פרוטוקול זה מתכוון לייצר האינטרנוירונים מתוכנת באופן ישיר ב-vivo, באמצעות מערכת ויראלי מבוססי AAV במוח וכתבת ה-GFP FLEX סינפסין, המאפשרת זיהוי תאים וניתוח נוסף בvivo.
המרת התושב גליה במוח לתוך הנוירונים פונקציונלי מסוג אחד ספציפי ב vivo מספק צעד קדימה לקראת התפתחות של טיפולים חלופיים החלפת תאים תוך יצירת כלים גם לחקור את גורל התא באתרו. עד כה, ניתן היה להשיג נוירונים באמצעות vivo תכנות מדויק, אבל הפנוטיפ המדויק של נוירונים אלה או איך הם בוגרים לא נותחו בפרוטרוט. בפרוטוקול זה, אנו מתארים המרה יעילה יותר הזיהוי הספציפי לתא של vivo מתוכנת נוירונים, באמצעות מערכת וקטורים מבוססי AAV ויראלי. אנו מספקים גם פרוטוקול להערכה תפקודית של ההבשלה העצבית של התאים שתיכנתו. על-ידי הזרקת וקטורים מסוג ‘ היפוך כריתה ‘ (FLEX), המכיל את גנים הכתב המתיכנות מראש והסינפסין לסוגי תאים ספציפיים במוח המשמשים כיעד לתיכנות מדויק של התא. טכניקה זו מאפשרת זיהוי קל של הנוירונים החדשים שעוצבו מחדש. התוצאות מראות כי הנוירונים שהתקבלו מתוכנת מחדש פונקציונלית בוגרת לאורך זמן, לקבל אנשי קשר סינפטית ולהציג מאפיינים אלקטרולוגיים של סוגים שונים של האינטרנוירונים. באמצעות שעתוק הגורמים Ascl1, Lmx1a ו Nurr1, רוב התאים התיכנתו יש מאפיינים של מהיר העולה, parvalbumin המכיל באינטרנוירונים.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא להמיר ביעילות את המוח תושב glia ב vivo לתוך הנוירונים פונקציונלי מסוג אחד ספציפיים כגון parvalbumin-הביע interneurons. זה מספק צעד קדימה לקראת הפיתוח של טיפול חלופי החלפת התא עבור מחלות המוח ללא צורך מקור תא אקסוסוגני. זה גם יוצר כלי לחקור את מתגי הגורל התא באתרו.
המוח יש רק קיבולת מוגבלת ליצירת נוירונים חדשים. לכן, במחלות נוירולוגיות, יש צורך של מקורות תא אקסוגני לתיקון המוח. בשביל זה, מקורות שונים של תאים נחשפו למחקר אינטנסיבי במהלך השנים, כולל תאים מרקמות ראשוני, תאי גזע הנגזרים תאים ותאים מתוכנת מחדש1,2,3. מחדש ישירות של תאי המוח תושב לתוך הנוירונים היא גישה האחרונות שיכול לספק שיטה אטרקטיבית לתיקון המוח כפי שהוא משתמש בתאים של החולה ליצירת נוירונים הרומן בתוך המוח. עד היום, מספר דיווחים הראו vivo תכנות מחדש באמצעות משלוח וקטורי ויראלי במוח4,5,6,78,9 באזורי מוח שונים כגון הקליפה, חוט השדרה, סטריאטום והמוח המאמצע5,10,11, כמו גם במוח השלם ולגירסה5,8,11,12. הן נוירונים מעכבות ומרגש הושגו4,8, אבל הפנוטיפ מדויק או פונקציונליות של תאים אלה עדיין לא נותחו בפרוטרוט.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים התכנות יעיל יותר וזיהוי תא ספציפי של vivo נוירונים מתוכנת. אנו מספקים פרוטוקול להערכה תפקודית של ההבשלה העצבית והאפיון הפנוטיפ המבוסס על פונקציונליות ותכונות אימונוהיסטוכימיה.
