Detta protokoll syftar till att generera direkt omprogrammeras interneuroner in vivo, med hjälp av en AAV-baserade virus system i hjärnan och en FLEX synapsin-driven GFP reporter, som möjliggör cell identifiering och ytterligare analys in vivo.
Omvandla Resident glia i hjärnan till funktionella och subtypspecifika nervceller in vivo ger ett steg framåt mot utvecklingen av alternativa cell Replacement terapier samtidigt skapa verktyg för att studera cell öde på plats. Hittills har det varit möjligt att få nervceller via in vivo omprogrammering, men den exakta fenotyp av dessa nervceller eller hur de mogna har inte analyserats i detalj. I detta protokoll beskriver vi en effektivare omvandling och cellspecifik identifiering av in vivo omprogrammerade neuroner, med hjälp av ett AAV-baserat virusvektor system. Vi tillhandahåller också ett protokoll för funktionell bedömning av de omprogrammerade cellernas neuronala mognad. Genom att injicera flip-excision (FLEX) vektorer, som innehåller omprogrammering och synapsin-driven reporter gener till specifika celltyper i hjärnan som fungerar som mål för cell omprogrammering. Denna teknik möjliggör enkel identifiering av nyligen omprogrammerade neuroner. Resultaten visar att de erhållna omprogrammeras nervceller funktionellt mogna över tid, ta emot synaptiska kontakter och Visa elektrofysiologiska egenskaper hos olika typer av interneuroner. Med hjälp av transkriptionsfaktorerna Ascl1, Lmx1a och Nurr1 har majoriteten av de omprogrammerade cellerna egenskaper snabb-spiking, parvalbumin-innehållande interneuroner.
Det övergripande målet med denna metod är att effektivt omvandla hjärnans hemvist glia in vivo till funktionella och subtypspecifika nervceller som parvalbumin-uttrycker interneuroner. Detta ger ett steg framåt mot utvecklingen av en alternativ cell substitutionsterapi för hjärnsjukdomar utan behov av en exogen cell källa. Det skapar också ett verktyg för att studera cell omvandling växlar in situ.
Hjärnan har endast en begränsad kapacitet för att generera nya nervceller. Därför, i neurologiska sjukdomar, det finns ett behov av exogena cell källor för hjärn reparation. För detta har olika källor av celler utsatts för intensiv forskning genom åren, inklusive celler från primär vävnad, stamceller-härledda celler och omprogrammerade celler1,2,3. Direkt omprogrammering av inhemska hjärnceller till nervceller är en ny metod som kan ge en attraktiv metod för hjärn reparation som den använder patientens egna celler för att generera nya nervceller inne i hjärnan. Hittills har flera rapporter visat in vivo omprogrammering genom viral vektor leverans i hjärnan4,5,6,78,9 i olika hjärnregioner såsom hjärnbarken, ryggmärgen, striatum och mellanhjärnan5,10,11, samt i intakt och bort hjärna5,8,11,12. Både hämmande och excitatoriska nervceller har erhållits4,8, men den exakta fenotyp eller funktionalitet av dessa celler har ännu inte analyserats i detalj.
I detta protokoll beskriver vi en effektivare omprogrammering och cellspecifik identifiering av in vivo omprogrammerade neuroner. Vi tillhandahåller ett protokoll för funktionell bedömning av neuronala mognad och fenotyp karakterisering baserat på funktionalitet och immunohistokemiska drag.
Vi använde en CRE-inducible AAV vektor och en GFP reporter för att identifiera in vivo omprogrammerade neuroner. Detta val av virala vektorer har fördelen att infektera både dividera och icke-skiljande celler i hjärnan, öka antalet riktade celler, som ett alternativ till användning av retrovirus7,8. En neuron-specifika synapsin-driven FLEX reporter (GFP), gjorde det möjligt för oss att specifikt upptäcka den nyligen genererade nervceller. Tidigare studier har använt subtypspecifika initiativtagare för in vivo omprogrammering7,9, som också tillåter uttrycket av omprogrammering gener och reportrar i specifika celltyper. Emellertid, denna metod kräver ytterligare identifiering av omprogrammerade neuroner genom efter döden analys av co-uttryck av reporter och neuronala markörer. Användningen av en neuron-specifik reporter, såsom den som beskrivs häri, möjliggör en direkt identifiering. Detta ger ett direkt bevis på en lyckad omvandling och tillåter en levande cell identifiering som krävs för patch-Clamp elektrofysiologi.
In vivo direkt omprogrammering kan uppnås med hjälp av AAV FLEX vektorer i CRE-uttrycker mus stammar. Det är viktigt att notera att skillnader mellan mus stammar när det gäller omprogrammering effekt har observerats. För in vivo-omprogrammering i striatum har NG2-CRE-muslinjen visat sig vara mer effektiv jämfört med andra stammar. Innan du börjar använda en ny djur stam, är det viktigt att kontrollera mus leverantörens riktlinjer om CRE uttryck över tiden, som ålder av djur ofta påverkar specificiteten av detta proteinuttryck. I våra studier användes inte djur som var äldre än 12 veckor för in vivo-omprogrammering eftersom det fanns en risk för CRE-uttryck i andra celler än NG2 glia. Konstant närvaro och övervakning av kontrolldjur injiceras endast med Synapsin-FLEX-GFP konstruera rekommenderas. Detta möjliggör övervakning av djuren för GFP-positiva celler som inte bör förekomma om inga omprogrammering gener (ALN) används.
