Dieses Protokoll zielt darauf ab, direkt umprogrammierte Interneuronen in vivo zu erzeugen, indem ein AAV-basiertes Virussystem im Gehirn und ein FLEX synapsingesteuerter GFP-Reporter verwendet werden, der die Zellidentifikation und weitere Analyse in vivo ermöglicht.
Die Umwandlung von Resident Glia im Gehirn in funktionelle und subtypspezifische Neuronen in vivo ist ein Schritt in Richtung der Entwicklung alternativer Zellersatztherapien und schafft gleichzeitig Werkzeuge, um das Zellschicksal vor Ort zu untersuchen. Bis heute war es möglich, Neuronen durch In-vivo-Reprogrammierung zu erhalten, aber der genaue Phänotyp dieser Neuronen oder wie sie reifen, wurde nicht im Detail analysiert. In diesem Protokoll beschreiben wir eine effizientere Konvertierung und zellspezifische Identifizierung der in vivo reprogrammierten Neuronen mit Hilfe eines AAV-basierten viralen Vektorsystems. Wir bieten auch ein Protokoll zur funktionellen Bewertung der neuronalen Reifung der umprogrammierten Zellen. Durch Injektion von Flip-Excision(FLEX)-Vektoren, die die Reprogrammierung und synapsingesteuerte Reportergene in bestimmte Zelltypen im Gehirn enthalten, die als Ziel für die Zellreprogrammierung dienen. Diese Technik ermöglicht die einfache Identifizierung neu neu programmierter Neuronen. Die Ergebnisse zeigen, dass die erhaltenen neu programmierten Neuronen funktionell im Laufe der Zeit reifen, synaptische Kontakte erhalten und elektrophysiologische Eigenschaften verschiedener Arten von Interneuronen zeigen. Mit den Transkriptionsfaktoren Ascl1, Lmx1a und Nurr1 haben die meisten umprogrammierten Zellen Eigenschaften von schnell speichelnden, parvalbuminhaltigen Interneuronen.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, hirnresidente Glia in vivo effizient in funktionelle und subtypspezifische Neuronen wie Parvalbumin-extierende Interneurons umzuwandeln. Dies ist ein Schritt nach vorn in Richtung der Entwicklung einer alternativen Zellersatztherapie für Hirnerkrankungen ohne die Notwendigkeit einer exogenen Zellquelle. Es schafft auch ein Werkzeug, um Zellschicksalsschalter vor Ort zu untersuchen.
Das Gehirn hat nur eine begrenzte Kapazität für die Erzeugung neuer Neuronen. Daher, bei neurologischen Erkrankungen, gibt es einen Bedarf an exogenen Zellquellen für die Reparatur des Gehirns. Dazu wurden im Laufe der Jahre verschiedene Zellquellen intensiv erforscht, darunter Zellen aus Primärgewebe, Stammzellen-abgeleitete Zellen und umprogrammierte Zellen1,2,3. Direkte Reprogrammierung von ansässigen Gehirnzellen in Neuronen ist ein neuer Ansatz, der eine attraktive Methode für die Reparatur des Gehirns bieten könnte, da es die eigenen Zellen des Patienten für die Erzeugung neuer Neuronen im Gehirn verwendet. Bis heute haben mehrere Berichte gezeigt, in vivo Reprogrammierung durch virale Vektor-Bereitstellung im Gehirn4,5,6,78,9 in verschiedenen Hirnregionen wie der Kortex, Rückenmark, Striatum und das Mittelhirn5,10,11, sowie in intakten und läsioned Gehirn5,8,11,12. Sowohl hemmende als auch exzitatorische Neuronen wurdenerhalten 4,8, aber der genaue Phänotyp oder die Funktionalität dieser Zellen wurde noch nicht im Detail analysiert.
In diesem Protokoll beschreiben wir eine effizientere Reprogrammierung und zellspezifische Identifizierung von in vivo reprogrammierten Neuronen. Wir bieten ein Protokoll zur funktionellen Beurteilung der neuronalen Reifung und Phänotypcharakterisierung basierend auf Funktionalität und immunhistochemischen Merkmalen.
