Summary
Hier gepresenteerd is een protocol voor het opwekken van diffuse traumatisch hersenletsel met behulp van een laterale vloeistof percussie-apparaat gevolgd door de verzameling van het caecum inhoud voor gut microbiome analyse.
Abstract
Steeds meer bewijsmateriaal toont aan dat de microbiota-gut-Brain as een belangrijke rol speelt in de pathogenese van hersenziekten. Verschillende studies tonen ook aan dat traumatische hersenletsel veranderingen in de darm microbiota veroorzaken. Echter, mechanismen die aan de bidirectionele regulering van de hersenen-gut as blijven onbekend. Op dit moment, enkele modellen bestaan voor het bestuderen van de veranderingen in gut microbiota na traumatisch hersenletsel. Daarom, de gepresenteerde studie combineert protocollen voor het induceren van traumatisch hersenletsel met behulp van een laterale vloeistof percussie-apparaat en analyse van caecum monsters na letsel voor het onderzoeken van veranderingen in de darm-microbiome. Wijzigingen van de darm microbiota samenstelling na traumatisch hersenletsel worden bepaald met behulp van 16S-rDNA-sequencing. Dit protocol biedt een effectieve methode voor het bestuderen van de relaties tussen enterische micro-organismen en traumatisch hersenletsel.
Introduction
Traumatisch hersenletsel (TBI) is een wereldwijd volksgezondheidsprobleem en de belangrijkste doodsoorzaak en handicap bij jongvolwassenen1,2. TBI veroorzaakt jaarlijks vele sterfgevallen, en overlevenden ervaren een verscheidenheid aan lichamelijke, psychiatrische, emotionele en cognitieve handicaps. Daarom is TBI een zware last voor de familie en de maatschappelijke middelen van de patiënt. TBI omvat zowel het primaire hersenletsel dat optreedt op het moment van trauma en eventuele secundaire hersenletsels die uren tot maanden na het eerste letsel ontwikkelen. Secundaire hersenletsel wordt gemedieerd door verschillende biochemische Cascades, die niet alleen schadelijk zijn voor de hersenen, maar ook aanzienlijke negatieve effecten hebben op verschillende orgaansystemen, waaronder het gastro-intestinale systeem3.
Op dit moment zijn er drie modellen om TBI te induceren in dier experimenten: vloeistof percussie letsel, controle corticale impact (CCI), en gewicht drop versnelling. Laterale vloeistof percussie letsel (LFPI) is het meest gebruikte model om diffuus hersenletsel (DAI)4vast te stellen. Het apparaat produceert hersenletsel door een craniectomie door een korte vloeistofdruk puls toe te passen op de intact Dura. Deze puls wordt gecreëerd door de staking van de slinger. LFPI is een reproduceerbare en bestuurbare modelleringsmethode voor TBI-onderzoek.
De microbiome wordt gedefinieerd als de collectieve genomen van alle micro-organismen die zich in het menselijk lichaam bevinden. Intestinale microben in het bijzonder spelen niet alleen een belangrijke rol in de intestinale homeostase en functie, maar ook het reguleren van vele aspecten van gastheer fysiologie en het functioneren van andere organen5. In de afgelopen jaren, er is steeds meer bewijs dat geeft aan dat gut microbiota reguleren van de ontwikkeling van de hersenen en functie via hersenen-gut assen6. Verstoring van de darm microbiota is gekoppeld aan verschillende hersenfunctie aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson, stemmingsstoornissen, en autisme7. Onlangs, preklinische studies hebben ook gemeld dat acute hersenletsel veranderingen in gut microbiota kan induceren8,9.
Een studie van Treangen et al.10 vond significante dalingen in drie microbiële soorten en verhogingen in twee microbiële soorten na CCI-geïnduceerde TBI. Dit bewijs geeft aan dat de modulatie van gut microbiota een therapeutische methode in TBI Management kan zijn. Echter, de mechanismen onderliggende hersenen letsel-geïnduceerde gut microbiota veranderingen blijven onbekend. Om deze reden is een relatief eenvoudig en efficiënt model van het bestuderen van de veranderingen in gut microbiota na TBI vereist. Daarom presenteert de huidige studie een protocol om veranderingen in gut microbiota na TBI bij muizen te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle uitgevoerde procedures werden goedgekeurd door de experimentele dierenethiek Commissie van de Zhejiang University. Alle instrumenten en materialen die worden gebruikt in chirurgie zijn steriel. De TBI proceudre duurt ongeveer 20 minuten.
