يهدف هذا البروتوكول إلى توليد الخلايا العصبية البينية المعاد برمجتها مباشرة في الجسم الحي، وذلك باستخدام نظام فيروسي قائم على AAV في الدماغ ومراسل GFP يعمل على إزالة المشبك المرن، والذي يسمح بتحديد الخلايا والمزيد من التحليل في الجسم الحي.
تحويل glia المقيم في الدماغ إلى الخلايا العصبية الوظيفية وsubtype محددة في الجسم الحي يوفر خطوة إلى الأمام نحو تطوير العلاجات البديلة استبدال الخلايا في حين أيضا خلق أدوات لدراسة مصير الخلية في الموقع. حتى الآن، كان من الممكن الحصول على الخلايا العصبية عن طريق إعادة برمجة في الجسم الحي، ولكن النمط الظاهري الدقيق لهذه الخلايا العصبية أو كيف تنضج لم يتم تحليلها بالتفصيل. في هذا البروتوكول، ونحن نصف تحويل أكثر كفاءة وتحديد خلية محددة من الخلايا العصبية في الجسم الحي إعادة برمجتها، وذلك باستخدام نظام ناقلات الفيروسية المستندة إلى AAV. كما نقدم بروتوكولاً للتقييم الوظيفي للنضج العصبي للخلايا المعاد برمجتها. عن طريق حقن ناقلات استئصال الوجه (FLEX)، التي تحتوي على إعادة برمجة والجينات مراسل يحركها المشبك إلى أنواع محددة من الخلايا في الدماغ التي تعمل كهدف لإعادة برمجة الخلايا. تسمح هذه التقنية بتحديد الخلايا العصبية المعاد برمجتها حديثًا بسهولة. تظهر النتائج أن الخلايا العصبية المعاد برمجتها التي تم الحصول عليها ناضجة وظيفيا مع مرور الوقت، وتلقي الاتصالات متشابك وتظهر الخصائص الكهرولوجية لأنواع مختلفة من الخلايا العصبية البينية. باستخدام عوامل النسخ Ascl1، Lmx1a وNurr1، فإن غالبية الخلايا المعاد برمجتها لها خصائص الخلايا العصبية البينية التي تحتوي على البارافيلوبينات بسرعة.
الهدف العام لهذه الطريقة هو تحويل بكفاءة glia المقيم الدماغ في الجسم الحي إلى الخلايا العصبية وظيفية وsubtype محددة مثل parvalbumin التعبير عن الخلايا العصبية. وهذا يوفر خطوة إلى الأمام نحو تطوير بديل بديل للخلايا استبدال العلاج لأمراض الدماغ دون الحاجة إلى مصدر خلية خارجية. كما أنه يخلق أداة لدراسة مفاتيح مصير الخلية في الموقع.
الدماغ لديه قدرة محدودة فقط لتوليد الخلايا العصبية الجديدة. لذلك ، في الأمراض العصبية ، هناك حاجة إلى مصادر الخلايا الخارجية لإصلاح الدماغ. لهذا، تعرضت مصادر مختلفة من الخلايا لأبحاث مكثفة على مر السنين، بما في ذلك الخلايامن الأنسجة الأولية، والخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية والخلايا المعاد برمجتها 1،2،3. إعادة برمجة مباشرة من خلايا الدماغ المقيمة في الخلايا العصبية هو النهج الأخير الذي يمكن أن توفر طريقة جذابة لإصلاح الدماغ كما أنه يستخدم خلايا المريض الخاصة لتوليد الخلايا العصبية الجديدة داخل الدماغ. حتى الآن، وقد أظهرت عدة تقارير في إعادة برمجة الجسم الحي من خلال تسليم ناقلات الفيروسية في الدماغ4،5،6،78،9 في مناطق الدماغ المختلفة مثل القشرة، الحبل الشوكي، السترياتوم ومنتصف الدماغ5،10،11،وكذلك في الدماغ سليمة وآفة5،8،11،12. وقد تم الحصول على كل من الخلايا العصبية المثبطة والمحفزة4,8, ولكن النمط الظاهري الدقيق أو وظيفة هذه الخلايا لم يتم تحليلها بعد بالتفصيل.
في هذا البروتوكول، ونحن نصف إعادة برمجة أكثر كفاءة وتحديد خلية محددة من الخلايا العصبية في الجسم الحي إعادة برمجتها. نحن نقدم بروتوكول اعادة التقييم الوظيفي للنضج العصبي وتوصيف النمط الظاهري على أساس الوظائف والصفات المناعية الكيميائية.
