Este protocolo tiene como objetivo generar interneuronas directamente reprogramadas in vivo, utilizando un sistema viral basado en AAV en el cerebro y un reportero de FPSG impulsado por la sinapsina FLEX, que permite la identificación celular y el análisis posterior in vivo.
Convertir la glia residente en el cerebro en neuronas funcionales y específicas del subtipo in vivo proporciona un paso hacia el desarrollo de terapias alternativas de reemplazo celular mientras que también crea herramientas para estudiar el destino celular in situ. Hasta la fecha, ha sido posible obtener neuronas a través de la reprogramación in vivo, pero el fenotipo preciso de estas neuronas o cómo maduran no se ha analizado en detalle. En este protocolo, describimos una conversión más eficiente y una identificación específica de la célula de las neuronas reprogramadas in vivo, utilizando un sistema vectorial viral basado en AAV. También proporcionamos un protocolo para la evaluación funcional de la maduración neuronal de las células reprogramadas. Mediante la inyección de vectores de flip-escision (FLEX), que contienen los genes de reportero impulsados por la reprogramación y la sinapsina a tipos de células específicas en el cerebro que sirven como el objetivo para la reprogramación celular. Esta técnica permite la fácil identificación de las neuronas recién reprogramadas. Los resultados muestran que las neuronas reprogramadas obtenidas maduran funcionalmente con el tiempo, reciben contactos sinápticos y muestran propiedades electrofisiológicas de diferentes tipos de interneuronas. Usando los factores de transcripción Ascl1, Lmx1a y Nurr1, la mayoría de las células reprogramadas tienen propiedades de las interneuronas que contienen parrebúta y parvalbumina.
El objetivo general de este método es convertir eficientemente la glia residente del cerebro in vivo en neuronas funcionales y específicas del subtipo, como las interneuronas que expresan parvalbumina. Esto proporciona un paso adelante hacia el desarrollo de una terapia de reemplazo celular alternativo para enfermedades cerebrales sin la necesidad de una fuente celular exógena. También crea una herramienta para estudiar los cambios de destino celular in situ.
El cerebro tiene una capacidad limitada para generar nuevas neuronas. Por lo tanto, en las enfermedades neurológicas, hay una necesidad de fuentes celulares exógenas para la reparación del cerebro. Para ello, diferentes fuentes de células han sido sometidas a intensas investigaciones a lo largo de los años, incluyendo células de tejido primario, células derivadas de células madre y células reprogramadas1,2,3. La reprogramación directa de las células cerebrales residentes en las neuronas es un enfoque reciente que podría proporcionar un método atractivo para la reparación del cerebro, ya que utiliza las propias células del paciente para generar nuevas neuronas dentro del cerebro. Hasta la fecha, varios informes han mostrado in vivo reprogramación a través de la entrega de vectores virales en el cerebro4,5,6,78,9 en diferentes regiones cerebrales como la corteza, la médula espinal, elestriado y el cerebro medio 5,10,11, así como en el cerebro intacto y lesionado5,8,11,12. Tanto las neuronas inhibitorias comolas excitatorias se han obtenido 4,8, pero el fenotipo preciso o funcionalidad de estas células aún no se ha analizado en detalle.
En este protocolo, describimos una reprogramación más eficiente y una identificación específica de la célula de las neuronas reprogramadas in vivo. Proporcionamos un protocolo para la evaluación funcional de la maduración neuronal y la caracterización del fenotipo basada en la funcionalidad y los rasgos inmunohistoquímicos.
Usamos un vector AAV inducible cre y un reportero de GFP para identificar las neuronas reprogramadas in vivo. Esta elección de vectores virales tiene la ventaja de infectar células divisorias y no divisorias del cerebro,aumentando el número de células objetivo, como alternativa al uso del retrovirus 7,8. Un reportero FLEX (GFP, por sus tantos) basado en neuronas, nos permitió detectar específicamente las neuronas recién generadas. Estudios anteriores han utilizado promotores específicos de subtipos para la reprogramación in vivo7,9, que también permiten la expresión de reprogramación de genes y reporteros en tipos de células específicas. Sin embargo, ese método requiere una mayor identificación de las neuronas reprogramadas mediante el análisis postmortem de la coexpresión del reportero y los marcadores neuronales. El uso de un reportero específico de neuronas, como el descrito en este documento, permite una identificación directa. Esto proporciona una prueba directa de una conversión exitosa y permite una identificación celular en vivo que se requiere para la electrofisiología de abrazadera de parche.
La reprogramación directa in vivo se puede lograr utilizando vectores AAV FLEX en cepas de ratón C-expressing. Es importante tener en cuenta que se han observado diferencias entre las cepas del ratón con respecto a la eficacia de reprogramación. Para la reprogramación in vivo en el estriado, la línea de ratón NG2-Cre ha demostrado ser la más eficiente en comparación con otras cepas. Antes de comenzar a utilizar una nueva cepa animal, es importante comprobar las pautas del proveedor de ratón con respecto a la expresión de Cre a lo largo del tiempo, ya que la edad de los animales a menudo afecta a la especificidad de esta expresión proteica. En nuestros estudios, los animales mayores de 12 semanas no se utilizaron para la reprogramación in vivo, ya que existía un riesgo para la expresión de Cre en células distintas de NG2 glia. Se recomienda la presencia y el seguimiento constantes de los animales de control inyectados únicamente con la construcción Synapsin-FLEX-GFP. Esto permite el seguimiento de los animales en busca de células positivas en la PTF que no deben estar presentes si no se utilizan genes de reprogramación (ALN).
