このプロトコルは、脳内のAAVベースのウイルスシステムとFLEXシナプシン駆動GFPレポーターを使用して、生体内で直接再プログラムされたインターニューロンを生成することを目的としており、生体内での細胞同定とさらなる分析を可能にします。
脳内の常駐グリアを生体内の機能的およびサブタイプ特異的ニューロンに変換することは、代替細胞置換療法の開発に向けた一歩を踏み出す一方で、その場で細胞の運命を研究するツールを作成します。これまで、生体内リプログラミングを介してニューロンを得ることは可能でしたが、これらのニューロンの正確な表現型や成熟した方法は詳細には分析されていません。このプロトコルでは、AAVベースのウイルスベクターシステムを用いて、生体内再プログラムされたニューロンのより効率的な変換および細胞特異的同定について説明する。また、再プログラムされた細胞の神経成熟の機能評価のためのプロトコルも提供する。フリップ切除(FLEX)ベクターを注入することにより、リプログラミングおよびシナプシン駆動レポーター遺伝子を、細胞リプログラミングの標的となる脳内の特定の細胞型に含む。この技術は、新たに再プログラムされたニューロンを容易に同定することを可能にする。結果は、得られた再プログラムされたニューロンが時間の経過とともに機能的に成熟し、シナプス接触を受け取り、異なるタイプのインターニューロンの電気生理学的特性を示す。転写因子Ascl1、Lmx1aおよびNurr1を使用して、再プログラムされた細胞の大半は、高速スパイク、パルブアルブミン含有インターニューロンの特性を有する。
この方法の全体的な目標は、生体内の脳常駐グリアを、パルブアルブミン発現インターニューロンなどの機能的およびサブタイプ特異的ニューロンに効率的に変換することです。これは外因性細胞源を必要とせずに脳疾患に対する代替細胞補充療法の開発に向けた一歩を提供する。また、その場でセルの運命スイッチを研究するためのツールを作成します。
脳は新しいニューロンを生成するための限られた能力を持っています。.したがって、神経疾患においては、脳修復のための外因性細胞源の必要性がある。このために、細胞の異なる供給源は、原発組織、幹細胞由来細胞および再プログラムされた細胞1、2、3からの細胞を含む、長年にわたって激しい研究を受けてきた。常駐脳細胞をニューロンに直接リプログラミングすることは、患者自身の細胞を使用して脳内に新しいニューロンを生成するため、脳修復のための魅力的な方法を提供できる最近のアプローチです。現在までに、脳4、5、6、7 8、9などの異なる脳領域におけるウイルスベクター配信を通じた生体内リプログラミングに複数の報告が示されている。皮質、脊髄、線条体および中脳5、10、11、ならびに無傷および病変性脳5、8、11、12。阻害性ニューロンと興奮性ニューロンの両方が得られている 4,8,しかし、これらの細胞の正確な表現型または機能性はまだ詳細に分析されていません。
このプロトコルでは、生体内再プログラムされたニューロンのより効率的なリプログラミングと細胞特異的同定について述べている。機能性および免疫組織化学的形質に基づく神経成熟および表現型特性の機能評価のためのプロトコルを提供する。
我々は、誘導性AAVベクターとGFPレポーターを用いて、生体内で再プログラムされたニューロンを同定した。ウイルスベクターのこの選択は、脳の分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染するという利点があり、標的細胞の数を増加させ、レトロウイルス7、8の使用に代わるものとして。ニューロン特異的なシナプシン駆動FLEXレポーター(GFP)により、新たに生成されたニューロンを特異的に検出することが可能になりました。これまでの研究では、生体内リプログラミング7、9にサブタイプ特異的プロモーターを使用しており、特定の細胞型におけるリプログラミング遺伝子およびレポーターの発現も可能にしている。しかし、この方法では、レポーターとニューロンマーカーの共発現の死後分析により、再プログラムされたニューロンのさらなる同定が必要である。本明細書に記載されているようなニューロン特異的レポーターの使用は、直接的な同定を可能にする。これは成功した転換の直接証拠を提供し、パッチクランプ電気生理学に必要な生きている細胞の同一証明を可能にする。
生体内では、Cre発現マウス株におけるAAV FLEXベクターを用いて直接リプログラミングを行うことができる。リプログラミングの有効性に関してマウス株間の違いが観察されていることに注意することが重要です。線条体の生体内リプログラミングでは、NG2-Creマウスラインは、他の株と比較した場合、より効率的であることが証明されています。新しい動物株を使用し始める前に、動物の年齢がしばしばこのタンパク質発現の特異性に影響を与えるので、時間の経過とともにCre発現に関するマウスプロバイダーのガイドラインをチェックすることが重要です。我々の研究では、NG2グリア以外の細胞でCre発現のリスクがあったため、12週以上の動物は生体内リプログラミングに使用されなかった。シナプシン-FLEX-GFP構造のみで注入された対照動物の一定の存在および監視が助言される。これにより、リプログラミング遺伝子(ALN)を使用しない場合に存在してはならないGFP陽性細胞の動物のモニタリングが可能になります。
新たにプログラムされたニューロンを同定するためには、このプロトコルに記載されているようなニューロン特異的同定方法が最も重要である。これにより、同所細胞におけるリプログラミング時に特に関連性のある内因性の周囲細胞から再プログラムされたニューロンを適切に同定し、区別することができます。
ウイルス注射のための正しい構造を標的にすることも重要です。したがって、ウイルス注射のための立体手術は重要であり、特に脳のより小さな構造を標的とする場合には、正確にアプローチする必要があります。
我々は以前に、同じリプログラミング因子を用いたインビトロリプログラミング実験に基づいて生体内リプログラミングの結果を予測することは信頼できないことを示した。したがって、関心のあるすべての要因は、生体内でテストする必要があります。私たちの手の中では、これらの遺伝子が他のニューロンの発達に関与しているにもかかわらず、多くの異なる因子の組み合わせがニューロンの同じサブタイプ(すなわち、生体内のニューロン11)を与えます。
再プログラムされたニューロンのための全細胞パッチクランプは繊細な技術であり、組織処理は良好な結果のために重要です。氷冷クレブス溶液との灌流はティッシュの質を改善する。また、パッチを当てたニューロンは慎重に治療する必要があります。再プログラムされたニューロンの成熟および発現性同一性が全細胞パッチクランプを用いて幾分評価できるとしても、これらの細胞は内因性の同等物と完全に比較できない。ゲノムシーケンシング(例えば、RNAシーケンシング)などの追加のタイプの分析は、再プログラムされた細胞同一性をさらに確認するために使用されるべきである。
ここに記載される技術は、脳内で神経置換が必要な将来の治療法の開発のために考慮することができる。生体内リプログラミングはまだ初期段階にあり、ヒトへの翻訳はまだ予見されていないが、この技術は脳内の外因性遺伝子機能を評価し、生体内の細胞成熟を研究する方法を提供する可能性がある。
The authors have nothing to disclose.
マルセラ・ビルテレは、マリー・スクワドウスカ・キュリー・イノベーティブ・トレーニング・ネットワークおよび交付契約第676408号の下で、欧州連合ホライズン2020プログラム(H2020-MSCA-ITN-2015)によって資金提供されています。ダニエラ・ライランダー・オットソンはスウェーデン研究評議会(2017-01234)から資金提供を受けています。
REAGENTS FOR AAV5 CLONING AND VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
pAAV-CA-FLEX | AddGene | 38042 | |
Ascl1 | AddGene | 67291 | NM_008553.4 |
Lmx1a | AddGene | 33013 | NM_0033652.5 |
Nurr1 | AddGene | 35000 | NM_013613.2 |
GFP-syn | AddGene | 30456 | |
