Dit protocol is gericht op het genereren van direct geherprogrammeerde interneuronen in vivo, met behulp van een AAV-gebaseerd virale systeem in de hersenen en een FLEX synapsin-driven GFP Reporter, die het mogelijk maakt voor celidentificatie en verdere analyse in vivo.
Het omzetten van Resident glia in de hersenen in functionele en subtype-specifieke neuronen in vivo biedt een stap voorwaarts in de richting van de ontwikkeling van alternatieve celvervangende therapieën terwijl het ook instrumenten creëert om het lot van cellen in situ te bestuderen. Tot op heden, het is mogelijk om te verkrijgen van neuronen via in vivo herprogrammering, maar de precieze fenotype van deze neuronen of hoe ze volwassen is niet in detail geanalyseerd. In dit protocol beschrijven we een efficiëntere conversie en celspecifieke identificatie van de in vivo herprogrammeerde neuronen, met behulp van een AAV-gebaseerd virale vector systeem. We bieden ook een protocol voor de functionele beoordeling van de neuronale rijping van de geherprogrammeerde cellen. Door het injecteren van Flip-excisie (FLEX) vectoren, met de herprogrammering en synapsin-driven reporter genen naar specifieke celtypen in de hersenen die dienen als het doelwit voor het herprogrammeren van de cel. Deze techniek maakt de eenvoudige identificatie van nieuw geherprogrammeerde neuronen mogelijk. Resultaten tonen aan dat de verkregen geherprogrammeerde neuronen functioneel volwassen na verloop van tijd, ontvangen synaptische contacten en Toon elektrofysiologische eigenschappen van verschillende soorten interneuronen. Met behulp van de transcriptiefactoren Ascl1, Lmx1a en Nurr1 hebben de meeste herprogrammeerde cellen eigenschappen van snel spiking, parvalbumine-bevattende interneuronen.
Het algemene doel van deze methode is om hersenen Resident glia in vivo efficiënt om te zetten in functionele en subtype-specifieke neuronen zoals parvalbumine-uitdrukken van interneuronen. Dit biedt een stap voorwaarts in de richting van de ontwikkeling van een alternatieve cel vervangende therapie voor hersenziekten zonder de noodzaak voor een exogene celbron. Het creëert ook een hulpmiddel om cel Fate switches in situ te bestuderen.
De hersenen heeft slechts een beperkte capaciteit voor het genereren van nieuwe neuronen. Daarom is er in neurologische ziekten een behoefte aan exogene celbronnen voor hersen herstel. Voor deze, verschillende bronnen van cellen zijn onderworpen aan intens onderzoek door de jaren heen, met inbegrip van cellen van primair weefsel, stamcel-afgeleide cellen en geherprogrammeerde cellen1,2,3. Directe herprogrammering van de ingezeten hersencellen in neuronen is een recente aanpak die een aantrekkelijke methode voor hersen herstel zou kunnen bieden omdat het de eigen cellen van de patiënt gebruikt voor het genereren van nieuwe neuronen in de hersenen. Tot op heden hebben verschillende rapporten in vivo herprogrammering aangetoond via virale vector levering in de hersenen4,5,6,78,9 in verschillende hersengebieden, zoals de cortex, het ruggenmerg, het striatum en de veroorzaakt5,10,11, evenals in intact en lesioned hersenen5,8,11,12. Zowel remmende als excitatory neuronen zijn verkregen4,8, maar de precieze fenotype of functionaliteit van deze cellen is nog niet in detail geanalyseerd.
In dit protocol beschrijven we een efficiëntere herprogrammering en celspecifieke identificatie van in vivo herprogrammeerde neuronen. Wij bieden een protocol voor de functionele beoordeling van de neuronale rijping en fenotype karakterisatie op basis van functionaliteit en immunohistochemische eigenschappen.
