Denne protokol har til formål at generere direkte omprogrammeret interneuroner in vivo, ved hjælp af et AAV-baseret viral system i hjernen og en FLEX synapsin-drevet GFP reporter, som giver mulighed for celle identifikation og yderligere analyse in vivo.
Konvertering Resident glia i hjernen til funktionelle og subtype-specifikke neuroner in vivo giver et skridt fremad mod udviklingen af alternative celle udskiftning terapier samtidig skabe værktøjer til at studere celle skæbne in situ. Til dato har det været muligt at opnå neuroner via in vivo omprogrammering, men den præcise fænotype af disse neuroner eller hvordan de modne er ikke blevet analyseret i detaljer. I denne protokol beskriver vi en mere effektiv konvertering og celle specifik identifikation af in vivo-omprogrammerede neuroner ved hjælp af et AAV-baseret viral vektorsystem. Vi tilbyder også en protokol til funktionel vurdering af de omprogrammerede cellernes neuronal modning. Ved at injicere flip-excision (FLEX) vektorer, der indeholder omprogrammering og synapsin-driven reporter gener til specifikke celletyper i hjernen, der tjener som mål for celle omprogrammering. Denne teknik giver mulighed for nem identifikation af nyligt omprogrammerede neuroner. Resultaterne viser, at de opnåede reprogrammerede neuroner funktionelt modne over tid, modtage synaptiske kontakter og vise elektrofysiologiske egenskaber af forskellige typer af interneuroner. Ved hjælp af transkriptionsfaktorerne Ascl1, Lmx1a og Nurr1, de fleste af de omprogrammerede celler har egenskaber af hurtigtspiking, parvalbumin-holdige interneuroner.
Det overordnede mål med denne metode er effektivt at omdanne hjernen Resident glia in vivo til funktionelle og subtype-specifikke neuroner såsom parvalbumin-udtrykker interneuroner. Dette giver et skridt fremad mod udviklingen af en alternativ celle substitutionsterapi for hjernesygdomme uden behov for en eksogene celle kilde. Det skaber også et værktøj til at studere celle skæbne afbrydere in situ.
Hjernen har kun en begrænset kapacitet til at generere nye neuroner. Derfor, i neurologiske sygdomme, der er behov for eksogene celle kilder til hjernen reparation. Til dette har forskellige kilder til celler været udsat for intens forskning gennem årene, herunder celler fra primær væv, stamcelle-afledte celler og omprogrammerede celler1,2,3. Direkte omprogrammering af residente hjerneceller til neuroner er en nylig tilgang, der kunne give en attraktiv metode til hjerne reparation, da det bruger patientens egne celler til at generere nye neuroner inde i hjernen. Til dato, flere rapporter har vist in vivo omprogrammering gennem viral vektor levering i hjernen4,5,6,78,9 i forskellige hjerneområder såsom cortex, rygmarv, striatum og hjernen5,10,11, samt i intakt og læsioneret hjerne5,8,11,12. Både hæmmende og excitatoriske neuroner er opnået4,8, men den præcise fænotype eller funktionalitet af disse celler er endnu ikke blevet analyseret i detaljer.
I denne protokol beskriver vi en mere effektiv omprogrammering og celle specifik identifikation af in vivo-omprogrammerede neuroner. Vi leverer en protokol til funktionel vurdering af neuronal modning og fænotype karakterisering baseret på funktionalitet og immun histokemiske egenskaber.
Vi brugte en CRE-inducerbar AAV vektor og en GFP Reporter til at identificere in vivo reprogrammerede neuroner. Dette valg af virale vektorer har den fordel, at inficere både dividere og ikke-dividere celler i hjernen, øge antallet af målrettede celler, som et alternativ til brugen af retrovirus7,8. En neuron-specifik synapsin-driven FLEX reporter (GFP), gjorde det muligt for os specifikt at registrere de nyligt genererede neuroner. Tidligere undersøgelser har brugt subtype-specifikke initiativtagere til in vivo omprogrammering7,9, der også giver mulighed for ekspressions genprogrammering gener og journalister i specifikke celletyper. Denne metode kræver imidlertid yderligere identifikation af omprogrammerede neuroner ved post mortem analyse af co-ekspression af reporter og neuronal markører. Brugen af en neuron-specifik reporter, som den, der er beskrevet heri, giver mulighed for en direkte identifikation. Dette giver et direkte bevis på en vellykket konvertering og tillader en levende celle identifikation, der er nødvendig for patch-clamp Elektrofysiologi.
In vivo direkte omprogrammering kan opnås ved hjælp af AAV FLEX vektorer i CRE-udtrykke muse stammer. Det er vigtigt at bemærke, at forskelle mellem muse stammer med hensyn til omprogrammering effekt er blevet observeret. For in vivo omprogrammering i striatum har NG2-CRE-muse linjen vist sig at være mere effektiv sammenlignet med andre stammer. Før du begynder at bruge en ny dyrestamme, er det vigtigt at kontrollere musen udbyder retningslinjer vedrørende CRE udtryk over tid, da dyrenes alder ofte påvirker specificiteten af dette protein udtryk. I vores studier blev dyr over 12 uger ikke anvendt til in vivo-omprogrammering, da der var en risiko for CRE-ekspression i andre celler end NG2 glia. Den konstante tilstedeværelse og overvågning af kontroldyr injiceres kun med Synapsin-FLEX-GFP konstruktion tilrådes. Dette gør det muligt at overvåge dyrene for GFP-positive celler, der ikke bør være til stede, hvis der ikke anvendes genprogrammerings gener (ALN).