Para identificar las neuronas recién reprogramadas, un método de identificación específico de la neurona como el descrito en este protocolo es de suma importancia. Esto permite una adecuada identificación y distinción de las neuronas reprogramadas de las células circundantes endógenas que es de particular relevancia cuando la reprogramación en una región homotópica.
También es importante orientar la estructura correcta para la inyección viral. Por lo tanto, la cirugía estereotaxia para la inyección viral es importante y necesita ser abordada con precisión, especialmente cuando se dirige a estructuras más pequeñas del cerebro.
Hemos demostrado anteriormente11 que no es fiable predecir el resultado de la reprogramación in vivo basada en experimentos de reprogramación in vitro utilizando los mismos factores de reprogramación. Por lo tanto, todos los factores de interés deben probarse in vivo. En nuestras manos, muchas combinaciones de factores diferentes dan el mismo subtipo de neuronas (es decir, interneuronas11 in vivo) a pesar del hecho de que estos genes han estado implicados en el desarrollo de otras neuronas.
La abrazadera de parche de células enteras para neuronas reprogramadas es una técnica delicada y el procesamiento de tejidos es importante para un buen resultado. La perfusión con solución Krebs helada mejora la calidad del tejido. Además, las neuronas parcheadas necesitan ser tratadas cuidadosamente. Incluso si la maduración y la identidad fenotípica de las neuronas reprogramadas se pueden evaluar un poco utilizando una abrazadera de parche de células enteras, estas células no son totalmente comparables a sus contrapartes endógenas. Se deben utilizar tipos adicionales de análisis, como la secuenciación del genoma (por ejemplo, la secuenciación de ARN) para confirmar aún más la identidad celular reprogramada.
La técnica descrita en este documento se podría considerar para el desarrollo de futuras terapias donde se necesita reemplazo neuronal en el cerebro. Aunque la reprogramación in vivo todavía está en sus primeras etapas y la traducción a los seres humanos aún no está prevista, esta técnica podría proporcionar un método para evaluar la función génica exógena en el cerebro y estudiar la maduración celular in vivo.
The authors have nothing to disclose.
Marcella Birtele ha sido financiada por el Programa Horizonte 2020 de la Unión Europea (H2020-MSCA-ITN-2015) en virtud de las redes de formación innovadora Marie Sk-odowska-Curie y el Acuerdo de Subvención No 676408. Daniella Rylander Ottosson ha sido financiada por el Consejo Sueco de Investigación (2017-01234).
REAGENTS FOR AAV5 CLONING AND VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
pAAV-CA-FLEX | AddGene | 38042 | |
Ascl1 | AddGene | 67291 | NM_008553.4 |
Lmx1a | AddGene | 33013 | NM_0033652.5 |
Nurr1 | AddGene | 35000 | NM_013613.2 |
GFP-syn | AddGene | 30456 | |
LoxP (FLEX) sequence 1 | GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga agaggctctaga |
||
LoxP (FLEX) sequences 2 | tactagtataacttcgtataggatactttatac gaagttatcattgggattcttcctattttgatc caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct caccatcgacccataacttcgtatagcatacat tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC |
||
pDP5 | Plasmid Factory | PF435 | |
pDP6 | Plasmid Factory | PF436 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
FBS (Fetal bovine serum) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)+ Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61965026 | |
DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffer Saline) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
HEK293 cells | Thermo Fisher Scientific | 85120602-1VL | |
Flasks | BD Falcon | 10078780 | 175 cm2 |
Tris H-CL | Sigma Aldrich | 10812846001 |
For TE buffer use 10 mM, pH 8.0; for lysis buffer use 50mM, pH 8.5; for IE buffer use 20 mM, pH 8.0; for elution buffer use 20 mM, pH 8.0
|
EDTA | EDTA: Invitrogen | EDTA: AM9260G |
For TE buffer use 1 mM EDTA
|
Ultrapure water |
see Ultrapure water system
|
||
CaCl2 | SigmaAldrich | C5080 | 2.5 M |
Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 |
FOR HBS use 140 mM; for Lysis Buffer use 150 mM; for IE buffer use 15 mM; for elution buffer use 250 mM
|
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G |
For lysis Buffer: 1 mM
|
Ultracentrifuge sealing tubes | Beckman Coulter | Quick-Seal® Polypropylene Tube | |
OptiPrep™ Density Gradient Medium | Sigma Aldrich | D1556-250ML | |
10-mL syringe-18G needle | BD | 305064 | |
Laboratory glass bottles | VWR | ? | |
Anion exchange filter | PALL laboratory | MSTG25Q6 |
Acrodisc unit with Mustang Q membrane
|
Centrifugal filter unit | Merck | Z740210-24EA |
Amicon Ultra-4 device
|
Endotoxin-Free Plasmid DNA Isolation Kits | Thermo Fisher Scientific | A33073 | |
Na2PO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | 15 mL |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352196 | |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352070 | |
Glass Vials | Novatech | 30209-1232 |
CGGCCTCAGFGAGCGA
|
Forward Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
GGAACCCCTAGTGATGGAGTT
|
||
Reverse Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG
|