We gebruikten een CRE-inducible AAV vector en een GFP reporter om de in vivo geherprogrammeerde neuronen te identificeren. Deze keuze van virale vectoren heeft het voordeel van het infecteren van zowel scheidings-als niet-scheidings cellen van de hersenen, waardoor het aantal beoogde cellen toeneemt, als alternatief voor het gebruik van retrovirus7,8. Een neuron-specifieke synapsin-gedreven FLEX Reporter (GFP), stelde ons in staat om de nieuw gegenereerde neuronen specifiek te detecteren. Eerdere studies hebben subtype-specifieke promoters gebruikt voor in vivo herprogrammering7,9, die ook de uitdrukking van herprogrammering van genen en verslaggevers in specifieke celtypen mogelijk maken. Deze methode vereist echter verdere identificatie van geherprogrammeerde neuronen door middel van een postmortemanalyse van de co-expressie van reporter en neuronale markers. Het gebruik van een neuron-specifieke Reporter, zoals beschreven in dit document, maakt een directe identificatie mogelijk. Dit biedt een direct bewijs van een succesvolle conversie en maakt een live-celidentificatie mogelijk die nodig is voor Patch-clamp elektrofysiologie.
In vivo kan direct herprogrammering worden gerealiseerd met behulp van AAV FLEX vectoren in CRE-uitdrukken muis stammen. Het is belangrijk op te merken dat verschillen tussen de muis stammen met betrekking tot herprogrammering werkzaamheid zijn waargenomen. Voor in vivo herprogrammering in het striatum is de NG2-CRE-muis lijn het meest efficiënt gebleken in vergelijking met andere stammen. Voordat u begint met het gebruik van een nieuwe diersoort, is het belangrijk om de richtlijnen van de muis provider met betrekking tot CRE-expressie na verloop van tijd te controleren, omdat de leeftijd van dieren vaak de specificiteit van deze eiwit expressie beïnvloedt. In onze studies werden dieren ouder dan 12 weken niet gebruikt voor in vivo herprogrammering omdat er een risico bestond voor CRE-expressie in andere cellen dan NG2 glia. De constante aanwezigheid en bewaking van controledieren die alleen met Synapsin-FLEX-GFP-constructie worden geïnjecteerd, wordt geadviseerd. Dit maakt het mogelijk om de dieren te monitoren op GFP-positieve cellen die niet aanwezig mogen zijn als er geen herprogrammering genen (ALN) worden gebruikt.
Om de nieuw geherprogrammeerde neuronen te identificeren, is een neuron-specifieke identificatiemethode zoals beschreven in dit Protocol van het allergrootste belang. Dit zorgt voor een juiste identificatie en onderscheid van de geherprogrammeerde neuronen van de endogene omringende cellen die van bijzonder belang is bij het herprogrammeren in een homotopische regio.
Het is ook belangrijk om te richten op de juiste structuur voor virale injectie. Daarom is de stereotaxic chirurgie voor virale injectie belangrijk en moet worden benaderd met nauwkeurigheid, vooral bij het richten van kleinere structuren van de hersenen.
We hebben al eerder11 laten zien dat het niet betrouwbaar is om de uitkomst van in vivo herprogrammering te voorspellen op basis van in vitro herprogrammatie experimenten met dezelfde herprogrammeeringfactoren. Alle factoren die van belang zijn, moeten daarom in vivo worden getest. In onze handen geven veel verschillende factor combinaties hetzelfde subtype van neuronen (d.w.z. interneuronen11 in vivo), ondanks het feit dat deze genen betrokken zijn bij de ontwikkeling van andere neuronen.
Hele cel patch klem voor geherprogrammeerde neuronen is een delicate techniek en weefsel verwerking is belangrijk voor een goed resultaat. Perfusie met ijskoude Krebs-oplossing verbetert de weefsel kwaliteit. Ook, gepatched neuronen moeten zorgvuldig worden behandeld. Zelfs als rijping en fenotypische identiteit van geherprogrammeerde neuronen enigszins kan worden beoordeeld met behulp van Whole-Cell Patch clamp, zijn deze cellen niet volledig vergelijkbaar met hun endogene tegenhangers. Aanvullende soorten analyses, zoals genoom volgordebepaling (bijv. RNA-sequencing), moeten worden gebruikt om de geherprogrammeerde celidentiteit verder te bevestigen.