1. verzorging van dieren
- Gebruik 5 tot 6 weken oude mannelijke C57BL/6J muizen (20-25 g gewicht) in dit experiment.
- Handhaaf muizen op een licht/donkere cyclus van 12 uur/12 uur en zorg ervoor dat ze voedsel en water ad libitum krijgen. Verstrek dezelfde hoeveelheden voedsel en water aan zowel de Sham-als de TBI-groep tijdens de studie.
- Doe alle inspanningen om het dier pijn en ongemak te minimaliseren.
2. inductie van traumatisch hersenletsel
- Injecteer ketamine (80-100 mg/kg)/Xylazine (10 mg/kg) IP voor anesthesie. Test de diepte van de anesthesie met behulp van een oogreflex of pijn reflex. Gebruik kunstmatige tranen of smeermiddel oogzalf om de ogen te houden van het drogen.
- Na anesthesie, zet de muis in de liggende positie. Gebruik een temperatuurgestuurde verwarmingspad om de temperatuur bij 37 °C te houden tijdens de operatie en gedurende 30 minuten na TBI.
- Scheer het haar van het incisie gebied.
- Desinfecteer de hoofdhuid met 70% ethanol met behulp van drie alternerende Scrubs en geef vervolgens de hoofdhuid op in een Sagittaal vlak.
- Gebruik de tang om de incisie aan beide zijden in te trekken en het periosteum iets te scheiden.
- Gebruik een marker om een cirkel (3 mm diameter) te tekenen op het rechter pariëtale gebied van de schedel, op 2 mm afstand van de middenlijn.
- Boor de schedel met een elektrische boor. Zorg ervoor dat deze stap zorgvuldig wordt uitgevoerd om de Dura te beschermen tegen beschadiging.
- Verwijder de botflap en stel een klein botvenster (3 mm in diameter) bloot.
- Plaats een kunststof letsel canule (inwendige diameter = 2,5 mm, lengte = 8 mm) over de craniotomie en cement de canule aan de schedel met behulp van een tandheelkundige acryl.
- Vul de canule met steriele 0,9% NaCl (normale zoutoplossing) met behulp van een spuit (5 mL) om er zeker van te zijn dat er geen bubbels in de canule zitten.
- Schakel de oscilloscoop en de versterker in en zorg ervoor dat de Hogedruk buis van het laterale vloeistof percussie letsel (LFPI)-apparaat vrij is van luchtbellen. Test het apparaat door ongeveer 10 pulsen te leveren totdat het een stabiel signaal geeft. Pas de hoek van de startpositie van de slinger aan om een puls-intensiteit van ongeveer 2,0 ATM te bereiken.
- Sluit de blessure canule aan op het LFPI-apparaat. Hersenletsel induceren door de trigger te trekken en de slinger los te laten. Vervolgens verkrijgt u een puls en zendt u deze door het volledige slangen systeem met gesloten vloeistoftoevoer naar de Dura.
- Bedien de muizen in de Sham-groep met dezelfde chirurgische ingreep. Voer de LFPI niet uit.
3. behandeling na de operatie
- Na het induceren van de hersenletsel, verwijder de plastic canule en hechting van de incisie. Tijdens chirurgie toedienen buprenorfine (2mg/kg) SQ of IP en daarna elke 6-12 h gedurende drie dagen.
- Leg de muis op een verwarmingskussen totdat het ambulant is. Stel de temperatuur van het verwarmingspaneel in op 37 °C om anestheticum reanimatie te versnellen.
- Zet de muis terug in de kooi en dien voedsel en water ad libitumtoe.
4. laparotomie en monsterverzameling uit het caecum
- Euthaniseer de muizen door CO2 gevolgd door cervicale dislocatie op de corresponderende tijdstippen.
Opmerking: in dit experiment waren de gekozen tijdspunten 1 h, 6 h, 1 d, 3 d en 7 d post-traumatisch hersenletsel om de dynamische evolutie van gut microbiota te analyseren. - Verwijder het haar van het oppervlak van de buik. Desinfecteer de buik met 70% ethanol.
- Plaats een steriel gordijn over de muis. Maak een incisie van de onderste buik middenlijn, net boven de voor huid in de mannelijke muizen.
