Summary
Ein neuartiges Verfahren der Probenvorbereitung wurde entwickelt, um Platz für Zell- und Coculture um niedermolekulare Exchange über bildgebende Massenspektrometrie zu erkennen.
Abstract
Bildgebende Massenspektrometrie (IMS) routinemäßig auf drei Arten von Proben angewendet wurde: Gewebeschnitte Sphäroide und mikrobiellen Kolonien. Diese Probentypen wurden analysiert mit Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS), um die Verteilung der Proteine, Lipide und Metaboliten in der biologischen Probe von Interesse zu visualisieren. Wir haben eine neue Probe Vorbereitung Methode entwickelt, die kombiniert die Stärken der drei vorhergehenden Anwendungen an ein unentdecktes Ansatz zur Identifizierung von chemischen Kommunikation bei Krebs, durch impfen Säugerzelle Kulturen in Agarose in coculture mit gesundem Gewebe, gefolgt von Austrocknung der Probe. Säugetier-Gewebe und Zellen sind in der Nähe, so dass chemische Kommunikation über Diffusion zwischen dem Gewebe und Zellen cocultured. Zu bestimmten Zeitpunkten wird die Agarose-basierte Probe auf die gleiche Weise wie mikrobiellen Kolonien vorbereitet für IMS-Analyse getrocknet. Unsere Methode wurde entwickelt, um die Kommunikation zwischen hochwertigem serösen Ovarialkarzinom Eileiter abgeleitet, wie es mit dem Eierstock während Metastasen interagiert zu modellieren. Optimierung der Probenvorbereitung führte bei der Identifizierung von Noradrenalin als chemische Schlüsselkomponente in der Eierstöcke Mikroumgebung. Diese neu entwickelte Methode kann auf anderen biologischen Systemen angewendet werden, die ein Verständnis der chemischen Kommunikation zwischen benachbarten Zellen oder Gewebe erfordern.
Introduction
Bildgebende Massenspektrometrie (IMS) wurde optimiert, um die räumliche Verteilung der molekularen Eigenschaften in drei weit verbreitete Anwendungen charakterisieren: Gewebe Scheiben, Sphäroide und mikrobiellen Kolonien1,2,3. Gewebe-Scheiben können verwendet werden, um die Lokalisierung von Metaboliten im Zusammenhang mit der biologischen Bedingungen in einer Vielzahl, entweder gezielt oder ungezielte innerhalb eines bestimmten Bereichs der Masse zu bewerten. Unterschiede zwischen molekularen Funktionen sind jedoch erhebliche und offensichtlich, wenn ein gesundes Gewebe ist im Vergleich zu einer krankhaften Zustand, z. B. ein Tumor. Dieser IMS-Ansatz eignet sich besonders zum Nachweis von Biomarkern Krankheit, jedoch die Identifizierung von Signalen, die für die Einleitung des wichtig sein könnte schließt Erwerb von Gewebeproben in diskrete Phasen im Krankheitsverlauf (z. B. Tumor-Klasse) der Erkrankung. Der Austausch von Informationen durch den Raum ist eine allgegenwärtige Funktion vieler biologischer Systeme und Gewebe Scheiben dieses dynamischen chemischen Relais nicht erfasst werden. Eine Technik, die Visualisierung von chemischen Austausch und Verbreitung kann ist IMS der mikrobiellen Kolonien auf Agarplatten gewachsen; kleine Moleküle sind in der Lage, durch und über die Agar zu verbreiten und über Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung (MALDI-TOF) Massenspektrometrie4erfasst werden können. Dieses Wachstum-Setup kann verwendet werden, um Moleküle ausgetauscht zwischen diskreten biologische Entitäten (Kolonien) zu identifizieren und Direktionalität der Metabolit Produktion bestimmen kann. Die Plattform, die ursprünglich für mikrobielle Koloniewachstum wurde angepasst um den primären Stoffwechsel der Gewebe Explantaten mit Säugerzellen gewachsen zu erkunden, und IMS wurde verwendet, um den dynamischen chemischen Austausch in einem in vitro Säugetier-System zu bewerten.