De hierin beschreven techniek kan worden overwogen voor de ontwikkeling van toekomstige therapieën waarbij neuronale vervanging nodig is in de hersenen. Hoewel in vivo herprogrammering nog in het beginstadium is en de vertaling in de mens nog niet is voorzien, kan deze techniek een methode bieden om de exogene genfunctie in de hersenen te beoordelen en celrijping in vivo te bestuderen.
The authors have nothing to disclose.
Marcella Birtele werd gefinancierd door het EU Horizon 2020 programma (H2020-MSCA-ITN-2015) onder de Marie Skłodowska-Curie innovatieve opleidingsnetwerken en subsidieovereenkomst nr. 676408. Daniella Rylander Ottosson is gefinancierd door de Zweedse Onderzoeksraad (2017-01234).
REAGENTS FOR AAV5 CLONING AND VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
pAAV-CA-FLEX | AddGene | 38042 | |
Ascl1 | AddGene | 67291 | NM_008553.4 |
Lmx1a | AddGene | 33013 | NM_0033652.5 |
Nurr1 | AddGene | 35000 | NM_013613.2 |
GFP-syn | AddGene | 30456 | |
LoxP (FLEX) sequence 1 | GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga agaggctctaga |
||
LoxP (FLEX) sequences 2 | tactagtataacttcgtataggatactttatac gaagttatcattgggattcttcctattttgatc caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct caccatcgacccataacttcgtatagcatacat tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC |
||
pDP5 | Plasmid Factory | PF435 | |
pDP6 | Plasmid Factory | PF436 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
FBS (Fetal bovine serum) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)+ Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61965026 | |
DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffer Saline) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
HEK293 cells | Thermo Fisher Scientific | 85120602-1VL | |
Flasks | BD Falcon | 10078780 | 175 cm2 |
Tris H-CL | Sigma Aldrich | 10812846001 |
For TE buffer use 10 mM, pH 8.0; for lysis buffer use 50mM, pH 8.5; for IE buffer use 20 mM, pH 8.0; for elution buffer use 20 mM, pH 8.0
|
EDTA | EDTA: Invitrogen | EDTA: AM9260G |
For TE buffer use 1 mM EDTA
|
Ultrapure water |
see Ultrapure water system
|
||
CaCl2 | SigmaAldrich | C5080 | 2.5 M |
Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 |
FOR HBS use 140 mM; for Lysis Buffer use 150 mM; for IE buffer use 15 mM; for elution buffer use 250 mM
|
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G |
For lysis Buffer: 1 mM
|
Ultracentrifuge sealing tubes | Beckman Coulter | Quick-Seal® Polypropylene Tube | |
OptiPrep™ Density Gradient Medium | Sigma Aldrich | D1556-250ML | |
10-mL syringe-18G needle | BD | 305064 | |
Laboratory glass bottles | VWR | ? | |
Anion exchange filter | PALL laboratory | MSTG25Q6 |
Acrodisc unit with Mustang Q membrane
|
Centrifugal filter unit | Merck | Z740210-24EA |
Amicon Ultra-4 device
|
Endotoxin-Free Plasmid DNA Isolation Kits | Thermo Fisher Scientific | A33073 | |
Na2PO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | 15 mL |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352196 | |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352070 | |
Glass Vials | Novatech | 30209-1232 |
CGGCCTCAGFGAGCGA
|
Forward Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
GGAACCCCTAGTGATGGAGTT
|
||
Reverse Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG
|
||
5´FAM / 3´BHQ1 probe | Jena Bioscience | ||
0.22 mm filter | Merck | SLGV004SL | Millex-GV filter |
EQUIPMENT AAV5 VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
Freezer -20 °C | |||
Freezer -80 °C | |||
Fridge +4 °C | |||
AAV viral room | |||
Ultrapure Water system | Merck | Milli-Q® IQ 7000 | |
Vortex mixer | VWR | 444-0004 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | |
Autoclave | Tuttnauer | 2540 EL | |
Polymerase Chain Reaction (PCR) | BioRad | C1000 Touch Thermal Cycler | |
Quantitative PCR (qPCR) | Roche | LightCycler® 480 System | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST16 | |
Water Bath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
ANIMAL MODEL | |||
NG2-Cre mice | Jackson | NG2-CrexB6129, Stock #008533 | |
REAGENTS FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN | |||
Water | |||
Saline | Apoteket AB | 70% | |
Ethanol | Solveco | ||
Isolfurane | Apoteket AB |
Dilute to 1% solution with warm water.