Wir verwendeten einen creinduzierbaren AAV-Vektor und einen GFP-Reporter, um die in vivo reprogrammierten Neuronen zu identifizieren. Diese Wahl der viralen Vektoren hat den Vorteil, sowohl teilende als auch nicht trennende Zellen des Gehirns zu infizieren, wodurch die Anzahl der Zielzellen erhöht wird, als Alternative zur Verwendung des Retrovirus7,8. Ein neuronspezifischer synapsingesteuerter FLEX-Reporter (GFP) ermöglichte es uns, die neu generierten Neuronen gezielt zu erkennen. Frühere Studien haben subtypspezifische Promotoren für die In-vivo-Reprogrammierung7,9verwendet, die auch die Expression von Reprogrammierungsgen und Reportern in bestimmten Zelltypen ermöglichen. Diese Methode erfordert jedoch eine weitere Identifizierung umprogrammierter Neuronen durch postmortale Analyse der Koexpression von Reportern und neuronalen Markern. Die Verwendung eines neuronspezifischen Reporters, wie er hier beschrieben wird, ermöglicht eine direkte Identifizierung. Dies ist ein direkter Beweis für eine erfolgreiche Umwandlung und ermöglicht eine Live-Zell-Identifikation, die für die Patch-Clamp-Elektrophysiologie erforderlich ist.
Die direkte In-vivo-Reprogrammierung kann mit AAV FLEX-Vektoren in Cre-expressing-Mausstämmen erreicht werden. Es ist wichtig zu beachten, dass Unterschiede zwischen Denspezien in Bezug auf die Reprogrammierung der Wirksamkeit beobachtet wurden. Bei der In-vivo-Reprogrammierung im Striatum hat sich die NG2-Cre-Mauslinie im Vergleich zu anderen Stämmen als die effizientere erwiesen. Bevor Sie mit der Verwendung eines neuen tierischen Stammes beginnen, ist es wichtig, die Richtlinien des Mausanbieters bezüglich der Cre-Expression im Laufe der Zeit zu überprüfen, da das Alter der Tiere oft die Spezifität dieser Proteinexpression beeinflusst. In unseren Studien wurden Tiere, die älter als 12 Wochen waren, nicht für die In-vivo-Reprogrammierung verwendet, da ein Risiko für die Cre-Expression in anderen Zellen als NG2-Glia bestand. Die ständige Anwesenheit und Überwachung von Kontrolltieren, die nur mit Synapsin-FLEX-GFP-Konstrukt injiziert werden, wird empfohlen. Dies ermöglicht die Überwachung der Tiere auf GFP-positive Zellen, die nicht vorhanden sein sollten, wenn keine Reprogrammierungsgene (ALN) verwendet werden.
Um die neu neu programmierten Neuronen zu identifizieren, ist eine neuronspezifische Identifizierungsmethode, wie sie in diesem Protokoll beschrieben wird, von größter Bedeutung. Dies ermöglicht eine korrekte Identifizierung und Unterscheidung der umprogrammierten Neuronen von den endogenen umgebenden Zellen, die bei der Umprogrammierung in einer homotopischen Region von besonderer Bedeutung ist.
Es ist auch wichtig, die richtige Struktur für die virale Injektion zu zielen. Daher ist die stereotaxic Chirurgie für die virale Injektion wichtig und muss mit Genauigkeit angegangen werden, vor allem, wenn kleinere Strukturen des Gehirns gezielt.
Wir haben11 zuvor gezeigt, dass es nicht zuverlässig ist, das Ergebnis einer In-vivo-Reprogrammierung auf der Grundlage von In-vitro-Reprogrammierungsexperimenten unter Verwendung der gleichen Reprogrammierungsfaktoren vorherzusagen. Alle Faktoren von Interesse müssen daher in vivo getestet werden. In unseren Händen geben viele verschiedene Faktorkombinationen den gleichen Subtyp von Neuronen (d.h. Interneurons11 in vivo) trotz der Tatsache, dass diese Gene in die Entwicklung anderer Neuronen involviert sind.