In den letzten Jahren ist deutlich geworden, dass hochwertige serösen Ovarialkarzinom (HGSOC) oft ihren in den Eileiter Epithel (FTE Ursprung) und dann der Eierstöcke während der frühen Krankheit Entwicklung5,6, metastasiert 7 , 8. tumorigenic FTE Ausbreitung der Eierstöcke, Zellen, wo große Tumoren schließlich bilden und metastasieren weiter, ist derzeit unklar. Die bisherige Forschung konzentriert sich auf die Rolle der ovarielle Proteine in primären Metastasen in den Eierstock; jedoch wurde kürzlich nachgewiesen, dass der Übergang von einer gesunden zu einem tumorigenic Gewebe zu massiven Störungen des Zellstoffwechsels führt und Produktion von kleinen Molekülen9,10,11verändert. Daher vermutet wir, dass kleine Moleküle, die zwischen der FTE und der Eierstock ausgetauscht für primäre Metastasierung von HGSOC mitverantwortlich sein können.
Mit unserer neu entwickelten IMS-Verfahren haben wir festgestellt, dass Coculture tumorigenic FTE und gesunden Eierstockgewebe die Produktion von Noradrenalin aus dem Eierstock induziert. Jedoch andere Zelltypen oder normalen FTE Zellen dieser Effekt nicht entlocken. Ein außerordentlicher Vorteil dieser Methode ist, dass die molekulare Herstellung und Austausch von Signalen, die reale Molekülen darstellen können visualisiert werden, also auch in einem Coculture ist es möglich, die Quelle eines Signals zu bestimmen. Dies ist ein Vorteil gegenüber homogenisierte Proben, wo sind alle räumlichen Informationen verloren gehen. In unserem Modellsystem konnten wir die Produktion von Noradrenalin Eierstock eindeutig zuordnen. Noradrenalin hat Metastasen und Therapie von Eierstockkrebs in Verbindung gebracht worden, und unsere Erkennung dieses Moleküls hat bestätigt, dass die neuartige Methode der IMS biologisch relevanter Moleküle12,13, aufdecken kann 14. diese Validierung kann wir vorschlagen, dass diese neue Anwendung von IMS kann besonders hilfreich sein, Forschungsgruppen, die versuchen, kleine Moleküle in Coculture Umgebungen zu identifizieren und um frühe Ereignisse zu verstehen, die Transformation der Zelle beeinflussen und Metastasierung. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, die Identität und die räumliche Verteilung von kleinen Molekülen während Austausch zwischen Geweben und Organen, vertreten durch in-vitro- 3D Zellkulturen oder ex Vivo Gewebe aufzuklären.
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Protocol
Alle tierische Verfahren wurden im Einklang mit den nationalen Instituten der Gesundheitsrichtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren und von der Ausschuß für institutionelle Animal Use und Pflege (IACUC) an der University of Illinois at Chicago genehmigt.
1. Vorbereitung der Reagenzien
- Pflegen Sie, murine oviductal Epithel (MOE) bei 37° C mit 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator in alpha Minimum wesentliches Medium (αMEM) Medien ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 10 mg/mL Insulin, Transferrin, Selen (ITS) Zellen , 1,8 ng/mL epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), 100 U/mL Penicillin-Streptomycin, 1 mg/mL Gentamycin und 18,2 ng/mL Östradiol-17β. Pass die Zellen alle 3 – 4 Tage, sicherzustellen, dass genügend Zellen gibt es am selben Tag die Mäuse geopfert werden.
- Bereiten Sie 2 % Agarose durch Mischen von 1 g niedrigschmelzende Agarose mit 50 mL destilliertem Wasser. Autoklaven der Agarose, abkühlen lassen und dann aliquoten (1 mL) in 2 mL Röhrchen (siehe Tabelle der Materialien), bevor Agarose erstarrt. Agarose kann bei-20 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden.
- Mindestens 2 mL 1 X Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) Medien vorbereiten.
- Die Matrix für MALDI-TOF MS, Vorbereitung von 5 mg/mL 10 mL 1:1 Alpha-Cyano-4-Hyroxycinnamic Säure (CHCA): Dihydroxybenzoic Acid (DHB) (siehe Tabelle der Materialien) in 90: 10 ACN:H2O + 0,1 % Trifluoroacetic Säure (TFA). Beschallen Sie Lösung bis Matrix aufgelöst ist.