استخدمنا ناقل AAV Cre-inducible ومراسل GFP لتحديد الخلايا العصبية في الجسم الحي إعادة برمجتها. هذا الاختيار من ناقلات الفيروسية لديه ميزة إصابة كل من الخلايا القسمة وغير المقسمة في الدماغ، وزيادة عدد الخلايا المستهدفة، كبديل لاستخدام الفيروس الرجعي7،8. وقد مكّننا مراسل FLEX الذي يحركه المشبك العصبي (GFP) من الكشف عن الخلايا العصبية التي تم إنشاؤها حديثًا على وجه التحديد. وقد استخدمت الدراسات السابقة المروجين نوع فرعي محدد لفي إعادة برمجة الجسم الحي7،9، التي تسمح أيضا التعبير عن إعادة برمجة الجينات والصحفيين في أنواع محددة من الخلايا. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة تتطلب المزيد من تحديد الخلايا العصبية المعاد برمجتها عن طريق تحليل ما بعد الوفاة للتعبير المشترك للمراسل وعلامات الخلايا العصبية. استخدام مراسل الخلايا العصبية الخاصة، مثل واحد الموصوفهنا، يسمح لتحديد الهوية المباشرة. وهذا يوفر دليلا مباشرا على نجاح التحويل ويسمح لتحديد الخلية الحية المطلوبة للفيزيولوجيا الكهربائية التصحيح المشبك.
في الجسم الحي إعادة البرمجة المباشرة يمكن أن يتحقق باستخدام ناقلات AAV FLEX في سلالات الماوس التعبير عن Cre. من المهم ملاحظة أنه قد لوحظت اختلافات بين سلالات الماوس فيما يتعلق بفعالية إعادة البرمجة. لفي إعادة برمجة الجسم الحي في striatum، وقد ثبت خط الماوس NG2-Cre لتكون أكثر كفاءة بالمقارنة مع سلالات أخرى. قبل البدء في استخدام سلالة حيوانية جديدة، من المهم التحقق من المبادئ التوجيهية لموفر الماوس فيما يتعلق بالتعبير عن Cre مع مرور الوقت، حيث أن عمر الحيوانات غالباً ما يؤثر على خصوصية هذا التعبير البروتيني. في دراساتنا، لم تستخدم الحيوانات التي يزيد عمرها عن 12 أسبوعاً في إعادة برمجة الجسم الحي حيث كان هناك خطر على التعبير عن الكري في خلايا أخرى غير NG2 glia. وينصح الوجود المستمر ورصد الحيوانات التحكم حقن فقط مع شنابسين-فليكس-GFP البناء. وهذا يسمح برصد الحيوانات للخلايا الإيجابية GFP التي لا ينبغي أن تكون موجودة إذا لم يتم استخدام أي الجينات إعادة برمجة (ALN).
لتحديد الخلايا العصبية المعاد برمجتها حديثا، طريقة تحديد الخلايا العصبية الخاصة مثل تلك الموصوفة في هذا البروتوكول هي ذات أهمية قصوى. وهذا يسمح لتحديد وتمييز السليم من الخلايا العصبية المعاد برمجتها من الخلايا المحيطة الذاتية التي لها أهمية خاصة عند إعادة البرمجة في منطقة متجانسة.
من المهم أيضا استهداف الهيكل الصحيح للحقن الفيروسي. ولذلك، فإن جراحة مجسمة للحقن الفيروسي مهمة وتحتاج إلى التعامل معها بدقة، وخاصة عند استهداف هياكل أصغر من الدماغ.
لقد أظهرنا في السابق11 أنه لا يمكن الاعتماد على التنبؤ بنتائج إعادة البرمجة في الجسم الحي على أساس تجارب إعادة البرمجة في المختبر باستخدام نفس عوامل إعادة البرمجة. وبالتالي فإن جميع عوامل الاهتمام تحتاج إلى اختبار في الجسم الحي. في أيدينا, العديد من تركيبات عوامل مختلفة تعطي نفس النوع الفرعي من الخلايا العصبية (أي, بين الخلايا العصبية11 في الجسم الحي) على الرغم من حقيقة أن هذه الجينات قد تورطت في تطوير الخلايا العصبية الأخرى.
