该协议旨在利用大脑中基于AAV的病毒系统和FLEX突触素驱动的GFP报告器,在体内直接重新编程的内神经,从而在体内进行细胞识别和进一步分析。
将大脑中的常驻胶质体转化为体内功能性和亚型特异性神经元,为开发替代细胞替代疗法提供了一步,同时也创造了研究原位细胞命运的工具。迄今为止,通过体内重新编程获得神经元是可能的,但是这些神经元的精确表型或它们是如何成熟的,还没有得到详细的分析。在此协议中,我们使用基于 AAV 的病毒载体系统描述了对体内重新编程神经元的更有效的转换和细胞特异性识别。我们还为重新编程的细胞神经元成熟功能评估提供了一个协议。通过注射翻转切除(FLEX)载体,将重新编程和突生驱动报告基因注入大脑中作为细胞重新编程目标的特定细胞类型。这种技术允许轻松识别新重新编程的神经元。结果表明,获得重新编程的神经元功能随时间而成熟,接受突触接触,并显示出不同类型内神经元的电生理特性。使用转录因子Ascl1、Lmx1a和Nurr1,大多数重新编程的细胞具有快速窥探、含帕弗巴平的内神经元特性。
该方法的总体目标是有效地将体内的大脑驻留胶质转化为功能性和亚型特异性神经元,如帕夫巴平表达内神经元。这为开发脑病替代疗法提供了一步,无需外源细胞源。它还创造了一个工具,研究细胞命运开关就地。
大脑产生新神经元的能力有限。因此,在神经系统疾病中,需要外源细胞源来修复大脑。为此,多年来,不同的细胞来源都进行了紧张的研究,包括来自原发组织的细胞、干细胞衍生细胞和重新编程的细胞1、2、3。将常驻脑细胞直接重新编程到神经元是最近的一种方法,它可以提供一个有吸引力的方法来修复大脑,因为它使用病人自己的细胞在大脑内产生新的神经元。迄今为止,已有几份报告显示,在体内通过病毒载体在大脑4、5、6、7 8、9的不同大脑区域进行病毒载体的重新编程,如皮层、脊髓、纹状体和中脑5、10、11,以及完整和病变的大脑5、8、11、12。抑制神经元和兴奋神经元都获得了4,8,但这些细胞的精确表型或功能尚未得到详细分析。
在此协议中,我们描述了对体内重新编程神经元的更有效的重新编程和细胞特异性识别。我们提供基于功能和免疫组织化学特征的神经元成熟和表型表型表征功能评估方案。
我们使用可诱导的AAV矢量和GFP报告器来识别体内重新编程的神经元。这种病毒载体的选择具有感染大脑分裂细胞和非分裂细胞的优点,增加靶向细胞的数量,作为使用逆转录病毒7,8的替代。神经元特异性突触蛋白驱动的FLEX报告器(GFP),使我们能够专门检测新生成的神经元。以前的研究已经使用亚型特异性启动子进行体内重新编程7,9,也允许在特定的细胞类型中表达重新编程的基因和报告器。然而,该方法需要进一步识别重新编程的神经元,通过死后分析报告和神经元标记的共同表达。使用神经元特定的报告器(如本文所述)允许直接识别。这提供了成功转换的直接证明,并允许修补夹电生理学所需的活细胞识别。
在活体内,可以直接重新编程,可以使用AAV FLEX矢量在Cre-表达小鼠菌株。需要注意的是,小鼠菌株在重新编程功效方面存在差异。对于在纹状体中重新编程,NG2-Cre 小鼠线已证明比其他菌株更有效。在开始使用新的动物菌株之前,请务必检查小鼠提供者指南,随着时间的推移,Cre表达,因为动物的年龄经常影响这种蛋白质表达的特异性。在我们的研究中,超过12周的动物没有用于体内重新编程,因为NG2胶质以外的细胞存在Cre表达的风险。建议对只注射Synapsin-FLEX-GFP结构的控制动物进行持续存在和监测。这允许监测动物的GFP阳性细胞,如果没有重新编程基因(ALN),不应该存在。
为了识别新重新编程的神经元,一种神经元特定的识别方法,如该协议中描述的方法至关重要。这允许正确识别和区分重新编程的神经元从内源性周围细胞,这是特别相关的,当重编程在同源区域。
目标为病毒注射的正确结构也很重要。因此,病毒注射的立体手术很重要,需要准确处理,特别是在针对大脑较小结构时。
我们之前已经表明,基于使用相同重新编程因子的体外重新编程实验预测体内重新编程的结果是不可靠的。因此,所有感兴趣的因素都需要在体内进行测试。在我们手中,许多不同的因子组合给予相同的神经元亚型(即体内的内神经元11),尽管这些基因与其他神经元的发展有关。
重新编程神经元的全细胞贴片夹是一种精细的技术,组织处理对于良好的结果非常重要。用冰冷的克雷布斯溶液灌注可改善组织质量。此外,修补的神经元需要仔细处理。即使重新编程的神经元的成熟和型型特征可以通过全细胞贴片夹进行一些评估,这些细胞也不能完全与内源性神经元进行比较。应使用其他类型的分析,如基因组测序(例如RNA测序)来进一步确认重新编程的细胞身份。
本文描述的技术可以考虑发展未来治疗,其中神经元替代需要在大脑中。虽然在体内重新编程还处于早期阶段,而且人类的翻译尚未预见到,但这项技术可以提供一种评估大脑外源基因功能和研究体内细胞成熟的方法。
The authors have nothing to disclose.