(2) Maus Kolonie und Eierstock entfernen
- Brutpaare von CD-1 Mäusen mit Standardgehäuse Verfahren zu erhalten. In der Nähe der Tag der Entbindung kontrollieren Sie die Mäuse täglich, so dass das Alter der Welpen bekannt ist.
- Welpen im Alter von 16-18 Tagen durch CO2 Inhalation pro NIH Leitlinien einschläfern. Liefern von CO2 (100 %) an einem Fluss Rate von 10 – 20 % Kammervolumen pro Minute und für zwei Minuten nach Atmung aufgehört hatte. Bestätigen Sie Euthanasie durch zervikale Dislokation.
- Desinfizieren Sie alle chirurgische Geräte durch Eintauchen in 70 % igem Ethanol. Leibovitzs L-15 Medien mit 1 X Penicillin-Streptomycin auf 37 ° c warm
- Befeuchten Sie die Abdominal-Oberfläche mit 70 % Ethanol zur Desinfektion der Umgebung und Kontamination mit Haaren zu minimieren. Verständnis über die Bauchdecke mit stumpfen Pinzette und Nutzung Chirurgische Scheren zu einem großen V-Form durch die Haut und Bauchdecke, schneiden Sie die Haut aussetzen der inneren Organe.
- Bewegen Sie die inneren Organe, auf die Seite mit Pinzette. Individuell jedem uterine Horn mit feinen Pinzette greifen und leicht anheben.
- Suchen Sie den Eierstock, die am Ende des uterinen Horns, unmittelbar unterhalb der Niere werden. Verwenden Sie chirurgische Scheren, um der Fruchtknoten frei von Bindegewebe zu zergliedern. Dann schneiden Sie die Eierstöcke Horn in zwei Hälften.
- Verschieben der Eierstöcke, Eileiter und etwa eine Hälfte jedes uterine Horn auf vorgewärmten Leibovitz L-15 Medien.
- Unter dem Mikroskop sezierenden bewegen vorsichtig jeder Eierstock aus den umliegenden Bursa, befreien ihn aus der Eileiter, Bursa und jede Fettgewebe. Verschieben Sie jeder Eierstock an ein neues Gericht Leibovitzs L-15 Medien.
- Geschnitten Sie jeder Eierstock axial in zwei Hälften. Halten Sie die Eierstöcke Stücke (jetzt genannt Explantate) bis Beschichtung von Agarose bei 37 ° C gehalten.
3. einrichten und Inkubation der ITO-behandelten Folie für Kokulturen
-
Ungeteilte Kokulturen
- Verflüssigen Sie die Agarose bei 70 ° C auf einer heißen Platte.
- Legen Sie die 8-Brunnen-Teiler auf Indium Zinndioxid (ITO)-behandelten Folie (Abbildung 1A). Kautschuk unten auf den Teiler hilft bei der Haftung auf der Folie, aber achten Sie darauf, kontinuierliche sanfte Druck während Agarose-Beschichtung, kein Auslaufen oder Vermischung zwischen Brunnen zu gewährleisten gelten.
- Sammeln Sie Zellen in einem 15 mL konische Rohr, Zentrifuge (5 min bei 800 u/min) und Aufschwemmen Sie bis 50k Zellen pro 150 µL in 1 X DMEM Medien. Wenn eine andere Zelle Dichte optimal ist, stellen Sie sicher, dass bei diesem Schritt die Zellsuspension 2 X die endgültige Dichte gewünscht wird (z. B. für eine Endkonzentration von 50.000 Zellen in 300 µL, Zelldichte bei diesem Schritt 50.000 Zellen in 150 µL ist).
- Fügen Sie vor Beschichtung Zellkultur, Eierstöcke Explant zum Zentrum des Brunnens (Abb. 1 b).
- Jede Zellkultur in einzelnen 2 mL Röhrchen kurz vor Beschichtung Agarose hinzufügen. Kombinieren Sie für jedes gut 200 µL Zellsuspension und 200 µL verflüssigte Agarose in einer 2 mL-Tube. Kombinieren Sie z. B. für vier Brunnen, 800 µL Zellsuspension und 800 µL 2 % Agarose. Werden einige Mischung übrig, aber etwas mehr als notwendig Luftblasen beim Pipettieren vermeidet.
