इस प्रोटोकॉल सीधे vivo में reprogrammed interneurons पैदा करना है, मस्तिष्क में एक AAV आधारित वायरल प्रणाली और एक FLEX synapsin संचालित GFP रिपोर्टर, जो सेल पहचान और विवो में आगे विश्लेषण के लिए अनुमति देता है का उपयोग कर.
विवो में कार्यात्मक और उपप्रकार-विशिष्ट न्यूरॉन्स में मस्तिष्क में निवासी glia परिवर्तित करने के लिए वैकल्पिक सेल प्रतिस्थापन उपचार के विकास की दिशा में एक कदम आगे प्रदान करता है, जबकि भी उपकरण बनाने के लिए situ में सेल भाग्य का अध्ययन. तारीख करने के लिए, यह vivo reprogramming में के माध्यम से न्यूरॉन्स प्राप्त करने के लिए संभव हो गया है, लेकिन इन न्यूरॉन्स के सटीक phenotype या कैसे वे परिपक्व विस्तार से विश्लेषण नहीं किया गया है. इस प्रोटोकॉल में, हम एक AAV आधारित वायरल वेक्टर प्रणाली का उपयोग कर, में vivo reprogrammed न्यूरॉन्स की एक अधिक कुशल रूपांतरण और सेल-विशिष्ट पहचान का वर्णन. हम भी reprogrammed कोशिकाओं के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं’ न्यूरॉन परिपक्वता. फ्लिप-एक्साइस (फ्लेक्स) वैक्टर इंजेक्शन लगाकर, मस्तिष्क में विशिष्ट सेल प्रकारों के लिए reprogramming और synapsin-चालित रिपोर्टर जीन युक्त है कि सेल reprogramming के लिए लक्ष्य के रूप में सेवा. इस तकनीक को नए reprogrammed न्यूरॉन्स की आसान पहचान के लिए अनुमति देता है. परिणाम बताते हैं कि प्राप्त reprogrammed न्यूरॉन्स कार्यात्मक समय के साथ परिपक्व, synaptic संपर्क प्राप्त करते हैं और interneurons के विभिन्न प्रकार के electrophysiological गुण दिखा. प्रतिलेखन कारकों Ascl1, Lmx1a और Nurr1 का उपयोग करना, reprogrammed कोशिकाओं के बहुमत तेजी से spiking, parvalbumin युक्त interneurons के गुण है.
इस विधि के समग्र लक्ष्य कुशलता से इस तरह के parvalbumin-expressing interneurons के रूप में कार्यात्मक और उपप्रकार-विशिष्ट न्यूरॉन्स में विवो में मस्तिष्क निवासी ग्लिया परिवर्तित करने के लिए है। यह एक exogenous सेल स्रोत के लिए आवश्यकता के बिना मस्तिष्क रोगों के लिए एक वैकल्पिक सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी के विकास की दिशा में एक कदम आगे प्रदान करता है. यह भी सीटू में सेल भाग्य स्विच का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण बनाता है।
मस्तिष्क नए न्यूरॉन्स पैदा करने के लिए केवल एक सीमित क्षमता है. इसलिए, स्नायविक रोगों में, मस्तिष्क की मरम्मत के लिए exogenous सेल स्रोतों की जरूरत है. इसके लिए कोशिकाओं के विभिन्न स्रोतों पर पिछले कुछ वर्षों में गहन अनुसंधान किया गया है, जिसमें प्राथमिक ऊतक, स्टेम सेल व्युत्पन्न कोशिकाओं और पुनः क्रमादेशित कोशिकाओं1,2,3से कोशिकाओं को शामिल किया गया है। न्यूरॉन्स में निवासी मस्तिष्क कोशिकाओं के प्रत्यक्ष reprogramming एक हाल ही में दृष्टिकोण है कि मस्तिष्क की मरम्मत के लिए एक आकर्षक तरीका प्रदान कर सकता है के रूप में यह मस्तिष्क के अंदर उपन्यास न्यूरॉन्स पैदा करने के लिए रोगी की अपनी कोशिकाओं का उपयोग करता है. तारीख करने के लिए, कई रिपोर्टों जैसे मस्तिष्क 4,5,6,78,9 में वायरल वेक्टर वितरण के माध्यम से विवो reprogramming में दिखाया गया है कॉर्टेक्स , रीढ़ की हड्डी , स्ट्रेटम और मिडब्रेन5,10,11, साथ ही अक्षुण्ण और घावदार मस्तिष्क5,8,11,12. दोनों निरोधात्मक और उत्तेजक न्यूरॉन्स प्राप्त किया गया है4,8, लेकिन सटीक phenotype या इन कोशिकाओं की कार्यक्षमता अभी तक विस्तार से विश्लेषण नहीं किया गया है.