LoxP (FLEX) sequence 1 | GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga agaggctctaga |
||
LoxP (FLEX) sequences 2 | tactagtataacttcgtataggatactttatac gaagttatcattgggattcttcctattttgatc caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct caccatcgacccataacttcgtatagcatacat tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC |
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pDP5 | Plasmid Factory | PF435 | |
pDP6 | Plasmid Factory | PF436 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
FBS (Fetal bovine serum) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)+ Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61965026 | |
DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffer Saline) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
HEK293 cells | Thermo Fisher Scientific | 85120602-1VL | |
Flasks | BD Falcon | 10078780 | 175 cm2 |
Tris H-CL | Sigma Aldrich | 10812846001 |
For TE buffer use 10 mM, pH 8.0; for lysis buffer use 50mM, pH 8.5; for IE buffer use 20 mM, pH 8.0; for elution buffer use 20 mM, pH 8.0
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EDTA | EDTA: Invitrogen | EDTA: AM9260G |
For TE buffer use 1 mM EDTA
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Ultrapure water |
see Ultrapure water system
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CaCl2 | SigmaAldrich | C5080 | 2.5 M |
Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 |
FOR HBS use 140 mM; for Lysis Buffer use 150 mM; for IE buffer use 15 mM; for elution buffer use 250 mM
|
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G |
For lysis Buffer: 1 mM
|
Ultracentrifuge sealing tubes | Beckman Coulter | Quick-Seal® Polypropylene Tube | |
OptiPrep™ Density Gradient Medium | Sigma Aldrich | D1556-250ML | |
10-mL syringe-18G needle | BD | 305064 | |
Laboratory glass bottles | VWR | ? | |
Anion exchange filter | PALL laboratory | MSTG25Q6 |
Acrodisc unit with Mustang Q membrane
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Centrifugal filter unit | Merck | Z740210-24EA |
Amicon Ultra-4 device
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Endotoxin-Free Plasmid DNA Isolation Kits | Thermo Fisher Scientific | A33073 | |
Na2PO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | 15 mL |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352196 | |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352070 | |
Glass Vials | Novatech | 30209-1232 |
CGGCCTCAGFGAGCGA
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Forward Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
GGAACCCCTAGTGATGGAGTT
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Reverse Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG
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5´FAM / 3´BHQ1 probe | Jena Bioscience | ||
0.22 mm filter | Merck | SLGV004SL | Millex-GV filter |
EQUIPMENT AAV5 VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
Freezer -20 °C | |||
Freezer -80 °C | |||
Fridge +4 °C | |||
AAV viral room | |||
Ultrapure Water system | Merck | Milli-Q® IQ 7000 | |
Vortex mixer | VWR | 444-0004 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | |
Autoclave | Tuttnauer | 2540 EL | |
Polymerase Chain Reaction (PCR) | BioRad | C1000 Touch Thermal Cycler | |
Quantitative PCR (qPCR) | Roche | LightCycler® 480 System | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST16 | |
Water Bath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
ANIMAL MODEL | |||
NG2-Cre mice | Jackson | NG2-CrexB6129, Stock #008533 | |
REAGENTS FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN | |||
Water | |||
Saline | Apoteket AB | 70% | |
Ethanol | Solveco | ||
Isolfurane | Apoteket AB |
Dilute to 1% solution with warm water.