Ganzzellige Patchklemme für neu programmierte Neuronen ist eine delikate Technik und Gewebeverarbeitung ist wichtig für ein gutes Ergebnis. Perfusion mit eiskalter Krebslösung verbessert die Gewebequalität. Auch geflickte Neuronen müssen sorgfältig behandelt werden. Auch wenn die Reifung und die phänotypische Identität von neu programmierten Neuronen mit einer ganzzelligen Pflasterklemme etwas beurteilt werden können, sind diese Zellen nicht vollständig mit ihren endogenen Gegenstücken vergleichbar. Zusätzliche Arten der Analyse, wie z. B. genomische Sequenzierung (z. B. RNA-Sequenzierung), sollten verwendet werden, um die neu programmierte Zellidentität weiter zu bestätigen.
Die hier beschriebene Technik könnte für die Entwicklung zukünftiger Therapien in Betracht gezogen werden, bei denen neuronaler Ersatz im Gehirn benötigt wird. Obwohl sich die In-vivo-Reprogrammierung noch in den Anfängen befindet und die Übersetzung in den Menschen noch nicht absehbar ist, könnte diese Technik eine Methode zur Bewertung der exogenen Genfunktion im Gehirn und zur Untersuchung der Zellreifung in vivo bieten.
The authors have nothing to disclose.
Marcella Birtele wurde durch das Horizont 2020-Programm der Europäischen Union (H2020-MSCA-ITN-2015) im Rahmen der Innovativen Ausbildungsnetze von Marie Skodowska-Curie und der Finanzhilfevereinbarung Nr. 676408 finanziert. Daniella Rylander Ottosson wurde vom Schwedischen Forschungsrat (2017-01234) finanziert.
REAGENTS FOR AAV5 CLONING AND VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
pAAV-CA-FLEX | AddGene | 38042 | |
Ascl1 | AddGene | 67291 | NM_008553.4 |
Lmx1a | AddGene | 33013 | NM_0033652.5 |
Nurr1 | AddGene | 35000 | NM_013613.2 |
GFP-syn | AddGene | 30456 | |
LoxP (FLEX) sequence 1 | GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga agaggctctaga |
||
LoxP (FLEX) sequences 2 | tactagtataacttcgtataggatactttatac gaagttatcattgggattcttcctattttgatc caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct caccatcgacccataacttcgtatagcatacat tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC |
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pDP5 | Plasmid Factory | PF435 | |
pDP6 | Plasmid Factory | PF436 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
FBS (Fetal bovine serum) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)+ Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61965026 | |
DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffer Saline) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
HEK293 cells | Thermo Fisher Scientific | 85120602-1VL | |
Flasks | BD Falcon | 10078780 | 175 cm2 |
Tris H-CL | Sigma Aldrich | 10812846001 |
For TE buffer use 10 mM, pH 8.0; for lysis buffer use 50mM, pH 8.5; for IE buffer use 20 mM, pH 8.0; for elution buffer use 20 mM, pH 8.0
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EDTA | EDTA: Invitrogen | EDTA: AM9260G |
For TE buffer use 1 mM EDTA
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Ultrapure water |
see Ultrapure water system
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CaCl2 | SigmaAldrich | C5080 | 2.5 M |
Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 |
FOR HBS use 140 mM; for Lysis Buffer use 150 mM; for IE buffer use 15 mM; for elution buffer use 250 mM
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MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G |
For lysis Buffer: 1 mM
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Ultracentrifuge sealing tubes | Beckman Coulter | Quick-Seal® Polypropylene Tube | |
OptiPrep™ Density Gradient Medium | Sigma Aldrich | D1556-250ML | |
10-mL syringe-18G needle | BD | 305064 | |
Laboratory glass bottles | VWR | ? | |
Anion exchange filter | PALL laboratory | MSTG25Q6 |
Acrodisc unit with Mustang Q membrane
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Centrifugal filter unit | Merck | Z740210-24EA |
Amicon Ultra-4 device
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Endotoxin-Free Plasmid DNA Isolation Kits | Thermo Fisher Scientific | A33073 | |
Na2PO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | 15 mL |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352196 | |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352070 | |
Glass Vials | Novatech | 30209-1232 |
CGGCCTCAGFGAGCGA
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Forward Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
GGAACCCCTAGTGATGGAGTT
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Reverse Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG
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5´FAM / 3´BHQ1 probe | Jena Bioscience | ||
0.22 mm filter | Merck | SLGV004SL | Millex-GV filter |
EQUIPMENT AAV5 VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
Freezer -20 °C | |||
Freezer -80 °C | |||
Fridge +4 °C | |||
AAV viral room | |||
Ultrapure Water system | Merck | Milli-Q® IQ 7000 | |
Vortex mixer | VWR | 444-0004 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | |
Autoclave | Tuttnauer | 2540 EL | |
Polymerase Chain Reaction (PCR) | BioRad | C1000 Touch Thermal Cycler | |
Quantitative PCR (qPCR) | Roche | LightCycler® 480 System | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST16 | |
Water Bath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
ANIMAL MODEL | |||
NG2-Cre mice | Jackson | NG2-CrexB6129, Stock #008533 | |
REAGENTS FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN | |||
Water | |||
Saline | Apoteket AB | 70% | |
Ethanol | Solveco | ||
Isolfurane | Apoteket AB |
Dilute to 1% solution with warm water.