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5´FAM / 3´BHQ1 probe | Jena Bioscience | ||
0.22 mm filter | Merck | SLGV004SL | Millex-GV filter |
EQUIPMENT AAV5 VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
Freezer -20 °C | |||
Freezer -80 °C | |||
Fridge +4 °C | |||
AAV viral room | |||
Ultrapure Water system | Merck | Milli-Q® IQ 7000 | |
Vortex mixer | VWR | 444-0004 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | |
Autoclave | Tuttnauer | 2540 EL | |
Polymerase Chain Reaction (PCR) | BioRad | C1000 Touch Thermal Cycler | |
Quantitative PCR (qPCR) | Roche | LightCycler® 480 System | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST16 | |
Water Bath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
ANIMAL MODEL | |||
NG2-Cre mice | Jackson | NG2-CrexB6129, Stock #008533 | |
REAGENTS FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN | |||
Water | |||
Saline | Apoteket AB | 70% | |
Ethanol | Solveco | ||
Isolfurane | Apoteket AB |
Dilute to 1% solution with warm water.
|
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Virkon | Viroderm | 7511 | |
Pentobarbital | Apoteket AB | P0500000 |
i.p. for terminal procedure at the dose of 60 mg/ml.
|
Sucrose | Merck | S0389-500G | |
Trypan Blu | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Retrobeads | Lumafluor | R170 | |
Buprenorphine | Apoteket AB | ||
EQUIPMENT FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN |
From RSG Solingen.
|
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Scissors | VWR | 233-1552 | From Biochem. |
Tweezers | VWR | 232-0007 | |
Forcep | VWR | 232-0120 | |
Scalpel holder | VWR | RSGA106.621 | Number 20. |
Scalpel | VWR | RSGA106.200 | |
Stereotaxic frame | Stoelting Europe | 51500D | |
Mouse ear bars | Stoelting Europe | 51648 | 5 ul |
Syringe with Removable needle | Hamilton Company | 65 |
0,75 inner diameter and 1.5 outer diameter.
|
Glass capilaries | Stoelting | 50811 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Dental drill | Agnthos AB | 1464 | |
Shaver | Agnthos AB | GT420 | |
Isoflurane Chamber and pump | Agnthos AB | 8323101 | 2 mL |
Syringes | Merck | Z118400-30EA | 25G |
Needles | Merck | Z192414 Aldrich | |
Mouse and neonatal rat adaptor for stereotaxic fram | Stoelting | 51625 | |
Heating pad | Braintree scientific, inc | 53800M |
From Covidien 2187.
|
Cotton gauze | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
Rubber tube | Elfa Distrelec | HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150 | |
Cotton swabs | Fisher Scientific | 18-366-473 | |
REAGENTS FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
NaH2PO4-H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
MgCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
CaCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | C8106 | |
MgSO4-7 H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 |
see Ultrapure Water system
|
Ultrapure Water | Prepare 1 or 2M. | ||
KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
K-D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 Sigma | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KOH-EGTA (Etilene glycol-bis-N-tetracetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 Sigma | |
KOH- Hepes acid (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Mg2ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
Na3GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
Picrotoxin | Merck | P1675 Sigma | |
CNQX | Merck | C239 Sigma | |
Ice | |||
EQUIPMENT FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
Borosilicate glass pipette | Sutter Company | B150-86-10 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Vibratome | Leica | Leica VT1000 S | |
WaterBath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
Clampfit software | Molecular Devices | ||
Multiclamp software | Molecular Devices | ||
REAGENTS FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY |
Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin.
|
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Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 |
Use at a concentration of 0.1%.
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Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 |
Donkey.Use at a concentration of 1 : 400.
|
Serum | Merck Millipore | S30-100ML |
Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500.
|
4′,6-Diamidino-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 |
1: 600 in KPBS-T.
|
streptavidin- Cy3 | Thermo Fisher Scientific | 434315 | 1:5000, rabbit. |
Anti-GAD65/67 | Abcam | 1:2000, mouse. | |
Anti-PV | Sigma | P3088 | 1:200, goat. |
Anti-Chat | Merk | AB143 | 1:5000, rabbit. |
Anti-NPY | Immunostar | 22940 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | 1:1000, chicken. |
Anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
Mounting solution | Merck | 10981 |
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading
|
OCT | Agar Scientific | ||
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
Distilled water | |||
Anti-freeze solution | Tissue Pro Technology | AFS05-1000N, 1000 mL/ea. | |
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Confocal microscope | Leica | TCS SP8 laser scanning confocal microscope. | |
Prism | GraphPad | ||
Microtome | Leica | SM2010R |