Ce protocole vise à générer des interneurones directement reprogrammés in vivo, à l’aide d’un système viral à base d’AAV dans le cerveau et d’un journaliste GFP piloté par la synapsine FLEX, qui permet l’identification cellulaire et une analyse plus approfondie in vivo.
La conversion des glies résidentes dans le cerveau en neurones fonctionnels et spécifiques au sous-type in vivo permet de faire un pas en avant vers le développement de thérapies alternatives de remplacement cellulaire tout en créant des outils pour étudier le destin cellulaire in situ. Jusqu’à présent, il a été possible d’obtenir des neurones par reprogrammation in vivo, mais le phénotype précis de ces neurones ou comment ils mûrissent n’a pas été analysé en détail. Dans ce protocole, nous décrivons une conversion plus efficace et une identification cellulaire spécifique des neurones reprogrammés in vivo, à l’aide d’un système vectorielle virale basé sur l’AAV. Nous fournissons également un protocole pour l’évaluation fonctionnelle de la maturation neuronale des cellules reprogrammées. En injectant des vecteurs flip-excision (FLEX), contenant les gènes de la reprogrammation et de la synapsine à des types de cellules spécifiques dans le cerveau qui servent de cible pour la reprogrammation cellulaire. Cette technique permet d’identifier facilement les neurones nouvellement reprogrammés. Les résultats montrent que les neurones reprogrammés obtenus mûrissent fonctionnellement au fil du temps, reçoivent des contacts synaptiques et montrent des propriétés électrophysiologiques de différents types d’interneurones. En utilisant les facteurs de transcription Ascl1, Lmx1a et Nurr1, la majorité des cellules reprogrammées ont des propriétés d’interneurons à pointe rapide et contenant de la parvalbumine.
L’objectif global de cette méthode est de convertir efficacement les gliales résidentes du cerveau in vivo en neurones fonctionnels et spécifiques au sous-type tels que les interneurons exprimant la parvalbumine. Ceci fournit un pas en avant vers le développement d’une thérapie alternative de remplacement de cellules pour des maladies de cerveau sans avoir besoin d’une source exogène de cellules. Il crée également un outil pour étudier les commutateurs de destin cellulaire in situ.
Le cerveau n’a qu’une capacité limitée pour générer de nouveaux neurones. Par conséquent, dans les maladies neurologiques, il ya un besoin de sources cellulaires exogènes pour la réparation du cerveau. Pour cela, différentes sources de cellules ont fait l’objet d’intenses recherches au fil des ans, y compris des cellules provenant de tissus primaires, de cellules souches dérivées et de cellules reprogrammées1,2,3. La reprogrammation directe des cellules cérébrales résidentes en neurones est une approche récente qui pourrait fournir une méthode attrayante pour la réparation du cerveau car elle utilise les propres cellules du patient pour générer de nouveaux neurones à l’intérieur du cerveau. À ce jour, plusieurs rapports ont montré la reprogrammation in vivo par la livraison de vecteurs viraux dans le cerveau4,6,6,78,9 dans différentes régions du cerveau telles que le cortex, la moelle épinière, le striatum et le midbrain5,10,11, ainsi que dans le cerveau intact et lesioned5,8,11,12. Les neurones inhibiteurs et excitateurs ont été obtenus4,8, mais le phénotype précis ou la fonctionnalité de ces cellules n’a pas encore été analysé en détail.
Dans ce protocole, nous décrivons une reprogrammation plus efficace et l’identification cellulaire-spécifique des neurones reprogrammés in vivo. Nous fournissons un protocole pour l’évaluation fonctionnelle de la maturation neuronale et de la caractérisation de phénotype basée sur la fonctionnalité et les traits immunohistochemical.