- Einzelne Zellkulturen fügen Sie Agarose unmittelbar vor dem Plattieren, Zellkultur hinzu. Die Agarose wird in weniger als einer Minute abkühlen, also bereit sein, schnell Platte.
- Fügen Sie 300 µL der Zelle/Agarose Mischung sofort in jede Vertiefung (Abbildung 1). Abbildung 1 zeigt drei Zelle Bedingungen und einem Medium Zustand, jeweils mit und ohne einem Eierstock überzogen.
- Inkubieren Sie Folie bei 37 ° C und 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator.
-
Geteilte Kokulturen.
- Schneiden Sie Trennwände aus dünnen, glatten Kunststoff (Abbildung 2A).
Hinweis: Dieses Experiment verwendet die Seiten eines sterilen Einweg-Medien-Becken, weil sie flach und dünn sind. Schneiden Sie sie gerade breit genug, um gemütlich in der Hypotenuse des Brunnens (~ 13 mm) passen. - Verflüssigen Sie die Agarose bei 70 ° C auf einer heißen Platte.
- Legen Sie die 8-Brunnen-Teiler auf die ITO-behandelten Folie (Abb. 2 b). Kautschuk unten auf den Teiler hilft bei der Haftung auf der Folie, aber achten Sie darauf, kontinuierliche sanfte Druck während Agarose-Beschichtung, kein Auslaufen oder Vermischung zwischen Brunnen zu gewährleisten gelten.
- Sammeln Sie Zellen in einem 15 mL konische Rohr, Zentrifuge (5 min bei 800 u/min) und Aufschwemmen Sie bis 50k Zellen pro 150 µL in 1 X DMEM Medien. Wenn eine andere Zelle Dichte optimal ist, ist darauf zu achten, dass bei diesem Schritt die Zellsuspension 2 x die endgültige Dichte erwünscht ist (z.B. für eine Endkonzentration von 50.000 Zellen in 300 µL Zelldichte bei diesem Schritt ist 50.000 Zellen in 150 µL).
- Legen Sie Kunststoff Teiler diagonal in Brunnen (Abbildung 2).
- Jede Zellsuspension einer Agarose zu einem Zeitpunkt kurz vor Beschichtung hinzufügen. Kombinieren Sie für jedes gut 100 µL Zellsuspension und 100 µL der verflüssigte Agarose in einer 2 mL-Tube. Kombinieren Sie z. B. für vier Brunnen, 400 µL der Zellkultur und 400 µL 2 % Agarose. Etwas mehr als notwendig Luftblasen beim Pipettieren vermeidet aber werden einige Zellen/Agarose-Mischung übrig.
- Einzelne Zellkulturen fügen Sie Agarose unmittelbar vor dem Plattieren, Zellkultur hinzu. Die Agarose wird in weniger als einer Minute abkühlen, also bereit sein, schnell Platte.
- Auf der einen Seite des Teilers, Platte 150 µL Zelle/Agarose-Mischung. Agarose abkühlen und erstarren (ca. 1 min) und entfernen dann den Teiler (Abb. 2D) zu ermöglichen.
- Legen Sie Eierstock Explant in die Mitte der leeren Hälfte des Brunnens. Platz 150 µL Medien/Agarose-Mischung über Spitze des Eierstocks und nur in der richtigen Seite des Brunnens (Abb. 2E).
- Inkubieren Sie Folie bei 37 ° C und 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator.
- Schneiden Sie Trennwände aus dünnen, glatten Kunststoff (Abbildung 2A).
4. trocknen die Folie und die Vorbereitung für MALDI-TOF MS
- Nach vier Tagen (oder jedem gewünschten Zeitpunkt), entfernen Sie die Kammer-Teiler aus Agarose-Stecker und die Folie (Abbildung 1). Lösen Sie die Seiten der Agarose aus der Kammer mit einem flachen Spatel sanft zu und ziehen Sie vorsichtig die Kammer nach oben, wobei Sie darauf achten, nicht zu bewegen, Agarose-Stecker. Wenn sie sich bewegen, positionieren Sie sie sanft, so dass sie einander nicht berühren.
- Legen Sie die Folie in einem 37 ° C Backofen für ca. 4 h, Drehen 90° jeder h.