- Nadat de darmen zijn blootgesteld, lokaliseren van de blindedarm en zachtjes gescheiden van andere intestinale tracten. Vermijd het grijpen van de blindedarm met getande of scherpe Tang. Gebruik atraumatische Tang, zoals Adson Tang met serraties.
- Snijd het caecum met een scherpe schaar.
- Extraheer de caecum-inhoud handmatig op steriel verband en bewaar de inhoud in 1,5 mL micro centrifugebuizen.
- Bewaar de caecum inhoud bij-80 °C tot de microbiome analyse.
5. DNA-extractie en 16S-rDNA-sequencing en data-analyse
-
Isolatie van DNA uit ontlasting
Opmerking: voor dit experiment is een in de handel verkrijgbare DNA-isolatiekit (tabel met materialen) gebruikt.- Gebruik een scalpel om 300 mg uitwerpselen in een 2 ml micro centrifugebuis te Schraap en plaats de buis op ijs.
- Voeg 1 mL van de remmen buffer toe aan elk monster. Vortex continu gedurende 1 min of totdat het uitwerpselen monster grondig wordt gehomogeniseerd.
- Centrifugeer het monster met de maximale snelheid gedurende 1 minuut om de feces deeltjes te pellet.
- Pipetteer 2 μL proteïnase K in een nieuwe micro centrifugebuis van 2 ml. Pipet teren 600 μL van de supernatant uit stap 5.1.3 in de micro centrifugebuis van 2 ml die proteïnase K bevat. Voeg vervolgens 600 μL buffer 1 en Vortex toe voor 15 sec.
- Incuberen het monster gedurende 10 min bij 70 °C.
- Voeg 600 μL 100% ethanol toe aan het lysaat (1:1 ratio) en meng door vortexing. Centrifugeer bij de maximumsnelheid kort om druppels van de binnenkant van het buis deksel te verwijderen.
- Breng 600 μL lysaat aan op de spin kolom. Centrifugeer bij de maximumsnelheid gedurende 1 minuut. Gooi de doorstroom weg. Herhaal deze stap nog een keer. Vervolgens de kolom overbrengen naar een nieuwe 2 mL collectie buis.
- Open de draai kolom en voeg 500 μL buffer 2 toe. Centrifugeer bij de maximumsnelheid gedurende 1 min. Verwijder de kolom en plaats deze in een nieuwe 2 mL opvang buis.
- Voeg 500 μL buffer 3 toe aan de kolom. Centrifugeer bij de maximumsnelheid gedurende 3 min. Gooi de doorstroom weg. Herhaal het Centrifugeer proces eenmaal om er zeker van te zijn dat de buffer 3 volledig is geellueerd.
- Plaats de spin kolom in een nieuw buisje van 2 mL en Pipetteer 200 μL buffer 4 rechtstreeks op het membraan. Inbroed gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (RT) en centrifugeer vervolgens op de maximumsnelheid gedurende 1 minuut om het DNA te Elderen.
-
16S-rDNA-sequencing en data-analyse
- Gebruik 20-30 ng van DNA om amplicons te genereren.
- Gebruik in de handel verkrijgbare primers ontworpen voor de relatief geconcongeerde regio's grenzend aan de V3 en v4 hypervariable regio's van bacteriën 16S rDNA. De voorwaartse primers met de sequentie "CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT" en omgekeerde primers met de sequentie "GGACTACNVGGGTWTCTAATCC" werden gebruikt in de huidige studie.
- Maak de PCR-reacties mengsel door toevoeging van 2,5 μL buffer 1,2 μL dNTPs, 1 μL van elke primer, 0,5 μL van de DNA-polymerase en 20 ng van het template-DNA in een buisje. Gebruik ddH2O om het reactiesysteem aan te passen tot 25 μL.
- Stel de PCR-reactieparameters als volgt in: Voer de pre-denaturatie bij 94 °C gedurende 3 minuten. Voer denaturatie uit bij 94 °C gedurende 5 s, anneal bij 57 °C voor 90 s, Verleng bij 72 °C gedurende 10 sec. en herhaal deze 24x.
- Voer PE250/300 gekoppelde-end-sequencing uit volgens de instructies van de fabrikant en gebruik het QIIME-gegevensanalyse pakket voor 16S rRNA-gegevensanalyse.