|
|
Virkon | Viroderm | 7511 | |
Pentobarbital | Apoteket AB | P0500000 |
i.p. for terminal procedure at the dose of 60 mg/ml.
|
Sucrose | Merck | S0389-500G | |
Trypan Blu | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Retrobeads | Lumafluor | R170 | |
Buprenorphine | Apoteket AB | ||
EQUIPMENT FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN |
From RSG Solingen.
|
||
Scissors | VWR | 233-1552 | From Biochem. |
Tweezers | VWR | 232-0007 | |
Forcep | VWR | 232-0120 | |
Scalpel holder | VWR | RSGA106.621 | Number 20. |
Scalpel | VWR | RSGA106.200 | |
Stereotaxic frame | Stoelting Europe | 51500D | |
Mouse ear bars | Stoelting Europe | 51648 | 5 ul |
Syringe with Removable needle | Hamilton Company | 65 |
0,75 inner diameter and 1.5 outer diameter.
|
Glass capilaries | Stoelting | 50811 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Dental drill | Agnthos AB | 1464 | |
Shaver | Agnthos AB | GT420 | |
Isoflurane Chamber and pump | Agnthos AB | 8323101 | 2 mL |
Syringes | Merck | Z118400-30EA | 25G |
Needles | Merck | Z192414 Aldrich | |
Mouse and neonatal rat adaptor for stereotaxic fram | Stoelting | 51625 | |
Heating pad | Braintree scientific, inc | 53800M |
From Covidien 2187.
|
Cotton gauze | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
Rubber tube | Elfa Distrelec | HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150 | |
Cotton swabs | Fisher Scientific | 18-366-473 | |
REAGENTS FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
NaH2PO4-H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
MgCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
CaCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | C8106 | |
MgSO4-7 H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 |
see Ultrapure Water system
|
Ultrapure Water | Prepare 1 or 2M. | ||
KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
K-D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 Sigma | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KOH-EGTA (Etilene glycol-bis-N-tetracetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 Sigma | |
KOH- Hepes acid (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Mg2ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
Na3GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
Picrotoxin | Merck | P1675 Sigma | |
CNQX | Merck | C239 Sigma | |
Ice | |||
EQUIPMENT FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
Borosilicate glass pipette | Sutter Company | B150-86-10 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Vibratome | Leica | Leica VT1000 S | |
WaterBath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
Clampfit software | Molecular Devices | ||
Multiclamp software | Molecular Devices | ||
REAGENTS FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY |
Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin.
|
||
Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 |
Use at a concentration of 0.1%.
|
Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 |
Donkey.Use at a concentration of 1 : 400.
|
Serum | Merck Millipore | S30-100ML |
Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500.
|
4′,6-Diamidino-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 |
1: 600 in KPBS-T.
|
streptavidin- Cy3 | Thermo Fisher Scientific | 434315 | 1:5000, rabbit. |
Anti-GAD65/67 | Abcam | 1:2000, mouse. | |
Anti-PV | Sigma | P3088 | 1:200, goat. |
Anti-Chat | Merk | AB143 | 1:5000, rabbit. |
Anti-NPY | Immunostar | 22940 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | 1:1000, chicken. |
Anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
Mounting solution | Merck | 10981 |
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading
|
OCT | Agar Scientific | ||
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
Distilled water | |||
Anti-freeze solution | Tissue Pro Technology | AFS05-1000N, 1000 mL/ea. | |
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Confocal microscope | Leica | TCS SP8 laser scanning confocal microscope. | |
Prism | GraphPad | ||
Microtome | Leica | SM2010R |