Nous avons utilisé un vecteur AAV inductible et un journaliste GFP pour identifier les neurones reprogrammés in vivo. Ce choix de vecteurs viraux a l’avantage d’infecter à la fois les cellules de division et de non-division du cerveau, en augmentant le nombre de cellules ciblées, comme une alternative à l’utilisation du rétrovirus7,8. Un journaliste FLEX (GFP) piloté par la synapsine spécifique aux neurones nous a permis de détecter spécifiquement les neurones nouvellement générés. Des études antérieures ont utilisé des promoteurs spécifiques au sous-type pour la reprogrammation in vivo7,9, qui permettent également l’expression de gènes de reprogrammation et de journalistes dans des types de cellules spécifiques. Cependant, cette méthode exige une identification plus poussée des neurones reprogrammés par l’analyse post mortem de la co-expression des marqueurs de journaliste et neuronal. L’utilisation d’un journaliste spécifique aux neurones, comme celui décrit ci-contre, permet une identification directe. Ceci fournit une preuve directe d’une conversion réussie et permet une identification de cellules vivantes qui est exigée pour l’électrophysiologie de correction-clamp.
La reprogrammation directe in vivo peut être réalisée à l’aide de vecteurs AAV FLEX dans les souches de souris exprimant cre. Il est important de noter que des différences entre les souches de souris en ce qui concerne l’efficacité de la reprogrammation ont été observées. Pour la reprogrammation in vivo dans le striatum, la ligne de souris NG2-Cre s’est avérée la plus efficace par rapport à d’autres souches. Avant de commencer à utiliser une nouvelle souche animale, il est important de vérifier les directives du fournisseur de souris concernant l’expression Cre au fil du temps, comme l’âge des animaux a souvent un impact sur la spécificité de cette expression protéique. Dans nos études, les animaux âgés de plus de 12 semaines n’ont pas été utilisés pour la reprogrammation in vivo car il y avait un risque d’expression cre dans des cellules autres que NG2 glia. La présence et la surveillance constantes des animaux témoins injectés uniquement avec la construction Synapsin-FLEX-GFP sont conseillées. Cela permet de surveiller les animaux pour les cellules GFP-positives qui ne devraient pas être présents si aucun gène de reprogrammation (ALN) n’est utilisé.
Pour identifier les neurones nouvellement reprogrammés, une méthode d’identification spécifique aux neurones comme celle décrite dans ce protocole est de la plus haute importance. Cela permet une identification et une distinction appropriées des neurones reprogrammés des cellules environnantes endogènes qui est d’une pertinence particulière lors de la reprogrammation dans une région homotopique.
Il est également important de cibler la structure correcte pour l’injection virale. Par conséquent, la chirurgie stéréotaxique pour l’injection virale est importante et doit être abordée avec précision, en particulier lorsque vous ciblez de plus petites structures du cerveau.
Nous avons déjà montré11 qu’il n’est pas fiable de prédire le résultat de la reprogrammation in vivo basée sur des expériences de reprogrammation in vitro en utilisant les mêmes facteurs de reprogrammation. Tous les facteurs d’intérêt doivent donc être testés in vivo. Dans nos mains, de nombreuses combinaisons de facteurs différents donnent le même sous-type de neurones (c.-à-d., interneurons11 in vivo) malgré le fait que ces gènes ont été impliqués dans le développement d’autres neurones.
La pince de correction de cellules entières pour les neurones reprogrammés est une technique délicate et le traitement de tissu est important pour un bon résultat. La perfusion avec la solution Krebs glacée améliore la qualité des tissus. En outre, les neurones patchés doivent être traités avec soin. Même si la maturation et l’identité phénotypique des neurones reprogrammés peuvent être quelque peu évaluées à l’aide de pinces à patch à cellules entières, ces cellules ne sont pas entièrement comparables à leurs homologues endogènes. D’autres types d’analyse, comme le séquençage du génome (p. ex., le séquençage de l’ARN) devraient être utilisés pour confirmer davantage l’identité cellulaire reprogrammée.