Hinweis: Die Rotation der Folie ist wichtig, gleichmäßige Wärmeverteilung im gesamten Beispiel zu gewährleisten. - Nach dem Trocknen, entfernen Sie die Folie aus dem Ofen (Abbildung 1E).
- Wenden Sie Matrixlösung mit der Sprayer (Abb. 1F), mit den folgenden Parametern: Temperatur = 30 ° C, Volumenstrom = 0,2 mL/min, Anzahl der Durchgänge = 8, Richtung = CC und Düsenabstand = 40 mm.
Hinweis: Anstelle einer Matrix-Sprayer eine künstlerische Airbrush lässt sich flüssige Matrix gelten. Die gleiche Matrixlösung verwendet werden, zu sprühen, aber etwa doppelt soviel Lösung erforderlich ist. Mit dem Schlitten eingespannt, so dass es senkrecht hängt, sprühen Sie die Folie aus einem 90° Winkel von ungefähr einem Fuß entfernt (Adapted von Hoffmann15) bis die Matrix Schicht ist sichtbar. - Fügen Sie 1 µL Kalibrator (Phosphor rot für Ziele < 500 Da, ein Peptid-Mischung (siehe Tabelle der Materialien) für Ziele < 5.000 Da) auf Folie klar auszumachen. Phosphor rot erfordert keine Vermischung mit Matrix, aber die Peptid-Mischung 1:1 Mischung mit Matrix zur Ionisation zu unterstützen. Kalibrator trocknen warten.
- Zeichnen Sie ein X mit einem permanent-Marker in jeder Ecke der Folie und nehmen ein optisches Bild mit einer Kamera oder einem Scanner mit 1.200 dpi.
5. bildgebende Massenspektrometrie Datenerfassung
- Öffnen Sie eine neue Sequenz auf der IMS-Daten-Analyse-Software (siehe Tabelle der Materialien). Legen Sie die Raster Breite auf gewünschte räumliche Auflösung, mindestens 50 µm.
- Laden Sie das optische Bild der Folie auf die Analyse-Software und Set drei Lehren Punkte mit den Schnittpunkten in der x in jeder Ecke gezeichnet.
- Benennen Sie Regionen von Interesse für die Bildgebung in der Datenerfassungs-Software zu und benennen Sie diese entsprechend.
- Kalibrieren Sie das Gerät mit der Datenerfassungs-Software (siehe Tabelle der Materialien) innerhalb von 5 ppm Fehler.
- Speichern Sie die Methode optimierte und beginnen Sie Lauf. Dieses Experiment optimiert die folgenden Parameter: Polarität = positiv, Detektor = Reflektron, Laser-Größe = 2, Laserleistung = 50 %, Reflektor-Modus Detektor Gewinn = 3 X.
6. Verarbeitung IMS-Daten
- .Mis Importdatei in Statistiksoftware (siehe Tabelle der Materialien) für die Analyse von Bedeutung.
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Representative Results
Eine optimal getrocknete ITO Folie führt in einer flachen trockenen Probe mit minimale bis keine Falten auf der Oberfläche der Agarose und Agarose-Stücke, die räumliche auf der Folie (Abbildung 3 Trennung). Abbildung 3A zeigt optimale Trocknung, während Abbildung 3 b zeigt die Falten, die vermieden werden sollten. Diese Optimierung erfordert sorgfältige Überwachung der Folie in den Ofen, da die genauen Zeiten variieren basierend auf der relativen Luftfeuchtigkeit. Während Falten leicht die Höhe beeinflussen können, und daher die Massengenauigkeit des IMS signalisiert, werden leichte Falten nicht Auswirkungen auf die Qualität der Daten. Daher kann Agarose, die letztlich leichte Falten hat noch über MALDI-TOF MS analysiert werden. Die Folie muss komplett getrocknet werden oder dies könnte zu einer Explosion der Probe in die hohen Vakuumumgebung von MALDI-TOF Massenspektrometer.