Marcella Birtele 由欧盟 Horizon 2020 计划 (H2020-MSCA-ITN-2015) 资助,该计划由玛丽·斯科多夫斯卡-库里埃创新培训网络和第 676408 号赠款协议提供。丹尼尔拉·赖兰德·奥托松由瑞典研究理事会资助(2017-01234)。
REAGENTS FOR AAV5 CLONING AND VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
pAAV-CA-FLEX | AddGene | 38042 | |
Ascl1 | AddGene | 67291 | NM_008553.4 |
Lmx1a | AddGene | 33013 | NM_0033652.5 |
Nurr1 | AddGene | 35000 | NM_013613.2 |
GFP-syn | AddGene | 30456 | |
LoxP (FLEX) sequence 1 | GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga agaggctctaga |
||
LoxP (FLEX) sequences 2 | tactagtataacttcgtataggatactttatac gaagttatcattgggattcttcctattttgatc caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct caccatcgacccataacttcgtatagcatacat tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC |
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pDP5 | Plasmid Factory | PF435 | |
pDP6 | Plasmid Factory | PF436 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
FBS (Fetal bovine serum) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)+ Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61965026 | |
DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffer Saline) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
HEK293 cells | Thermo Fisher Scientific | 85120602-1VL | |
Flasks | BD Falcon | 10078780 | 175 cm2 |
Tris H-CL | Sigma Aldrich | 10812846001 |
For TE buffer use 10 mM, pH 8.0; for lysis buffer use 50mM, pH 8.5; for IE buffer use 20 mM, pH 8.0; for elution buffer use 20 mM, pH 8.0
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EDTA | EDTA: Invitrogen | EDTA: AM9260G |
For TE buffer use 1 mM EDTA
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Ultrapure water |
see Ultrapure water system
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CaCl2 | SigmaAldrich | C5080 | 2.5 M |
Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 |
FOR HBS use 140 mM; for Lysis Buffer use 150 mM; for IE buffer use 15 mM; for elution buffer use 250 mM
|
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G |
For lysis Buffer: 1 mM
|
Ultracentrifuge sealing tubes | Beckman Coulter | Quick-Seal® Polypropylene Tube | |
OptiPrep™ Density Gradient Medium | Sigma Aldrich | D1556-250ML | |
10-mL syringe-18G needle | BD | 305064 | |
Laboratory glass bottles | VWR | ? | |
Anion exchange filter | PALL laboratory | MSTG25Q6 |
Acrodisc unit with Mustang Q membrane
|
Centrifugal filter unit | Merck | Z740210-24EA |
Amicon Ultra-4 device
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Endotoxin-Free Plasmid DNA Isolation Kits | Thermo Fisher Scientific | A33073 | |
Na2PO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | 15 mL |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352196 | |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352070 | |
Glass Vials | Novatech | 30209-1232 |
CGGCCTCAGFGAGCGA
|
Forward Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
GGAACCCCTAGTGATGGAGTT
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Reverse Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG
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5´FAM / 3´BHQ1 probe | Jena Bioscience | ||
0.22 mm filter | Merck | SLGV004SL | Millex-GV filter |
EQUIPMENT AAV5 VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
Freezer -20 °C | |||
Freezer -80 °C | |||
Fridge +4 °C | |||
AAV viral room | |||
Ultrapure Water system | Merck | Milli-Q® IQ 7000 | |
Vortex mixer | VWR | 444-0004 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | |
Autoclave | Tuttnauer | 2540 EL | |
Polymerase Chain Reaction (PCR) | BioRad | C1000 Touch Thermal Cycler | |
Quantitative PCR (qPCR) | Roche | LightCycler® 480 System | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST16 | |
Water Bath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
ANIMAL MODEL | |||
NG2-Cre mice | Jackson | NG2-CrexB6129, Stock #008533 | |
REAGENTS FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN | |||
Water | |||
Saline | Apoteket AB | 70% | |
Ethanol | Solveco | ||
Isolfurane | Apoteket AB |
Dilute to 1% solution with warm water.