För att identifiera de nyligen omprogrammerade neuronerna är en neuron-specifik identifieringsmetod som den som beskrivs i detta protokoll av yttersta vikt. Detta möjliggör en korrekt identifiering och åtskillnad av omprogrammerade neuroner från endogena omgivande celler som är av särskild relevans när omprogrammering i en homotopiska region.
Det är också viktigt att rikta den korrekta strukturen för viral injektion. Därför är stereotaxic kirurgi för viral injektion viktigt och måste kontaktas med noggrannhet, särskilt när man riktar mindre strukturer i hjärnan.
Vi har tidigare visat11 att det inte är tillförlitligt att förutsäga resultatet av in vivo omprogrammering baserat på in vitro-omprogrammering experiment med samma omprogrammering faktorer. Alla faktorer av intresse måste därför testas in vivo. I våra händer, många olika faktor kombinationer ger samma subtyp av nervceller (dvs, Interneuron11 in vivo) trots att dessa gener har varit inblandade i utvecklingen av andra nervceller.
Hela-cell patch klämma för omprogrammerade nervceller är en känslig teknik och vävnad bearbetning är viktigt för ett bra resultat. Perfusion med iskall Krebs lösning förbättrar vävnads kvaliteten. Också, lappade nervceller måste behandlas noggrant. Även om mognad och fenotypisk identitet omprogrammerade neuroner kan bedömas något med hjälp av hela cell patch Clamp, dessa celler är inte helt jämförbar med deras endogena motsvarigheter. Ytterligare typer av analyser, såsom Genomsekvensering (t. ex. RNA-sekvensering), bör användas för att ytterligare bekräfta omprogrammerad cell identitet.
Den teknik som beskrivs häri kan övervägas för utveckling av framtida terapier där neuronala ersättning behövs i hjärnan. Även om in vivo omprogrammering är fortfarande i ett tidigt skede och översättningen till människor är ännu inte förutses, denna teknik kan ge en metod för att bedöma exogena genfunktion i hjärnan och studera cell mognad in vivo.
The authors have nothing to disclose.
Marcella Birtele har finansierats av Europeiska unionens Horizon 2020-program (Horisont 2020-MSCA-ITN-2015) inom ramen för Marie Skłodowska-Curie innovativa utbildningsnätverk och bidragsavtal nr 676408. Daniella Rylander Ottosson har finansierats av Vetenskapsrådet (2017-01234).
REAGENTS FOR AAV5 CLONING AND VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
pAAV-CA-FLEX | AddGene | 38042 | |
Ascl1 | AddGene | 67291 | NM_008553.4 |
Lmx1a | AddGene | 33013 | NM_0033652.5 |
Nurr1 | AddGene | 35000 | NM_013613.2 |
GFP-syn | AddGene | 30456 | |
LoxP (FLEX) sequence 1 | GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga agaggctctaga |
||
LoxP (FLEX) sequences 2 | tactagtataacttcgtataggatactttatac gaagttatcattgggattcttcctattttgatc caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct caccatcgacccataacttcgtatagcatacat tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC |
||
pDP5 | Plasmid Factory | PF435 | |
pDP6 | Plasmid Factory | PF436 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
FBS (Fetal bovine serum) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)+ Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61965026 | |
DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffer Saline) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
HEK293 cells | Thermo Fisher Scientific | 85120602-1VL | |
Flasks | BD Falcon | 10078780 | 175 cm2 |
Tris H-CL | Sigma Aldrich | 10812846001 |
For TE buffer use 10 mM, pH 8.0; for lysis buffer use 50mM, pH 8.5; for IE buffer use 20 mM, pH 8.0; for elution buffer use 20 mM, pH 8.0
|
EDTA | EDTA: Invitrogen | EDTA: AM9260G |
For TE buffer use 1 mM EDTA
|
Ultrapure water |
see Ultrapure water system
|
||
CaCl2 | SigmaAldrich | C5080 | 2.5 M |
Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 |
FOR HBS use 140 mM; for Lysis Buffer use 150 mM; for IE buffer use 15 mM; for elution buffer use 250 mM
|
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G |
For lysis Buffer: 1 mM
|
Ultracentrifuge sealing tubes | Beckman Coulter | Quick-Seal® Polypropylene Tube | |
OptiPrep™ Density Gradient Medium | Sigma Aldrich | D1556-250ML | |
10-mL syringe-18G needle | BD | 305064 | |
Laboratory glass bottles | VWR | ? | |
Anion exchange filter | PALL laboratory | MSTG25Q6 |
Acrodisc unit with Mustang Q membrane
|
Centrifugal filter unit | Merck | Z740210-24EA |
Amicon Ultra-4 device
|
Endotoxin-Free Plasmid DNA Isolation Kits | Thermo Fisher Scientific | A33073 | |
Na2PO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | 15 mL |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352196 | |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352070 | |
Glass Vials | Novatech | 30209-1232 |
CGGCCTCAGFGAGCGA
|
Forward Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
GGAACCCCTAGTGATGGAGTT
|
||
Reverse Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG
|
||
5´FAM / 3´BHQ1 probe | Jena Bioscience | ||
0.22 mm filter | Merck | SLGV004SL | Millex-GV filter |
EQUIPMENT AAV5 VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
Freezer -20 °C | |||
Freezer -80 °C | |||
Fridge +4 °C | |||
AAV viral room | |||
Ultrapure Water system | Merck | Milli-Q® IQ 7000 | |
Vortex mixer | VWR | 444-0004 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | |
Autoclave | Tuttnauer | 2540 EL | |
Polymerase Chain Reaction (PCR) | BioRad | C1000 Touch Thermal Cycler | |
Quantitative PCR (qPCR) | Roche | LightCycler® 480 System | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST16 | |
Water Bath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
ANIMAL MODEL | |||
NG2-Cre mice | Jackson | NG2-CrexB6129, Stock #008533 | |
REAGENTS FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN | |||
Water | |||
Saline | Apoteket AB | 70% | |
Ethanol | Solveco | ||
Isolfurane | Apoteket AB |
Dilute to 1% solution with warm water.