For at identificere de nyligt omprogrammerede neuroner er en neuron-specifik identifikationsmetode som den, der er beskrevet i denne protokol, af allerstørste vigtighed. Dette giver mulighed for en korrekt identifikation og skelnen af de omprogrammerede neuroner fra de endogene omgivende celler, der er af særlig relevans, når omprogrammering i en homotopic region.
Det er også vigtigt at målrette den korrekte struktur for viral injektion. Derfor er den stereotaxiske kirurgi for viral injektion vigtig og skal gribes an med nøjagtighed, især når de er rettet mod mindre strukturer i hjernen.
Vi har tidligere vist11 , at det ikke er pålideligt at forudsige resultatet af in vivo omprogrammering baseret på in vitro omprogrammering eksperimenter ved hjælp af de samme omprogrammering faktorer. Alle interesse faktorer skal derfor testes in vivo. I vores hænder giver mange forskellige faktor kombinationer den samme subtype af neuroner (dvs. interneuroner11 in vivo) på trods af, at disse gener har været impliceret i udviklingen af andre neuroner.
Helcelle patch klemme til omprogrammerede neuroner er en delikat teknik og vævs behandling er vigtig for et godt resultat. Perfusion med Ice-Cold Krebs løsning forbedrer vævs kvaliteten. Også, lappet neuroner skal behandles omhyggeligt. Selv om modning og fænotypisk identitet af omprogrammerede neuroner kan vurderes noget ved hjælp af hele cellen patch clamp, disse celler er ikke fuldt ud sammenlignelige med deres endogene modparter. Yderligere analysetyper, såsom genom-sekvensering (f. eks. RNA-sekvensering), bør anvendes til yderligere at bekræfte omprogrammeret celle identitet.
Den teknik, der er beskrevet heri, kan overvejes til udvikling af fremtidige terapier, hvor neuronal udskiftning er nødvendig i hjernen. Selv om in vivo omprogrammering er stadig på sit tidlige stadier, og oversættelsen til mennesker er endnu ikke forudset, denne teknik kan give en metode til at vurdere eksogene gen funktion i hjernen og studere celle modning in vivo.
The authors have nothing to disclose.
Marcella Birtele er blevet finansieret af den Europæiske Unions Horisont 2020 program (Horisont 2020-MSCA-ITN-2015) under Marie Skłodowska-Curie innovative uddannelsesnet og tilskudsaftale nr. 676408. Daniella Rylander Ottosson er blevet finansieret af det svenske Forskningsråd (2017-01234).
REAGENTS FOR AAV5 CLONING AND VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
pAAV-CA-FLEX | AddGene | 38042 | |
Ascl1 | AddGene | 67291 | NM_008553.4 |
Lmx1a | AddGene | 33013 | NM_0033652.5 |
Nurr1 | AddGene | 35000 | NM_013613.2 |
GFP-syn | AddGene | 30456 | |
LoxP (FLEX) sequence 1 | GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga agaggctctaga |
||
LoxP (FLEX) sequences 2 | tactagtataacttcgtataggatactttatac gaagttatcattgggattcttcctattttgatc caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct caccatcgacccataacttcgtatagcatacat tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC |
||
pDP5 | Plasmid Factory | PF435 | |
pDP6 | Plasmid Factory | PF436 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
FBS (Fetal bovine serum) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)+ Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61965026 | |
DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffer Saline) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
HEK293 cells | Thermo Fisher Scientific | 85120602-1VL | |
Flasks | BD Falcon | 10078780 | 175 cm2 |
Tris H-CL | Sigma Aldrich | 10812846001 |
For TE buffer use 10 mM, pH 8.0; for lysis buffer use 50mM, pH 8.5; for IE buffer use 20 mM, pH 8.0; for elution buffer use 20 mM, pH 8.0
|
EDTA | EDTA: Invitrogen | EDTA: AM9260G |
For TE buffer use 1 mM EDTA
|
Ultrapure water |
see Ultrapure water system
|
||
CaCl2 | SigmaAldrich | C5080 | 2.5 M |
Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 |
FOR HBS use 140 mM; for Lysis Buffer use 150 mM; for IE buffer use 15 mM; for elution buffer use 250 mM
|
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G |
For lysis Buffer: 1 mM
|
Ultracentrifuge sealing tubes | Beckman Coulter | Quick-Seal® Polypropylene Tube | |
OptiPrep™ Density Gradient Medium | Sigma Aldrich | D1556-250ML | |
10-mL syringe-18G needle | BD | 305064 | |
Laboratory glass bottles | VWR | ? | |
Anion exchange filter | PALL laboratory | MSTG25Q6 |
Acrodisc unit with Mustang Q membrane
|
Centrifugal filter unit | Merck | Z740210-24EA |
Amicon Ultra-4 device
|
Endotoxin-Free Plasmid DNA Isolation Kits | Thermo Fisher Scientific | A33073 | |
Na2PO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | 15 mL |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352196 | |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352070 | |
Glass Vials | Novatech | 30209-1232 |
CGGCCTCAGFGAGCGA
|
Forward Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
GGAACCCCTAGTGATGGAGTT
|
||
Reverse Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG
|
||
5´FAM / 3´BHQ1 probe | Jena Bioscience | ||