इस प्रोटोकॉल में, हम एक और अधिक कुशल reprogramming और कोशिका विशेष पहचान vivo reprogrammed न्यूरॉन्स में का वर्णन. हम कार्यक्षमता और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल लक्षण के आधार पर न्यूरोनल परिपक्वता और phenotype लक्षण के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।
हम एक Cre-inducible AAV वेक्टर और एक GFP रिपोर्टर का इस्तेमाल किया vivo reprogrammed न्यूरॉन्स की पहचान. वायरल सदिशों के इस चुनाव में मस्तिष्क की विभाजन और गैर-विभाजित कोशिकाओं दोनों को संक्रमित करने का लाभहोता है, जिससे लक्षित कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि होती है, जो रेट्रोवायरस 7,8के उपयोग के विकल्प के रूप में होती है। एक न्यूरॉन विशेष synapsin संचालित FLEX रिपोर्टर (GFP), हमें विशेष रूप से नए उत्पन्न न्यूरॉन्स का पता लगाने के लिए सक्षम. पिछले अध्ययनों में विवो reprogramming में के लिए subtype-विशिष्ट प्रमोटरों का इस्तेमाल किया है7,9, कि भी विशिष्ट सेल प्रकार में जीन और पत्रकारों reprogramming की अभिव्यक्ति की अनुमति. हालांकि, उस विधि रिपोर्टर और न्यूरॉन मार्करों के सह-अभिव्यक्ति के पोस्टमार्टम विश्लेषण द्वारा reprogrammed न्यूरॉन्स के आगे की पहचान की आवश्यकता है. एक न्यूरॉन विशेष संवाददाता का उपयोग, इस तरह के एक यहाँ वर्णित के रूप में, एक प्रत्यक्ष पहचान के लिए अनुमति देता है. यह एक सफल रूपांतरण का एक सीधा सबूत प्रदान करता है और पैच-क्लैम्प इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए आवश्यक है कि एक जीवित सेल पहचान की अनुमति देता है.
विवो प्रत्यक्ष reprogramming में क्रे-एक्सप्रेसिंग माउस उपभेदों में एएवी FLEX सदिशों का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि माउस उपभेदों के बीच reprogramming प्रभावकारिता के संबंध में मतभेद देखा गया है. के लिए vivo striatum में reprogramming, NG2-Cre माउस लाइन और अधिक कुशल जब अन्य उपभेदों के साथ तुलना में साबित कर दिया है. एक नया पशु तनाव का उपयोग शुरू करने से पहले, यह समय के साथ क्रे अभिव्यक्ति के बारे में माउस प्रदाता दिशा निर्देशों की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है, जानवरों की उम्र के रूप में अक्सर इस प्रोटीन अभिव्यक्ति की विशिष्टता को प्रभावित करता है. हमारे अध्ययन में, 12 सप्ताह से पुराने जानवरों के लिए vivo reprogramming में इस्तेमाल नहीं किया गया के रूप में वहाँ NG2 glia के अलावा अन्य कोशिकाओं में क्रे अभिव्यक्ति के लिए एक जोखिम था. नियंत्रण जानवरों की निरंतर उपस्थिति और निगरानी केवल Synapsin-FLEX-GFP निर्माण के साथ इंजेक्शन की सलाह दी है. यह GFP-सकारात्मक कोशिकाओं के लिए जानवरों की निगरानी की अनुमति देता है कि अगर कोई reprogramming जीन (ALN) का उपयोग किया जाता है मौजूद नहीं होना चाहिए.
नए reprogrammed न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए, इस प्रोटोकॉल में वर्णित एक के रूप में एक न्यूरॉन विशेष पहचान विधि अत्यंत महत्वपूर्ण है. यह एक उचित पहचान और अंतर्जात आसपास की कोशिकाओं है कि विशेष प्रासंगिकता की है जब एक homotopic क्षेत्र में reprogramming से reprogrammed न्यूरॉन्स के भेद के लिए अनुमति देता है.
वायरल इंजेक्शन के लिए सही संरचना को लक्षित करना भी महत्वपूर्ण है। इसलिए, वायरल इंजेक्शन के लिए stereotaxic सर्जरी महत्वपूर्ण है और सटीकता के साथ संपर्क किया जाना चाहिए, खासकर जब मस्तिष्क के छोटे संरचनाओं को लक्षित.