Opmerking: in dit experiment, de DNA-sequencing en data-analyse werden voornamelijk gedaan door een professionele sequencing bedrijf.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De oprichting van TBI wordt weergegeven in Figuur 1. Na anesthesie en desinfectie, de hoofdhuid werd ingesneden sagittally (Figuur 1a). Een craniotomie (3 mm in diameter) werd in de schedel op de rechter pariëtale cortex getreesd met een elektrische boor, de Dura werd intact gehouden (Figuur 1b, C). Een plastic letsel canule werd geplaatst over het botvenster en gecementeerd aan de schedel met behulp van tandheelkundige acryl (figuur 1d).
De procedure van laterale vloeistof percussie wordt weergegeven in Figuur 2. Vóór het starten van het apparaat werd getest door het leveren van ongeveer 10 pulsen totdat het geeft een stabiel signaal. De hoek van de slinger werd ingesteld op de uitgangspositie om een puls-intensiteit te bereiken van ongeveer 2,0 ATM (Figuur 2a). De canule was gevuld met de steriele normale zoutoplossing. Vervolgens werd de canule aangesloten op het LFPI-apparaat (Figuur 2b). Hersenletsel werd veroorzaakt door het creëren van een impuls in de gesloten craniale Holte (figuur 2c).
Laparotomie en caecum fecale sample Collection worden getoond in Figuur 3. De laparotomie werd uitgevoerd op de onderbuik en langs de middenlijn (Figuur 3a). Het caecum werd geïdentificeerd en zachtjes gescheiden (Figuur 3b, C). Het caecum bevindt zich meestal in de rechterbenedenhoek van de buik. Het werd vervolgens ingesneden met een scherpe schaar (figuur 3D). De inhoud van caecum (figuur 3e) werd geëxtraheerd en opgeslagen in 1,5 ml buisjes (figuur 3F). Fecale monsters werden onmiddellijk bij-80 °C bewaard voor verder gebruik.
16S-rDNA-sequencing toonden verminderde diversiteit van caecum microbiota bij muizen 3 dagen na TBI werd de meest overvloedige taxa in caecum-inhoud van Sham en TBI-groepen getoond in Figuur 4. De Wilcoxon Rank Sum-test werd uitgevoerd om microbiota-verschillen tussen TBI-en Sham-groepen in de 16S-sequentieanalyse te evalueren en de p -waarde was lager dan 0,05. De niet-metrische multi-dimensionale schaling (NMD'S) toonde ook veranderde samenstelling van caecum microbiota na TBI (Figuur 5).
Figuur 1 : Oprichting van TBI. A) na anesthesie en desinfectie werd de hoofdhuid ingesneden. (B) gebruik een circinate craniotomie op de schedel over de rechter pariëtale cortex. (C) Houd de Dura intact. D) cement de plastic letsel canule aan de schedel met behulp van tandheelkundige acryl. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : De procedure van laterale vloeistof percussie. A) afstelling van de beginpositie hoek van de slinger. B) vulling van de canule met steriele normale zoutoplossing en vervolgens de aansluiting van de canule op het LFPI-apparaat. (C) hersenletsel inductie door afgifte van de slinger en het creëren van een impuls in de gesloten schedelholte. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Laparotomie en caecum fecale sample Collection. (A) begin van de laparotomie uit onderbuik en langs de middenlijn. (B, C) Identificatie van het caecum en daaropvolgende (zachte) verwijdering. D) snijden van het caecum met een scherpe schaar. E) extractie van de inhoud van caecum. F) opslag van het caecum-gehalte monsters in 1,5 ml Eppendorf-buizen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : De vergelijking van de diversiteit van caecum microbiota. De meeste overvloedige taxa in caecum-inhoud van Sham en TBI-groepen toonden een verminderde diversiteit van caecum microbiota aan in muizen 3 dagen na TBI. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : De NMDS-analyse. Niet-metrische multidimensionale schaling (NMD'S) toonde veranderde samenstelling van caecum microbiota na TBI. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier gepresenteerd is een eenvoudig en efficiënt protocol om veranderingen in cecal microbiota na TBI bij muizen te bepalen. Inductie van hersenletsel en het verzamelen van caecum-inhoud monsters zijn kritische delen van het protocol.