0.22 mm filter | Merck | SLGV004SL | Millex-GV filter |
EQUIPMENT AAV5 VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
Freezer -20 °C | |||
Freezer -80 °C | |||
Fridge +4 °C | |||
AAV viral room | |||
Ultrapure Water system | Merck | Milli-Q® IQ 7000 | |
Vortex mixer | VWR | 444-0004 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | |
Autoclave | Tuttnauer | 2540 EL | |
Polymerase Chain Reaction (PCR) | BioRad | C1000 Touch Thermal Cycler | |
Quantitative PCR (qPCR) | Roche | LightCycler® 480 System | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST16 | |
Water Bath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
ANIMAL MODEL | |||
NG2-Cre mice | Jackson | NG2-CrexB6129, Stock #008533 | |
REAGENTS FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN | |||
Water | |||
Saline | Apoteket AB | 70% | |
Ethanol | Solveco | ||
Isolfurane | Apoteket AB |
Dilute to 1% solution with warm water.
|
|
Virkon | Viroderm | 7511 | |
Pentobarbital | Apoteket AB | P0500000 |
i.p. for terminal procedure at the dose of 60 mg/ml.
|
Sucrose | Merck | S0389-500G | |
Trypan Blu | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Retrobeads | Lumafluor | R170 | |
Buprenorphine | Apoteket AB | ||
EQUIPMENT FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN |
From RSG Solingen.
|
||
Scissors | VWR | 233-1552 | From Biochem. |
Tweezers | VWR | 232-0007 | |
Forcep | VWR | 232-0120 | |
Scalpel holder | VWR | RSGA106.621 | Number 20. |
Scalpel | VWR | RSGA106.200 | |
Stereotaxic frame | Stoelting Europe | 51500D | |
Mouse ear bars | Stoelting Europe | 51648 | 5 ul |
Syringe with Removable needle | Hamilton Company | 65 |
0,75 inner diameter and 1.5 outer diameter.
|
Glass capilaries | Stoelting | 50811 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Dental drill | Agnthos AB | 1464 | |
Shaver | Agnthos AB | GT420 | |
Isoflurane Chamber and pump | Agnthos AB | 8323101 | 2 mL |
Syringes | Merck | Z118400-30EA | 25G |
Needles | Merck | Z192414 Aldrich | |
Mouse and neonatal rat adaptor for stereotaxic fram | Stoelting | 51625 | |
Heating pad | Braintree scientific, inc | 53800M |
From Covidien 2187.
|
Cotton gauze | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
Rubber tube | Elfa Distrelec | HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150 | |
Cotton swabs | Fisher Scientific | 18-366-473 | |
REAGENTS FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
NaH2PO4-H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
MgCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
CaCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | C8106 | |
MgSO4-7 H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 |
see Ultrapure Water system
|
Ultrapure Water | Prepare 1 or 2M. | ||
KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
K-D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 Sigma | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KOH-EGTA (Etilene glycol-bis-N-tetracetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 Sigma | |
KOH- Hepes acid (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Mg2ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
Na3GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
Picrotoxin | Merck | P1675 Sigma | |
CNQX | Merck | C239 Sigma | |
Ice | |||
EQUIPMENT FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
Borosilicate glass pipette | Sutter Company | B150-86-10 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Vibratome | Leica | Leica VT1000 S | |
WaterBath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
Clampfit software | Molecular Devices | ||
Multiclamp software | Molecular Devices | ||
REAGENTS FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY |
Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin.
|
||
Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 |
Use at a concentration of 0.1%.
|
Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 |
Donkey.Use at a concentration of 1 : 400.
|
Serum | Merck Millipore | S30-100ML |
Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500.
|
4′,6-Diamidino-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 |
1: 600 in KPBS-T.
|
streptavidin- Cy3 | Thermo Fisher Scientific | 434315 | 1:5000, rabbit. |
Anti-GAD65/67 | Abcam | 1:2000, mouse. | |
Anti-PV | Sigma | P3088 | 1:200, goat. |
Anti-Chat | Merk | AB143 | 1:5000, rabbit. |
Anti-NPY | Immunostar | 22940 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | 1:1000, chicken. |
Anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
Mounting solution | Merck | 10981 |
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading
|
OCT | Agar Scientific | ||
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
Distilled water | |||
Anti-freeze solution | Tissue Pro Technology | AFS05-1000N, 1000 mL/ea. | |
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Confocal microscope | Leica | TCS SP8 laser scanning confocal microscope. | |
Prism | GraphPad | ||
Microtome | Leica | SM2010R |