हम पहले से पता चला है11 कि यह एक ही reprogramming कारकों का उपयोग कर इन विट्रो reprogramming प्रयोगों के आधार पर vivo reprogramming में के परिणाम की भविष्यवाणी करने के लिए विश्वसनीय नहीं है. ब्याज के सभी कारकों इसलिए vivo में परीक्षण किया जाना चाहिए. हमारे हाथों में, कई अलग अलग कारक संयोजन न्यूरॉन्स के एक ही उपप्रकार दे (यानी, interneurons11 vivo में) तथ्य यह है कि इन जीन अन्य न्यूरॉन्स के विकास में फंसाया गया है के बावजूद.
reprogrammed न्यूरॉन्स के लिए पूरे सेल पैच दबाना एक नाजुक तकनीक है और ऊतक प्रसंस्करण एक अच्छा परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है. बर्फ ठंडा Krebs समाधान के साथ भ्रम ऊतक की गुणवत्ता में सुधार. इसके अलावा, समझौता न्यूरॉन्स ध्यान से इलाज किया जाना चाहिए. यहां तक कि अगर परिपक्वता और reprogrammed न्यूरॉन्स के phenotypic पहचान कुछ हद तक पूरे सेल पैच दबाना का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है, इन कोशिकाओं को पूरी तरह से उनके अंतर्जात समकक्षों के लिए तुलनीय नहीं हैं. विश्लेषण के अतिरिक्त प्रकार, जैसे जीनोम अनुक्रमण (जैसे, आरएनए अनुक्रमण) का उपयोग पुनः प्रोग्राम किए गए सेल पहचान की पुष्टि करने के लिए किया जाना चाहिए।
यहाँ वर्णित तकनीक भविष्य के उपचार जहां न्यूरॉन प्रतिस्थापन मस्तिष्क में की जरूरत है के विकास के लिए विचार किया जा सकता है. हालांकि विवो reprogramming में अपनी प्रारंभिक अवस्था में अब भी है और मनुष्यों में अनुवाद अभी तक पूर्वानुमान नहीं है, इस तकनीक मस्तिष्क में exogenous जीन समारोह का आकलन और विवो में अध्ययन कोशिका परिपक्वता के लिए एक विधि प्रदान कर सकता है.
The authors have nothing to disclose.
Marcela Birtele यूरोपीय संघ क्षितिज 2020 कार्यक्रम (H2020-MSCA-ITN-2015) मैरी Sk$odowska-Curie अभिनव प्रशिक्षण नेटवर्क और अनुदान समझौते नंबर 676408 के तहत द्वारा वित्त पोषित किया गया है. डेनिएला Rylander Ottosson स्वीडिश अनुसंधान परिषद (2017-01234) द्वारा वित्त पोषित किया गया है.
REAGENTS FOR AAV5 CLONING AND VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
pAAV-CA-FLEX | AddGene | 38042 | |
Ascl1 | AddGene | 67291 | NM_008553.4 |
Lmx1a | AddGene | 33013 | NM_0033652.5 |
Nurr1 | AddGene | 35000 | NM_013613.2 |
GFP-syn | AddGene | 30456 | |
LoxP (FLEX) sequence 1 | GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga agaggctctaga |
||
LoxP (FLEX) sequences 2 | tactagtataacttcgtataggatactttatac gaagttatcattgggattcttcctattttgatc caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct caccatcgacccataacttcgtatagcatacat tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC |
||
pDP5 | Plasmid Factory | PF435 | |
pDP6 | Plasmid Factory | PF436 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
FBS (Fetal bovine serum) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)+ Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61965026 | |
DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffer Saline) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
HEK293 cells | Thermo Fisher Scientific | 85120602-1VL | |
Flasks | BD Falcon | 10078780 | 175 cm2 |
Tris H-CL | Sigma Aldrich | 10812846001 |
For TE buffer use 10 mM, pH 8.0; for lysis buffer use 50mM, pH 8.5; for IE buffer use 20 mM, pH 8.0; for elution buffer use 20 mM, pH 8.0
|
EDTA | EDTA: Invitrogen | EDTA: AM9260G |
For TE buffer use 1 mM EDTA
|
Ultrapure water |
see Ultrapure water system
|
||
CaCl2 | SigmaAldrich | C5080 | 2.5 M |
Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 |
FOR HBS use 140 mM; for Lysis Buffer use 150 mM; for IE buffer use 15 mM; for elution buffer use 250 mM
|
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G |
For lysis Buffer: 1 mM
|
Ultracentrifuge sealing tubes | Beckman Coulter | Quick-Seal® Polypropylene Tube | |
OptiPrep™ Density Gradient Medium | Sigma Aldrich | D1556-250ML | |
10-mL syringe-18G needle | BD | 305064 | |
Laboratory glass bottles | VWR | ? | |
Anion exchange filter | PALL laboratory | MSTG25Q6 |
Acrodisc unit with Mustang Q membrane
|
Centrifugal filter unit | Merck | Z740210-24EA |
Amicon Ultra-4 device
|
Endotoxin-Free Plasmid DNA Isolation Kits | Thermo Fisher Scientific | A33073 | |
Na2PO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | 15 mL |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352196 | |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352070 | |
Glass Vials | Novatech | 30209-1232 |
CGGCCTCAGFGAGCGA
|
Forward Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
GGAACCCCTAGTGATGGAGTT
|
||
Reverse Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG
|
||
5´FAM / 3´BHQ1 probe | Jena Bioscience | ||
0.22 mm filter | Merck | SLGV004SL | Millex-GV filter |
EQUIPMENT AAV5 VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
Freezer -20 °C | |||
Freezer -80 °C | |||
Fridge +4 °C | |||
AAV viral room | |||
Ultrapure Water system | Merck | Milli-Q® IQ 7000 | |
Vortex mixer | VWR | 444-0004 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | |
Autoclave | Tuttnauer | 2540 EL | |
Polymerase Chain Reaction (PCR) | BioRad | C1000 Touch Thermal Cycler | |
Quantitative PCR (qPCR) | Roche | LightCycler® 480 System | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST16 | |
Water Bath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
ANIMAL MODEL | |||
NG2-Cre mice | Jackson | NG2-CrexB6129, Stock #008533 | |
REAGENTS FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN | |||
Water | |||
Saline | Apoteket AB | 70% | |
Ethanol | Solveco | ||
Isolfurane | Apoteket AB |
Dilute to 1% solution with warm water.