השתמשנו inducible וקטור AAV של היצורים וכתבת GFP כדי לזהות את הנוירונים vivo מתוכנת. בחירה זו של וקטורים ויראלי יש את היתרון של הדבקה הן חלוקת תאים בלתי מפרידים של המוח, הגדלת מספר תאים ייעודיים, כחלופה לשימוש של רטרו וירוס7,8. כתבת FLEX (GFP) ספציפית לעצב-מסינפסין, אפשרה לנו לזהות במיוחד את הנוירונים שנוצרו לאחרונה. מחקרים קודמים השתמשו היזמים ספציפיים למשנה עבור ב vivo תכנות7,9, כי גם לאפשר את הביטוי של גנים התיכנות מראש וכתבים בסוגי תאים ספציפיים. עם זאת, שיטה זו מחייבת זיהוי נוסף של נוירונים מתוכנת על ידי ניתוח לאחר המוות של הביטוי המשותף של כתב וסמנים עצביים. השימוש בכתב מסוים בעצב, כגון האחד המתואר לעיל, מאפשר זיהוי ישיר. זה מספק הוכחה ישירה של המרה מוצלחת ומאפשר זיהוי תא חי הנדרש עבור מהדק-מלחציים הפיזיולוגיה.
ב vivo ישיר מתיכנות ניתן להשיג באמצעות וקטורים FLEX AAV ביצור-המבטא זנים של העכבר. חשוב לציין כי הבדלים בין זני העכבר לגבי יעילות תכנות משנה נצפו. עבור ב vivo מתיכנות משני בסטריאטום, קו העכבר NG2-יצורים הוכיחה להיות יעיל יותר בהשוואה זנים אחרים. לפני שמתחילים להשתמש זן חדש של בעלי חיים, חשוב לבדוק את הקווים המנחים של ספק העכבר לגבי ביטוי היצור לאורך זמן, כמו גיל של בעלי חיים לעיתים קרובות משפיע על הספציפיות של הביטוי הזה חלבון. במחקרים שלנו, בעלי חיים שגילם עולה על 12 שבועות לא שימשו בvivo תכנות כפי שהיה סיכון לביטוי היצור בתאים שאינם NG2 glia. הנוכחות הקבועה וניטור של בעלי חיים בקרה מוזרק רק עם סינפסין-FLEX-GFP המבנה מומלץ. זה מאפשר ניטור של בעלי החיים עבור תאים GFP-חיוביים כי לא צריך להיות נוכח אם אין גנים מתיכנות מראש (מאשר) משמשים.
כדי לזהות את הנוירונים החדשים שעוצבו מחדש, שיטת זיהוי ספציפית לנוירונים, כמו זו המתוארת בפרוטוקול זה, היא בעלת חשיבות עליונה. זה מאפשר זיהוי והבחנה נכונה של הנוירונים מתוכנת התכנות מתוך התאים האנדוגניים המקיפים כי הוא מאוד רלוונטיות כאשר תכנות מחודש באזור הומונושא.
חשוב גם למקד את המבנה הנכון עבור הזרקה ויראלי. לכן, הניתוח הסטרטקאני להזרקה ויראלי חשוב וצריך להתקרב אליו בדיוק, במיוחד כאשר מסמנים את המבנים הקטנים יותר של המוח.
בעבר הצגנו11 כי זה לא אמין כדי לחזות את התוצאה של vivo תכנות מבוסס על ניסויים באמצעות התכנות מחוץ גופית באמצעות אותם גורמים תכנות משנה. לכן יש לבחון את כל גורמי העניין בvivo. בידינו, שילובים רבים גורמים שונים לתת את אותו סוג של נוירונים (כלומר, interneurons11 ב vivo) למרות העובדה כי גנים אלה היו מעורבים בפיתוח של נוירונים אחרים.
כל תא מהדק תיקון עבור נוירונים מתוכנת מתכנתו היא טכניקה עדינה עיבוד רקמות חשוב לתוצאה טובה. Perfusion עם פתרון קרבס קר משפר את איכות הרקמה. גם, נוירונים שתוקנה צריך להיות מטופלים בזהירות. גם אם התבגרות וזהות פנוטימית של נוירונים מתוכנת שניתן להעריך במידת מה באמצעות מהדק טלאי תא שלם, תאים אלה אינם מקבילים באופן מלא לעמיתיהם האנדוגניים שלהם. סוגים נוספים של ניתוח, כגון רצף הגנום (למשל, רצפי RNA) יש להשתמש כדי לאשר עוד זהות תא מתוכנת.