مشبك التصحيح كامل الخلية للخلايا العصبية المعاد برمجتها هو تقنية حساسة ومعالجة الأنسجة أمر مهم للحصول على نتيجة جيدة. التسريب مع حل كريبس الجليد الباردة يحسن نوعية الأنسجة. أيضا، الخلايا العصبية مصححة تحتاج إلى أن تعامل بعناية. حتى لو كان النضج والهوية الفينوتية من الخلايا العصبية المعاد برمجتها يمكن تقييمها إلى حد ما باستخدام المشبك التصحيح الخلية الكاملة, هذه الخلايا ليست قابلة للمقارنة تماما لنظرائهم الذاتية. وينبغي استخدام أنواع إضافية من التحليل، مثل تسلسل الجينوم (مثل تسلسل الحمض النووي الريبي) لزيادة تأكيد هوية الخلايا المعاد برمجتها.
ويمكن النظر في التقنية الموصوفة هنا لتطوير العلاجات المستقبلية حيث هناك حاجة إلى استبدال الخلايا العصبية في الدماغ. على الرغم من أن إعادة البرمجة في الجسم الحي لا تزال في مراحلها المبكرة وترجمتها إلى البشر لم تكن متوقعة بعد، فإن هذه التقنية يمكن أن توفر طريقة لتقييم وظيفة الجينات الخارجية في الدماغ ودراسة نضج الخلايا في الجسم الحي.
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل مارسيلا بيرتلي من قبل برنامج أفق الاتحاد الأوروبي 2020 (H2020-MSCA-ITN-2015) في إطار شبكات التدريب المبتكرة ماري سكلودوسكا كوري واتفاق المنح رقم 676408. تم تمويل دانييلا رايلاندر أوتوسون من قبل مجلس البحوث السويدي (2017-01234).
REAGENTS FOR AAV5 CLONING AND VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
pAAV-CA-FLEX | AddGene | 38042 | |
Ascl1 | AddGene | 67291 | NM_008553.4 |
Lmx1a | AddGene | 33013 | NM_0033652.5 |
Nurr1 | AddGene | 35000 | NM_013613.2 |
GFP-syn | AddGene | 30456 | |
LoxP (FLEX) sequence 1 | GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga agaggctctaga |
||
LoxP (FLEX) sequences 2 | tactagtataacttcgtataggatactttatac gaagttatcattgggattcttcctattttgatc caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct caccatcgacccataacttcgtatagcatacat tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC |
||
pDP5 | Plasmid Factory | PF435 | |
pDP6 | Plasmid Factory | PF436 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
FBS (Fetal bovine serum) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)+ Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61965026 | |
DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffer Saline) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
HEK293 cells | Thermo Fisher Scientific | 85120602-1VL | |
Flasks | BD Falcon | 10078780 | 175 cm2 |
Tris H-CL | Sigma Aldrich | 10812846001 |
For TE buffer use 10 mM, pH 8.0; for lysis buffer use 50mM, pH 8.5; for IE buffer use 20 mM, pH 8.0; for elution buffer use 20 mM, pH 8.0
|
EDTA | EDTA: Invitrogen | EDTA: AM9260G |
For TE buffer use 1 mM EDTA
|
Ultrapure water |
see Ultrapure water system
|
||
CaCl2 | SigmaAldrich | C5080 | 2.5 M |
Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 |
FOR HBS use 140 mM; for Lysis Buffer use 150 mM; for IE buffer use 15 mM; for elution buffer use 250 mM
|
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G |
For lysis Buffer: 1 mM
|
Ultracentrifuge sealing tubes | Beckman Coulter | Quick-Seal® Polypropylene Tube | |
OptiPrep™ Density Gradient Medium | Sigma Aldrich | D1556-250ML | |
10-mL syringe-18G needle | BD | 305064 | |
Laboratory glass bottles | VWR | ? | |
Anion exchange filter | PALL laboratory | MSTG25Q6 |
Acrodisc unit with Mustang Q membrane
|
Centrifugal filter unit | Merck | Z740210-24EA |
Amicon Ultra-4 device
|
Endotoxin-Free Plasmid DNA Isolation Kits | Thermo Fisher Scientific | A33073 | |
Na2PO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | 15 mL |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352196 | |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352070 | |
Glass Vials | Novatech | 30209-1232 |
CGGCCTCAGFGAGCGA
|
Forward Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
GGAACCCCTAGTGATGGAGTT
|
||
Reverse Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG
|
||
5´FAM / 3´BHQ1 probe | Jena Bioscience | ||
0.22 mm filter | Merck | SLGV004SL | Millex-GV filter |
EQUIPMENT AAV5 VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
Freezer -20 °C | |||
Freezer -80 °C | |||
Fridge +4 °C | |||
AAV viral room | |||
Ultrapure Water system | Merck | Milli-Q® IQ 7000 | |
Vortex mixer | VWR | 444-0004 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | |
Autoclave | Tuttnauer | 2540 EL | |
Polymerase Chain Reaction (PCR) | BioRad | C1000 Touch Thermal Cycler | |
Quantitative PCR (qPCR) | Roche | LightCycler® 480 System | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST16 | |
Water Bath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
ANIMAL MODEL | |||
NG2-Cre mice | Jackson | NG2-CrexB6129, Stock #008533 | |
REAGENTS FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN | |||
Water | |||
Saline | Apoteket AB | 70% | |
Ethanol | Solveco | ||
Isolfurane | Apoteket AB |
Dilute to 1% solution with warm water.