Ondanks onderzoekers hebben bestudeerd de veranderingen van gut microbiota na TBI, de hersenen letsel gebruikt in deze studies waren CCI-8 en gewicht drop/impact-geïnduceerde modellen9. Echter, het CCI model repliceert meestal hersen contusie, en het gewicht druppel model kan last hebben van enkele onnauwkeurigheden. Onder alle bestaande hersenletsel modellen, lfpi is het meest gebruikte model, die focal en diffuus hersenletsel11,12 omvat en repliceert vele belangrijke functies waargenomen bij klinische TBI-patiënten. Belangrijke stappen in het hele proces omvatten bescherming van de Dura en het houden van de canule luchtdicht. Echter, zowel craniotomie en conglutinatie vereisen de werking van een bekwame performer, die een beperking van dit protocol kan zijn. LFPI is echter nog steeds een eenvoudige, stabiele en nauwkeurige methode. Daarom werd TBI in muizen geïnduceerd met behulp van LFPI in deze studie, wat het protocol meer representatief en waardevol maakt in hersenletsel onderzoek.
Voor gut microbiota analyse, fecale monsters werden gebruikt voor de niet-invasiviteit en gemak. Niettemin, er zijn enkele beperkingen van fecale bemonstering. Eerste, de hoeveelheid ontlasting verzameld in elke muis op een bepaald tijdstip is klein, en de hoeveelheid ontlasting kan onvoldoende zijn om 16S-rDNA-analyse uit te voeren. Ten tweede, als gevolg van post-traumatische gastro-intestinale dysfunctie, ontlasting monsters zijn moeilijk te verzamelen tijdens de acute fase na hersenletsel (1 h post-letsel in deze studie). Bovendien, bewijs heeft aangetoond dat fecale microbiota samenstelling verschilt van microbiota in andere intestinale segmenten13. Daarom, caecum inhoud werden verzameld voor gut microbiota analyse in deze studie. Caecum inhoud bemonstering vereist dat muizen worden geofferd, en deze methode maakt het mogelijk voor de bemonstering van intestinale tractus voor histologische en immunologische onderzoeken, die belangrijk onderzoek aspecten in studies van hersenletsel-geïnduceerde gut dysfunctie. Bovendien, deze methode kan worden gebruikt om te onderzoeken microbiota veranderingen in andere gastro-intestinale Tracts met inbegrip van de jejunum, ileum, en Colon. Concluderend, dit protocol is een ideale methode voor het bestuderen van TBI-geïnduceerde veranderingen in gut microbiota.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs danken Baohong Wang oprecht voor haar technische begeleiding.
Acknowledgments
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA isolation kit | QIAGEN | 51604 | For fast purification of genomic DNA from stool samples |
| Gene analysis service | GENEWIZ | Gene analyse service | |
| Heating pad | Shanghai SAFE Biotech Co. | TR-200 | heating pad |
| Injector | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | injector | |
| LFPI device | Virginia Commonwealth University |
FP302 | LFPI device |
| Micro cranial drill | RWD Life Science | 78061 | Micro cranial drill |
| Povidone Iodine | The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University | Povidone Iodine |
References
- Cheng, P., et al. Trends in traumatic brain injury mortality in China, 2006-2013: A population-based longitudinal study. 14, e1002332 (2017).
- Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
- Gaddam, S. S., Buell, T., Robertson, C. S.
- Kabadi, S. V., et al. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
- Fung, T. C., Olson, C. A., Hsiao, E. Y. Interactions between the microbiota, immune and nervous systems in health and disease. Nature Neuroscience. 20, 145-155 (2017).
- Collins, S. M., Surette, M., Bercik, P. The interplay between the intestinal microbiota and the brain. Nature Reviews Microbiology. 10, 735-742 (2012).
- Cryan, J. F., Dinan, T. G. Mind-altering microorganisms: the impact of the gut microbiota on brain and behaviour. Nature Reviews Neuroscience. 13, 701-712 (2012).
- Nicholson, S. E., et al. Moderate Traumatic Brain Injury Alters the Gastrointestinal Microbiome in a Time-Dependent. Shock. , (2018).
- Houlden, A., et al. Brain injury induces specific changes in the caecal microbiota of mice via altered autonomic activity and mucoprotein production. Brain, Behavior, and Immunity. 57, 10-20 (2016).
- Treangen, T. J., et al. Traumatic Brain Injury in Mice Induces Acute Bacterial Dysbiosis Within the Fecal Microbiome. Frontiers in Immunology. 9, 2757 (2018).
- Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral fluid percussion: model of traumatic brain injury in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Thompson, H. J., et al. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. Journal of Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).
- Pang, W., Vogensen, F. K., Nielsen, D. S., Hansen, A. K. Faecal and caecal microbiota profiles of mice do not cluster in the same way. Laboratory Animals. 46, 231-236 (2012).