הטכניקה המתוארת במסמך זה יכולה להיחשב לפיתוח טיפולים עתידיים שבהם נדרש תחליף עצבי במוח. למרות שvivo תכנות עדיין בשלבים המוקדמים שלה ואת התרגום לבני אדם עדיין לא מראש, טכניקה זו יכולה לספק שיטה כדי להעריך את התפקוד הגנטי האקסוגני במוח וללמוד תא התבגרות בvivo.
The authors have nothing to disclose.
מרקלה בירטלה ממומנת על ידי האיחוד האירופי אופק 2020 תוכנית (H2020-MSCA-ITN-2015) תחת מארי Skłodowska-קירי רשתות הדרכה חדשנית וגרנט הסכם מס ‘ 676408. דניאלה רילנדר אוטקסון ממומנת על ידי מועצת המחקר השבדית (2017-01234).
REAGENTS FOR AAV5 CLONING AND VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
pAAV-CA-FLEX | AddGene | 38042 | |
Ascl1 | AddGene | 67291 | NM_008553.4 |
Lmx1a | AddGene | 33013 | NM_0033652.5 |
Nurr1 | AddGene | 35000 | NM_013613.2 |
GFP-syn | AddGene | 30456 | |
LoxP (FLEX) sequence 1 | GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga agaggctctaga |
||
LoxP (FLEX) sequences 2 | tactagtataacttcgtataggatactttatac gaagttatcattgggattcttcctattttgatc caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct caccatcgacccataacttcgtatagcatacat tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC |
||
pDP5 | Plasmid Factory | PF435 | |
pDP6 | Plasmid Factory | PF436 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
FBS (Fetal bovine serum) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)+ Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61965026 | |
DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffer Saline) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
HEK293 cells | Thermo Fisher Scientific | 85120602-1VL | |
Flasks | BD Falcon | 10078780 | 175 cm2 |
Tris H-CL | Sigma Aldrich | 10812846001 |
For TE buffer use 10 mM, pH 8.0; for lysis buffer use 50mM, pH 8.5; for IE buffer use 20 mM, pH 8.0; for elution buffer use 20 mM, pH 8.0
|
EDTA | EDTA: Invitrogen | EDTA: AM9260G |
For TE buffer use 1 mM EDTA
|
Ultrapure water |
see Ultrapure water system
|
||
CaCl2 | SigmaAldrich | C5080 | 2.5 M |
Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 |
FOR HBS use 140 mM; for Lysis Buffer use 150 mM; for IE buffer use 15 mM; for elution buffer use 250 mM
|
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G |
For lysis Buffer: 1 mM
|
Ultracentrifuge sealing tubes | Beckman Coulter | Quick-Seal® Polypropylene Tube | |
OptiPrep™ Density Gradient Medium | Sigma Aldrich | D1556-250ML | |
10-mL syringe-18G needle | BD | 305064 | |
Laboratory glass bottles | VWR | ? | |
Anion exchange filter | PALL laboratory | MSTG25Q6 |
Acrodisc unit with Mustang Q membrane
|
Centrifugal filter unit | Merck | Z740210-24EA |
Amicon Ultra-4 device
|
Endotoxin-Free Plasmid DNA Isolation Kits | Thermo Fisher Scientific | A33073 | |
Na2PO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | 15 mL |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352196 | |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352070 | |
Glass Vials | Novatech | 30209-1232 |
CGGCCTCAGFGAGCGA
|
Forward Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
GGAACCCCTAGTGATGGAGTT
|
||
Reverse Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG
|
||
5´FAM / 3´BHQ1 probe | Jena Bioscience | ||
0.22 mm filter | Merck | SLGV004SL | Millex-GV filter |
EQUIPMENT AAV5 VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
Freezer -20 °C | |||
Freezer -80 °C | |||
Fridge +4 °C | |||
AAV viral room | |||
Ultrapure Water system | Merck | Milli-Q® IQ 7000 | |
Vortex mixer | VWR | 444-0004 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | |
Autoclave | Tuttnauer | 2540 EL | |
Polymerase Chain Reaction (PCR) | BioRad | C1000 Touch Thermal Cycler | |
Quantitative PCR (qPCR) | Roche | LightCycler® 480 System | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST16 | |
Water Bath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
ANIMAL MODEL | |||
NG2-Cre mice | Jackson | NG2-CrexB6129, Stock #008533 | |
REAGENTS FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN | |||
Water | |||
Saline | Apoteket AB | 70% | |
Ethanol | Solveco | ||
Isolfurane | Apoteket AB |
Dilute to 1% solution with warm water.