La technique décrite ci-dessous est pourrait être considérée pour le développement de thérapies futures où le remplacement neuronal est nécessaire dans le cerveau. Bien que la reprogrammation in vivo en soit encore à ses débuts et que la traduction chez l’homme ne soit pas encore prévue, cette technique pourrait fournir une méthode pour évaluer la fonction génique exogène dans le cerveau et étudier la maturation cellulaire in vivo.
The authors have nothing to disclose.
Marcella Birtele a été financée par le programme Horizon 2020 de l’Union européenne (H2020-MSCA-ITN-2015) dans le cadre des réseaux de formation innovants Marie Skoodowska-Curie et de l’Accord de subvention no 676408. Daniella Rylander Ottosson a été financée par le Conseil suédois de la recherche (2017-01234).
REAGENTS FOR AAV5 CLONING AND VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
pAAV-CA-FLEX | AddGene | 38042 | |
Ascl1 | AddGene | 67291 | NM_008553.4 |
Lmx1a | AddGene | 33013 | NM_0033652.5 |
Nurr1 | AddGene | 35000 | NM_013613.2 |
GFP-syn | AddGene | 30456 | |
LoxP (FLEX) sequence 1 | GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga agaggctctaga |
||
LoxP (FLEX) sequences 2 | tactagtataacttcgtataggatactttatac gaagttatcattgggattcttcctattttgatc caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct caccatcgacccataacttcgtatagcatacat tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC |
||
pDP5 | Plasmid Factory | PF435 | |
pDP6 | Plasmid Factory | PF436 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
FBS (Fetal bovine serum) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)+ Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61965026 | |
DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffer Saline) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
HEK293 cells | Thermo Fisher Scientific | 85120602-1VL | |
Flasks | BD Falcon | 10078780 | 175 cm2 |
Tris H-CL | Sigma Aldrich | 10812846001 |
For TE buffer use 10 mM, pH 8.0; for lysis buffer use 50mM, pH 8.5; for IE buffer use 20 mM, pH 8.0; for elution buffer use 20 mM, pH 8.0
|
EDTA | EDTA: Invitrogen | EDTA: AM9260G |
For TE buffer use 1 mM EDTA
|
Ultrapure water |
see Ultrapure water system
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CaCl2 | SigmaAldrich | C5080 | 2.5 M |
Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 |
FOR HBS use 140 mM; for Lysis Buffer use 150 mM; for IE buffer use 15 mM; for elution buffer use 250 mM
|
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G |
For lysis Buffer: 1 mM
|
Ultracentrifuge sealing tubes | Beckman Coulter | Quick-Seal® Polypropylene Tube | |
OptiPrep™ Density Gradient Medium | Sigma Aldrich | D1556-250ML | |
10-mL syringe-18G needle | BD | 305064 | |
Laboratory glass bottles | VWR | ? | |
Anion exchange filter | PALL laboratory | MSTG25Q6 |
Acrodisc unit with Mustang Q membrane
|
Centrifugal filter unit | Merck | Z740210-24EA |
Amicon Ultra-4 device
|
Endotoxin-Free Plasmid DNA Isolation Kits | Thermo Fisher Scientific | A33073 | |
Na2PO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | 15 mL |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352196 | |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352070 | |
Glass Vials | Novatech | 30209-1232 |
CGGCCTCAGFGAGCGA
|
Forward Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
GGAACCCCTAGTGATGGAGTT
|
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Reverse Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG
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5´FAM / 3´BHQ1 probe | Jena Bioscience | ||
0.22 mm filter | Merck | SLGV004SL | Millex-GV filter |
EQUIPMENT AAV5 VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
Freezer -20 °C | |||
Freezer -80 °C | |||
Fridge +4 °C | |||
AAV viral room | |||
Ultrapure Water system | Merck | Milli-Q® IQ 7000 | |
Vortex mixer | VWR | 444-0004 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | |
Autoclave | Tuttnauer | 2540 EL | |
Polymerase Chain Reaction (PCR) | BioRad | C1000 Touch Thermal Cycler | |
Quantitative PCR (qPCR) | Roche | LightCycler® 480 System | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST16 | |
Water Bath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
ANIMAL MODEL | |||
NG2-Cre mice | Jackson | NG2-CrexB6129, Stock #008533 | |
REAGENTS FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN | |||
Water | |||
Saline | Apoteket AB | 70% | |
Ethanol | Solveco | ||
Isolfurane | Apoteket AB |
Dilute to 1% solution with warm water.