|
|
Virkon | Viroderm | 7511 | |
Pentobarbital | Apoteket AB | P0500000 |
i.p. for terminal procedure at the dose of 60 mg/ml.
|
Sucrose | Merck | S0389-500G | |
Trypan Blu | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Retrobeads | Lumafluor | R170 | |
Buprenorphine | Apoteket AB | ||
EQUIPMENT FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN |
From RSG Solingen.
|
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Scissors | VWR | 233-1552 | From Biochem. |
Tweezers | VWR | 232-0007 | |
Forcep | VWR | 232-0120 | |
Scalpel holder | VWR | RSGA106.621 | Number 20. |
Scalpel | VWR | RSGA106.200 | |
Stereotaxic frame | Stoelting Europe | 51500D | |
Mouse ear bars | Stoelting Europe | 51648 | 5 ul |
Syringe with Removable needle | Hamilton Company | 65 |
0,75 inner diameter and 1.5 outer diameter.
|
Glass capilaries | Stoelting | 50811 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Dental drill | Agnthos AB | 1464 | |
Shaver | Agnthos AB | GT420 | |
Isoflurane Chamber and pump | Agnthos AB | 8323101 | 2 mL |
Syringes | Merck | Z118400-30EA | 25G |
Needles | Merck | Z192414 Aldrich | |
Mouse and neonatal rat adaptor for stereotaxic fram | Stoelting | 51625 | |
Heating pad | Braintree scientific, inc | 53800M |
From Covidien 2187.
|
Cotton gauze | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
Rubber tube | Elfa Distrelec | HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150 | |
Cotton swabs | Fisher Scientific | 18-366-473 | |
REAGENTS FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
NaH2PO4-H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
MgCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
CaCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | C8106 | |
MgSO4-7 H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 |
see Ultrapure Water system
|
Ultrapure Water | Prepare 1 or 2M. | ||
KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
K-D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 Sigma | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KOH-EGTA (Etilene glycol-bis-N-tetracetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 Sigma | |
KOH- Hepes acid (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Mg2ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
Na3GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
Picrotoxin | Merck | P1675 Sigma | |
CNQX | Merck | C239 Sigma | |
Ice | |||
EQUIPMENT FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
Borosilicate glass pipette | Sutter Company | B150-86-10 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Vibratome | Leica | Leica VT1000 S | |
WaterBath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
Clampfit software | Molecular Devices | ||
Multiclamp software | Molecular Devices | ||
REAGENTS FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY |
Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin.
|
||
Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 |
Use at a concentration of 0.1%.
|
Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 |
Donkey.Use at a concentration of 1 : 400.
|
Serum | Merck Millipore | S30-100ML |
Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500.
|
4′,6-Diamidino-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 |
1: 600 in KPBS-T.
|
streptavidin- Cy3 | Thermo Fisher Scientific | 434315 | 1:5000, rabbit. |
Anti-GAD65/67 | Abcam | 1:2000, mouse. | |
Anti-PV | Sigma | P3088 | 1:200, goat. |
Anti-Chat | Merk | AB143 | 1:5000, rabbit. |
Anti-NPY | Immunostar | 22940 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | 1:1000, chicken. |
Anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
Mounting solution | Merck | 10981 |
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading
|
OCT | Agar Scientific | ||
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
Distilled water | |||
Anti-freeze solution | Tissue Pro Technology | AFS05-1000N, 1000 mL/ea. | |
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Confocal microscope | Leica | TCS SP8 laser scanning confocal microscope. | |
Prism | GraphPad | ||
Microtome | Leica | SM2010R |