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Virkon | Viroderm | 7511 | |
Pentobarbital | Apoteket AB | P0500000 |
i.p. for terminal procedure at the dose of 60 mg/ml.
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Sucrose | Merck | S0389-500G | |
Trypan Blu | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Retrobeads | Lumafluor | R170 | |
Buprenorphine | Apoteket AB | ||
EQUIPMENT FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN |
From RSG Solingen.
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Scissors | VWR | 233-1552 | From Biochem. |
Tweezers | VWR | 232-0007 | |
Forcep | VWR | 232-0120 | |
Scalpel holder | VWR | RSGA106.621 | Number 20. |
Scalpel | VWR | RSGA106.200 | |
Stereotaxic frame | Stoelting Europe | 51500D | |
Mouse ear bars | Stoelting Europe | 51648 | 5 ul |
Syringe with Removable needle | Hamilton Company | 65 |
0,75 inner diameter and 1.5 outer diameter.
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Glass capilaries | Stoelting | 50811 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Dental drill | Agnthos AB | 1464 | |
Shaver | Agnthos AB | GT420 | |
Isoflurane Chamber and pump | Agnthos AB | 8323101 | 2 mL |
Syringes | Merck | Z118400-30EA | 25G |
Needles | Merck | Z192414 Aldrich | |
Mouse and neonatal rat adaptor for stereotaxic fram | Stoelting | 51625 | |
Heating pad | Braintree scientific, inc | 53800M |
From Covidien 2187.
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Cotton gauze | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
Rubber tube | Elfa Distrelec | HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150 | |
Cotton swabs | Fisher Scientific | 18-366-473 | |
REAGENTS FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
NaH2PO4-H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
MgCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
CaCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | C8106 | |
MgSO4-7 H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 |
see Ultrapure Water system
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Ultrapure Water | Prepare 1 or 2M. | ||
KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
K-D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 Sigma | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KOH-EGTA (Etilene glycol-bis-N-tetracetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 Sigma | |
KOH- Hepes acid (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Mg2ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
Na3GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
Picrotoxin | Merck | P1675 Sigma | |
CNQX | Merck | C239 Sigma | |
Ice | |||
EQUIPMENT FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
Borosilicate glass pipette | Sutter Company | B150-86-10 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Vibratome | Leica | Leica VT1000 S | |
WaterBath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
Clampfit software | Molecular Devices | ||
Multiclamp software | Molecular Devices | ||
REAGENTS FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY |
Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin.
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Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 |
Use at a concentration of 0.1%.
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Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 |
Donkey.Use at a concentration of 1 : 400.
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Serum | Merck Millipore | S30-100ML |
Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500.
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4′,6-Diamidino-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 |
1: 600 in KPBS-T.
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streptavidin- Cy3 | Thermo Fisher Scientific | 434315 | 1:5000, rabbit. |
Anti-GAD65/67 | Abcam | 1:2000, mouse. | |
Anti-PV | Sigma | P3088 | 1:200, goat. |
Anti-Chat | Merk | AB143 | 1:5000, rabbit. |
Anti-NPY | Immunostar | 22940 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | 1:1000, chicken. |
Anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
Mounting solution | Merck | 10981 |
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading
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OCT | Agar Scientific | ||
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
Distilled water | |||
Anti-freeze solution | Tissue Pro Technology | AFS05-1000N, 1000 mL/ea. | |
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Confocal microscope | Leica | TCS SP8 laser scanning confocal microscope. | |
Prism | GraphPad | ||
Microtome | Leica | SM2010R |