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Virkon | Viroderm | 7511 | |
Pentobarbital | Apoteket AB | P0500000 |
i.p. for terminal procedure at the dose of 60 mg/ml.
|
Sucrose | Merck | S0389-500G | |
Trypan Blu | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Retrobeads | Lumafluor | R170 | |
Buprenorphine | Apoteket AB | ||
EQUIPMENT FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN |
From RSG Solingen.
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Scissors | VWR | 233-1552 | From Biochem. |
Tweezers | VWR | 232-0007 | |
Forcep | VWR | 232-0120 | |
Scalpel holder | VWR | RSGA106.621 | Number 20. |
Scalpel | VWR | RSGA106.200 | |
Stereotaxic frame | Stoelting Europe | 51500D | |
Mouse ear bars | Stoelting Europe | 51648 | 5 ul |
Syringe with Removable needle | Hamilton Company | 65 |
0,75 inner diameter and 1.5 outer diameter.
|
Glass capilaries | Stoelting | 50811 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Dental drill | Agnthos AB | 1464 | |
Shaver | Agnthos AB | GT420 | |
Isoflurane Chamber and pump | Agnthos AB | 8323101 | 2 mL |
Syringes | Merck | Z118400-30EA | 25G |
Needles | Merck | Z192414 Aldrich | |
Mouse and neonatal rat adaptor for stereotaxic fram | Stoelting | 51625 | |
Heating pad | Braintree scientific, inc | 53800M |
From Covidien 2187.
|
Cotton gauze | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
Rubber tube | Elfa Distrelec | HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150 | |
Cotton swabs | Fisher Scientific | 18-366-473 | |
REAGENTS FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
NaH2PO4-H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
MgCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
CaCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | C8106 | |
MgSO4-7 H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 |
see Ultrapure Water system
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Ultrapure Water | Prepare 1 or 2M. | ||
KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
K-D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 Sigma | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KOH-EGTA (Etilene glycol-bis-N-tetracetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 Sigma | |
KOH- Hepes acid (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Mg2ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
Na3GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
Picrotoxin | Merck | P1675 Sigma | |
CNQX | Merck | C239 Sigma | |
Ice | |||
EQUIPMENT FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
Borosilicate glass pipette | Sutter Company | B150-86-10 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Vibratome | Leica | Leica VT1000 S | |
WaterBath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
Clampfit software | Molecular Devices | ||
Multiclamp software | Molecular Devices | ||
REAGENTS FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY |
Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin.
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Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 |
Use at a concentration of 0.1%.
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Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 |
Donkey.Use at a concentration of 1 : 400.
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Serum | Merck Millipore | S30-100ML |
Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500.
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4′,6-Diamidino-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 |
1: 600 in KPBS-T.
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streptavidin- Cy3 | Thermo Fisher Scientific | 434315 | 1:5000, rabbit. |
Anti-GAD65/67 | Abcam | 1:2000, mouse. | |
Anti-PV | Sigma | P3088 | 1:200, goat. |
Anti-Chat | Merk | AB143 | 1:5000, rabbit. |
Anti-NPY | Immunostar | 22940 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | 1:1000, chicken. |
Anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
Mounting solution | Merck | 10981 |
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading
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OCT | Agar Scientific | ||
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
Distilled water | |||
Anti-freeze solution | Tissue Pro Technology | AFS05-1000N, 1000 mL/ea. | |
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Confocal microscope | Leica | TCS SP8 laser scanning confocal microscope. | |
Prism | GraphPad | ||
Microtome | Leica | SM2010R |