|
|
Virkon | Viroderm | 7511 | |
Pentobarbital | Apoteket AB | P0500000 |
i.p. for terminal procedure at the dose of 60 mg/ml.
|
Sucrose | Merck | S0389-500G | |
Trypan Blu | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Retrobeads | Lumafluor | R170 | |
Buprenorphine | Apoteket AB | ||
EQUIPMENT FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN |
From RSG Solingen.
|
||
Scissors | VWR | 233-1552 | From Biochem. |
Tweezers | VWR | 232-0007 | |
Forcep | VWR | 232-0120 | |
Scalpel holder | VWR | RSGA106.621 | Number 20. |
Scalpel | VWR | RSGA106.200 | |
Stereotaxic frame | Stoelting Europe | 51500D | |
Mouse ear bars | Stoelting Europe | 51648 | 5 ul |
Syringe with Removable needle | Hamilton Company | 65 |
0,75 inner diameter and 1.5 outer diameter.
|
Glass capilaries | Stoelting | 50811 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Dental drill | Agnthos AB | 1464 | |
Shaver | Agnthos AB | GT420 | |
Isoflurane Chamber and pump | Agnthos AB | 8323101 | 2 mL |
Syringes | Merck | Z118400-30EA | 25G |
Needles | Merck | Z192414 Aldrich | |
Mouse and neonatal rat adaptor for stereotaxic fram | Stoelting | 51625 | |
Heating pad | Braintree scientific, inc | 53800M |
From Covidien 2187.
|
Cotton gauze | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
Rubber tube | Elfa Distrelec | HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150 | |
Cotton swabs | Fisher Scientific | 18-366-473 | |
REAGENTS FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
NaH2PO4-H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
MgCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
CaCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | C8106 | |
MgSO4-7 H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 |
see Ultrapure Water system
|
Ultrapure Water | Prepare 1 or 2M. | ||
KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
K-D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 Sigma | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KOH-EGTA (Etilene glycol-bis-N-tetracetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 Sigma | |
KOH- Hepes acid (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Mg2ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
Na3GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
Picrotoxin | Merck | P1675 Sigma | |
CNQX | Merck | C239 Sigma | |
Ice | |||
EQUIPMENT FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
Borosilicate glass pipette | Sutter Company | B150-86-10 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Vibratome | Leica | Leica VT1000 S | |
WaterBath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
Clampfit software | Molecular Devices | ||
Multiclamp software | Molecular Devices | ||
REAGENTS FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY |
Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin.
|
||
Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 |
Use at a concentration of 0.1%.
|
Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 |
Donkey.Use at a concentration of 1 : 400.
|
Serum | Merck Millipore | S30-100ML |
Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500.
|
4′,6-Diamidino-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 |
1: 600 in KPBS-T.
|
streptavidin- Cy3 | Thermo Fisher Scientific | 434315 | 1:5000, rabbit. |
Anti-GAD65/67 | Abcam | 1:2000, mouse. | |
Anti-PV | Sigma | P3088 | 1:200, goat. |
Anti-Chat | Merk | AB143 | 1:5000, rabbit. |
Anti-NPY | Immunostar | 22940 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | 1:1000, chicken. |
Anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
Mounting solution | Merck | 10981 |
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading
|
OCT | Agar Scientific | ||
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
Distilled water | |||
Anti-freeze solution | Tissue Pro Technology | AFS05-1000N, 1000 mL/ea. | |
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Confocal microscope | Leica | TCS SP8 laser scanning confocal microscope. | |
Prism | GraphPad | ||
Microtome | Leica | SM2010R |