|
|
Virkon | Viroderm | 7511 | |
Pentobarbital | Apoteket AB | P0500000 |
i.p. for terminal procedure at the dose of 60 mg/ml.
|
Sucrose | Merck | S0389-500G | |
Trypan Blu | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Retrobeads | Lumafluor | R170 | |
Buprenorphine | Apoteket AB | ||
EQUIPMENT FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN |
From RSG Solingen.
|
||
Scissors | VWR | 233-1552 | From Biochem. |
Tweezers | VWR | 232-0007 | |
Forcep | VWR | 232-0120 | |
Scalpel holder | VWR | RSGA106.621 | Number 20. |
Scalpel | VWR | RSGA106.200 | |
Stereotaxic frame | Stoelting Europe | 51500D | |
Mouse ear bars | Stoelting Europe | 51648 | 5 ul |
Syringe with Removable needle | Hamilton Company | 65 |
0,75 inner diameter and 1.5 outer diameter.
|
Glass capilaries | Stoelting | 50811 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Dental drill | Agnthos AB | 1464 | |
Shaver | Agnthos AB | GT420 | |
Isoflurane Chamber and pump | Agnthos AB | 8323101 | 2 mL |
Syringes | Merck | Z118400-30EA | 25G |
Needles | Merck | Z192414 Aldrich | |
Mouse and neonatal rat adaptor for stereotaxic fram | Stoelting | 51625 | |
Heating pad | Braintree scientific, inc | 53800M |
From Covidien 2187.
|
Cotton gauze | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
Rubber tube | Elfa Distrelec | HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150 | |
Cotton swabs | Fisher Scientific | 18-366-473 | |
REAGENTS FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
NaH2PO4-H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
MgCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
CaCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | C8106 | |
MgSO4-7 H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 |
see Ultrapure Water system
|
Ultrapure Water | Prepare 1 or 2M. | ||
KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
K-D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 Sigma | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KOH-EGTA (Etilene glycol-bis-N-tetracetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 Sigma | |
KOH- Hepes acid (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Mg2ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
Na3GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
Picrotoxin | Merck | P1675 Sigma | |
CNQX | Merck | C239 Sigma | |
Ice | |||
EQUIPMENT FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
Borosilicate glass pipette | Sutter Company | B150-86-10 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Vibratome | Leica | Leica VT1000 S | |
WaterBath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
Clampfit software | Molecular Devices | ||
Multiclamp software | Molecular Devices | ||
REAGENTS FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY |
Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin.
|
||
Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 |
Use at a concentration of 0.1%.
|
Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 |
Donkey.Use at a concentration of 1 : 400.
|
Serum | Merck Millipore | S30-100ML |
Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500.
|
4′,6-Diamidino-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 |
1: 600 in KPBS-T.
|
streptavidin- Cy3 | Thermo Fisher Scientific | 434315 | 1:5000, rabbit. |
Anti-GAD65/67 | Abcam | 1:2000, mouse. | |
Anti-PV | Sigma | P3088 | 1:200, goat. |
Anti-Chat | Merk | AB143 | 1:5000, rabbit. |
Anti-NPY | Immunostar | 22940 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | 1:1000, chicken. |
Anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
Mounting solution | Merck | 10981 |
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading
|
OCT | Agar Scientific | ||
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
Distilled water | |||
Anti-freeze solution | Tissue Pro Technology | AFS05-1000N, 1000 mL/ea. | |
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Confocal microscope | Leica | TCS SP8 laser scanning confocal microscope. | |
Prism | GraphPad | ||
Microtome | Leica | SM2010R |