|
|
Virkon | Viroderm | 7511 | |
Pentobarbital | Apoteket AB | P0500000 |
i.p. for terminal procedure at the dose of 60 mg/ml.
|
Sucrose | Merck | S0389-500G | |
Trypan Blu | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Retrobeads | Lumafluor | R170 | |
Buprenorphine | Apoteket AB | ||
EQUIPMENT FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN |
From RSG Solingen.
|
||
Scissors | VWR | 233-1552 | From Biochem. |
Tweezers | VWR | 232-0007 | |
Forcep | VWR | 232-0120 | |
Scalpel holder | VWR | RSGA106.621 | Number 20. |
Scalpel | VWR | RSGA106.200 | |
Stereotaxic frame | Stoelting Europe | 51500D | |
Mouse ear bars | Stoelting Europe | 51648 | 5 ul |
Syringe with Removable needle | Hamilton Company | 65 |
0,75 inner diameter and 1.5 outer diameter.
|
Glass capilaries | Stoelting | 50811 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Dental drill | Agnthos AB | 1464 | |
Shaver | Agnthos AB | GT420 | |
Isoflurane Chamber and pump | Agnthos AB | 8323101 | 2 mL |
Syringes | Merck | Z118400-30EA | 25G |
Needles | Merck | Z192414 Aldrich | |
Mouse and neonatal rat adaptor for stereotaxic fram | Stoelting | 51625 | |
Heating pad | Braintree scientific, inc | 53800M |
From Covidien 2187.
|
Cotton gauze | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
Rubber tube | Elfa Distrelec | HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150 | |
Cotton swabs | Fisher Scientific | 18-366-473 | |
REAGENTS FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
NaH2PO4-H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
MgCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
CaCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | C8106 | |
MgSO4-7 H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 |
see Ultrapure Water system
|
Ultrapure Water | Prepare 1 or 2M. | ||
KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
K-D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 Sigma | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KOH-EGTA (Etilene glycol-bis-N-tetracetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 Sigma | |
KOH- Hepes acid (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Mg2ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
Na3GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
Picrotoxin | Merck | P1675 Sigma | |
CNQX | Merck | C239 Sigma | |
Ice | |||
EQUIPMENT FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
Borosilicate glass pipette | Sutter Company | B150-86-10 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Vibratome | Leica | Leica VT1000 S | |
WaterBath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
Clampfit software | Molecular Devices | ||
Multiclamp software | Molecular Devices | ||
REAGENTS FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY |
Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin.
|
||
Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 |
Use at a concentration of 0.1%.
|
Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 |
Donkey.Use at a concentration of 1 : 400.
|
Serum | Merck Millipore | S30-100ML |
Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500.
|
4′,6-Diamidino-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 |
1: 600 in KPBS-T.
|
streptavidin- Cy3 | Thermo Fisher Scientific | 434315 | 1:5000, rabbit. |
Anti-GAD65/67 | Abcam | 1:2000, mouse. | |
Anti-PV | Sigma | P3088 | 1:200, goat. |
Anti-Chat | Merk | AB143 | 1:5000, rabbit. |
Anti-NPY | Immunostar | 22940 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | 1:1000, chicken. |
Anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
Mounting solution | Merck | 10981 |
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading
|
OCT | Agar Scientific | ||
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
Distilled water | |||
Anti-freeze solution | Tissue Pro Technology | AFS05-1000N, 1000 mL/ea. | |
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Confocal microscope | Leica | TCS SP8 laser scanning confocal microscope. | |
Prism | GraphPad | ||
Microtome | Leica | SM2010R |