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Virkon | Viroderm | 7511 | |
Pentobarbital | Apoteket AB | P0500000 |
i.p. for terminal procedure at the dose of 60 mg/ml.
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Sucrose | Merck | S0389-500G | |
Trypan Blu | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Retrobeads | Lumafluor | R170 | |
Buprenorphine | Apoteket AB | ||
EQUIPMENT FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN |
From RSG Solingen.
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Scissors | VWR | 233-1552 | From Biochem. |
Tweezers | VWR | 232-0007 | |
Forcep | VWR | 232-0120 | |
Scalpel holder | VWR | RSGA106.621 | Number 20. |
Scalpel | VWR | RSGA106.200 | |
Stereotaxic frame | Stoelting Europe | 51500D | |
Mouse ear bars | Stoelting Europe | 51648 | 5 ul |
Syringe with Removable needle | Hamilton Company | 65 |
0,75 inner diameter and 1.5 outer diameter.
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Glass capilaries | Stoelting | 50811 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Dental drill | Agnthos AB | 1464 | |
Shaver | Agnthos AB | GT420 | |
Isoflurane Chamber and pump | Agnthos AB | 8323101 | 2 mL |
Syringes | Merck | Z118400-30EA | 25G |
Needles | Merck | Z192414 Aldrich | |
Mouse and neonatal rat adaptor for stereotaxic fram | Stoelting | 51625 | |
Heating pad | Braintree scientific, inc | 53800M |
From Covidien 2187.
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Cotton gauze | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
Rubber tube | Elfa Distrelec | HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150 | |
Cotton swabs | Fisher Scientific | 18-366-473 | |
REAGENTS FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
NaH2PO4-H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
MgCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
CaCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | C8106 | |
MgSO4-7 H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 |
see Ultrapure Water system
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Ultrapure Water | Prepare 1 or 2M. | ||
KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
K-D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 Sigma | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KOH-EGTA (Etilene glycol-bis-N-tetracetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 Sigma | |
KOH- Hepes acid (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Mg2ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
Na3GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
Picrotoxin | Merck | P1675 Sigma | |
CNQX | Merck | C239 Sigma | |
Ice | |||
EQUIPMENT FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
Borosilicate glass pipette | Sutter Company | B150-86-10 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Vibratome | Leica | Leica VT1000 S | |
WaterBath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
Clampfit software | Molecular Devices | ||
Multiclamp software | Molecular Devices | ||
REAGENTS FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY |
Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin.
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Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 |
Use at a concentration of 0.1%.
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Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 |
Donkey.Use at a concentration of 1 : 400.
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Serum | Merck Millipore | S30-100ML |
Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500.
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4′,6-Diamidino-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 |
1: 600 in KPBS-T.
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streptavidin- Cy3 | Thermo Fisher Scientific | 434315 | 1:5000, rabbit. |
Anti-GAD65/67 | Abcam | 1:2000, mouse. | |
Anti-PV | Sigma | P3088 | 1:200, goat. |
Anti-Chat | Merk | AB143 | 1:5000, rabbit. |
Anti-NPY | Immunostar | 22940 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | 1:1000, chicken. |
Anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
Mounting solution | Merck | 10981 |
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading
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OCT | Agar Scientific | ||
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
Distilled water | |||
Anti-freeze solution | Tissue Pro Technology | AFS05-1000N, 1000 mL/ea. | |
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Confocal microscope | Leica | TCS SP8 laser scanning confocal microscope. | |
Prism | GraphPad | ||
Microtome | Leica | SM2010R |