL de DNA polimerase e 20 ng de DNA de modelo em um tubo. Use ddH2o para ajustar o sistema de reação a 25 μL.
- Ajuste os parâmetros da reação do PCR como segue: Realize a pré-desnaturação em 94 ° c por 3 minutos uma vez. Realize a desnaturação em 94 ° c por 5 s, recoze em 57 ° c para 90 s, estenda em 72 ° c por 10 s, e repita este 24X.
- Execute o sequenciamento de fim emparelhado PE250/300 de acordo com a instrução do fabricante e use o pacote de análise de dados QIIME para análise de dados 16S rRNA.
Nota: neste experimento, o sequenciamento de DNA e a análise de dados foram feitos principalmente por uma empresa de sequenciamento profissional.
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Representative Results
O estabelecimento do TBI é mostrado na Figura 1. Após a anestesia e desinfecção, o couro cabeludo foi incisada sagital (Figura 1a). Uma craniotomia (3 mm de diâmetro) foi trefinado no crânio sobre o córtex parietal direito com uma broca elétrica, a dura foi mantida intacta (Figura 1b, C). Uma cânula de lesão plástica foi colocada sobre a janela óssea e cimentada ao crânio usando acrílico dentário (Figura 1D).
O procedimento de percussão de fluido lateral é mostrado na Figura 2. Antes de iniciar o dispositivo foi testado através da entrega de cerca de 10 pulsos até que ele dá um sinal constante. O ângulo do pêndulo foi ajustado para a posição inicial para atingir uma intensidade de pulso de cerca de 2,0 ATM (Figura 2a). A cânula foi preenchida com a solução salina estéril normal. Em seguida, a cânula foi conectada ao dispositivo LFPI (Figura 2b). A lesão cerebral foi induzida pela criação de um impulso na cavidade craniana fechada (Figura 2C).
A coleta de amostras fecais de laparotomia e cécum é mostrada na Figura 3. A laparotomia foi realizada no abdome inferior e ao longo da linha média (Figura 3a). O cécum foi identificado e separado suavemente (Figura 3B, C). O cécum está geralmente localizado na parte inferior direita do abdômen. Foi então incisada com tesouras afiadas (Figura 3D). Os teores de cécum (Figura 3E) foram extraídos e armazenados em tubos de 1,5 ml (Figura 3F). As amostras fecais foram imediatamente armazenadas em-80 ° c antes do uso posterior.
o sequenciamento de 16S-rDNA demonstrou redução da diversidade de microbiota de cécum em camundongos 3 dias após o TCE, os táxons mais abundantes no conteúdo de cécum dos grupos Sham e TBI foram mostrados na Figura 4. O teste de soma do Rank de Wilcoxon foi realizado para avaliar as diferenças microbiota entre os grupos TBI e Sham na análise de sequenciamento 16S, e o valor de p foi menor que 0, 5. A escala multidimensional não métrica (NMDS) também apresentou alteração na composição da microbiota do cécum após TCE (Figura 5).
Figura 1 : Criação da TBI. (A) após anestesia e desinfecção, o couro cabeludo foi incitado. (B) operar uma craniotomia circinato no crânio sobre o córtex parietal direito. (C) manter a dura intacta. (D) cimento a cânula de ferimento plástico ao crânio usando o acrílico dental. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : O procedimento de percussão de fluido lateral. (A) ajuste do ângulo de posição inicial do pêndulo. (B) enchimento da cânula com soro fisiológico estéril normal, em seguida, conexão da cânula ao dispositivo lfpi. (C) indução de lesão cerebral por liberação do pêndulo e criação de um impulso na cavidade craniana fechada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Coleção fecal da amostra da laparotomia e do cécum. (A) início da laparotomia do abdome inferior e ao longo da linha média. (B, C) Identificação do cécum e subsequente (suave) remoção. (D) corte do cécum com tesoura afiada. (E) extração do conteúdo do caecum. F) armazenagem das amostras de conteúdo de cécum em tubos de 1,5 ml de Eppendorf. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : A comparação da diversidade da microbiota do cécum. Os táxons mais abundantes no conteúdo de cécum dos grupos Sham e TBI demonstraram a redução da diversidade de microbiota de cécum em camundongos 3 dias após o TCE. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : A análise de NMDS. A escala multidimensional não-métrica (NMDS) mostrou a composição mudada da microbiota do cécum após TBI. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui apresentamos um protocolo simples e eficiente para determinar alterações na microbiota cecal após TCE em camundongos. A indução de lesão cerebral e a coleta de amostras de conteúdo de cécum são partes críticas do protocolo.
Apesar dos pesquisadores terem estudado as alterações da microbiota intestinal após TCE, a lesão cerebral utilizada nesses estudos foi CCI-8 e queda de peso/modelos induzidos por impacto9. No entanto, o modelo CCI Replica principalmente contusão cerebral, e o modelo de queda de peso pode sofrer de algumas imprecisões. Entre todos os modelos de lesão cerebral existentes, o lfpi é o modelo mais comumente usado, que inclui lesão cerebral focal e difusa11,12 e Replica muitas características importantes observadas em pacientes clínicos com TBI. As etapas chaves durante todo o processo incluem a proteção do dura e manter a cânula hermética. No entanto, tanto a craniotomia quanto a conglutinação requerem o funcionamento de um executor habilidoso, que pode ser uma limitação deste protocolo. No entanto, o LFPI ainda é um método simples, estável e preciso. Portanto, a TBI em camundongos foi induzida por meio do LFPI neste estudo, o que torna o protocolo mais representativo e valioso na pesquisa de lesões cerebrais.
Para a análise da microbiota intestinal, foram utilizadas amostras fecais para sua não-invasividade e conveniência. No entanto, existem algumas limitações da amostragem fecal. Primeiro, a quantidade de fezes coletadas em cada mouse em um determinado ponto de tempo é pequena, e a quantidade de fezes pode ser insuficiente para executar a análise 16S-rDNA. Em segundo lugar, devido à disfunção gastrointestinal pós-traumática, as amostras de fezes são difíceis de coletar durante a fase aguda após a lesão cerebral (1 h pós-lesão neste estudo). Além disso, evidências mostraram que a composição da microbiota fecal é diferente da microbiota em outros segmentos intestinais13. Portanto, os teores de cécum foram coletados para análise da microbiota intestinal neste estudo. A amostragem de conteúdo de caecum requer que os camundongos sejam sacrificados, e esse método permite a amostragem do trato intestinal para exames histológicos e imunológicos, que são importantes aspectos de pesquisa em estudos de disfunção intestinal induzida por lesão cerebral. Adicionalmente, este método pode ser usado para investigar mudanças da microbiota em outros tratos gastrintestinais que incluem o jejunum, o íleo, e os dois pontos. Em conclusão, este protocolo é um método ideal para estudar alterações induzidas por TCE na microbiota intestinal.
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Disclosures
Os autores agradecem sinceramente a Baohong Wang por sua orientação técnica.
Acknowledgments
Os autores não têm nada a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA isolation kit | QIAGEN | 51604 | For fast purification of genomic DNA from stool samples |
| Gene analysis service | GENEWIZ | Gene analyse service | |
| Heating pad | Shanghai SAFE Biotech Co. | TR-200 | heating pad |
| Injector | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | injector | |
| LFPI device | Virginia Commonwealth University |
FP302 | LFPI device |
| Micro cranial drill | RWD Life Science | 78061 | Micro cranial drill |
| Povidone Iodine | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | Povidone Iodine |
References
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