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Virkon | Viroderm | 7511 | |
Pentobarbital | Apoteket AB | P0500000 |
i.p. for terminal procedure at the dose of 60 mg/ml.
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Sucrose | Merck | S0389-500G | |
Trypan Blu | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Retrobeads | Lumafluor | R170 | |
Buprenorphine | Apoteket AB | ||
EQUIPMENT FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN |
From RSG Solingen.
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Scissors | VWR | 233-1552 | From Biochem. |
Tweezers | VWR | 232-0007 | |
Forcep | VWR | 232-0120 | |
Scalpel holder | VWR | RSGA106.621 | Number 20. |
Scalpel | VWR | RSGA106.200 | |
Stereotaxic frame | Stoelting Europe | 51500D | |
Mouse ear bars | Stoelting Europe | 51648 | 5 ul |
Syringe with Removable needle | Hamilton Company | 65 |
0,75 inner diameter and 1.5 outer diameter.
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Glass capilaries | Stoelting | 50811 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Dental drill | Agnthos AB | 1464 | |
Shaver | Agnthos AB | GT420 | |
Isoflurane Chamber and pump | Agnthos AB | 8323101 | 2 mL |
Syringes | Merck | Z118400-30EA | 25G |
Needles | Merck | Z192414 Aldrich | |
Mouse and neonatal rat adaptor for stereotaxic fram | Stoelting | 51625 | |
Heating pad | Braintree scientific, inc | 53800M |
From Covidien 2187.
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Cotton gauze | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
Rubber tube | Elfa Distrelec | HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150 | |
Cotton swabs | Fisher Scientific | 18-366-473 | |
REAGENTS FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
NaH2PO4-H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
MgCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
CaCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | C8106 | |
MgSO4-7 H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 |
see Ultrapure Water system
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Ultrapure Water | Prepare 1 or 2M. | ||
KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
K-D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 Sigma | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KOH-EGTA (Etilene glycol-bis-N-tetracetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 Sigma | |
KOH- Hepes acid (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Mg2ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
Na3GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
Picrotoxin | Merck | P1675 Sigma | |
CNQX | Merck | C239 Sigma | |
Ice | |||
EQUIPMENT FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
Borosilicate glass pipette | Sutter Company | B150-86-10 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Vibratome | Leica | Leica VT1000 S | |
WaterBath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
Clampfit software | Molecular Devices | ||
Multiclamp software | Molecular Devices | ||
REAGENTS FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY |
Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin.
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Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 |
Use at a concentration of 0.1%.
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Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 |
Donkey.Use at a concentration of 1 : 400.
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Serum | Merck Millipore | S30-100ML |
Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500.
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4′,6-Diamidino-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 |
1: 600 in KPBS-T.
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streptavidin- Cy3 | Thermo Fisher Scientific | 434315 | 1:5000, rabbit. |
Anti-GAD65/67 | Abcam | 1:2000, mouse. | |
Anti-PV | Sigma | P3088 | 1:200, goat. |
Anti-Chat | Merk | AB143 | 1:5000, rabbit. |
Anti-NPY | Immunostar | 22940 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | 1:1000, chicken. |
Anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
Mounting solution | Merck | 10981 |
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading
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OCT | Agar Scientific | ||
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
Distilled water | |||
Anti-freeze solution | Tissue Pro Technology | AFS05-1000N, 1000 mL/ea. | |
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Confocal microscope | Leica | TCS SP8 laser scanning confocal microscope. | |
Prism | GraphPad | ||
Microtome | Leica | SM2010R |