Andere Substrate abgesehen von Agarose können funktionieren, aber oft nicht behalten ihre strukturelle Integrität bei der Trocknung oder Entfernung von gut Kammer, die führt zu verbreiten über die ITO Folie und Verlust von räumlichen Informationen. Zum Beispiel Kollagen als Substrat haben wir bereits getestet und dies führte bei der Verbreitung und Verlust der räumlichen Informationen als gut Kammer war entfernt (Daten nicht gezeigt). Das Gewebe verwendet sollte in der Mitte des Brunnens ist ungeteilt oder in der Mitte des Dreiecks die Hälfte wenn es geteilt wird, so dass Erwerb von IMS-Daten nicht mit Randeffekte kontaminiert ist. Abbildung 4 zeigt Beispiele für optimal gelegen Gewebe (zentrale A) und schlecht positionierte Gewebe (Gruppe B). In Abbildung 4 b, das Gewebe befindet sich am Rande der Agarose, wenn abgebildet, dazu führen Masse Fehlsignale von Kanteneffekte und erlaubt nicht Benutzern, Bild der Agarose umliegendes Gewebe, das heißt, die Signale abgesondert verpasst während der Analyse. Gewebe sollte möglichst in der Mitte wie möglich, wie in Abbildung 4Azeigt.
Eine Reihe von Experimenten festgestellt, dass eine 8-Well-Kammer das beste Schiff für die Inkubation, im Vergleich zu einem 6-Well-Platte und einer 24-Well-Platte, da minimale Störungen an den Zellen, die 8-Well-Kammer ergibt sich aufgrund die größeren Kammern erforderlich Agarose Platten eine ITO oder Edelstahl Folie nach Inkubation16übertragen werden. 8-Brunnen-Kammern von mehreren Marken von Kammer-Folien eingesetzt werden, aber mit eine selbstklebende Gummi-unten und parallele Seiten der Brunnen erleichtern einfache Einführung und Entfernung von Kunststoff Raumteiler für die geteilten Brunnen. Die 6-Well-Platte benötigt viel mehr Material und Schwierigkeiten mit dem Trocknen so großen Flächen. Die 24-Well-Kammer hatte auch Probleme bei der Trocknung, weil der Meniskus-Effekt zeigt sich in den Vertiefungen war und daher die Stecker mit deutlich höheren Kanten getrocknet. Die 8-Well-Kammer führt nicht in den Meniskus-Effekt, wenn die Agarose direkt in der Mitte des Brunnens plattiert ist und Agarose Stecker müssen nicht übertragen werden. Darüber hinaus ermöglicht die 8-Well-Kammer 8 Bedingungen getestet oder in einem einzigen Experiment für gesteuert werden. Je nach dem Experiment kann es wichtige Steuerelemente, z. B. (1) Brunnen ohne Eierstöcke Explantaten oder Zellen, (2) Brunnen mit nur Zellen oder (3) Brunnen mit Eierstockkrebs Explantaten nur enthalten sein. Weil die Probenvorbereitung (genaue Konzentration der Medien und Agarose, Matrix Betrag usw.) leicht zwischen den Läufen unterscheidet, sollten Bedingungen verglichen werden, wenn sie auf derselben Folie erworben werden.
Weitere Experimente festgestellt, dass eine ITO-beschichtete Folie die beste Plattform für die Inkubation eine Stahlplatte MALDI gegenüber, weil die Folie ermöglicht eine visuelle Überprüfung der Zelle Landes- und Positionierung. Anhand der ITO-Folie, können wir zum Beispiel überprüfen, die Zellen müssen normale Morphologie und homogene Verteilung im gesamten Agarose vor und folgenden Austrocknung16zu erhalten. Die Folie ermöglicht auch für den Einbau von fluoreszierenden Zelllinien, nach Bedarf. Darüber hinaus ist Entfernung der Kammer vor Austrocknung erforderlich, um die Gesamtheit der Agarose-Stecker zu erhalten. Wenn die Folie mit ausgetrocknet ist die 8-Well-Kammer eingehalten, der Kunststoff zieht den Agarose-Stecker auseinander und führt zu großen Rissen in den Steckern. Abbildung 5 zeigt die Probleme, wenn die Kammer nicht vor dem Trocknen entfernt wird.
Beim Zellpopulationen zu analysieren, ist es wichtig, dass die räumliche Auflösung mindestens 50 µm zu beginnen, die geringe Größe der Gewebe und zellulären Interaktionen zu erfassen. Mit gespritzten Matrix es ist möglich, 5 µm Auflösung zu erreichen, aber dies verlängert sich die Gesamtzeit für die Massenspektrometrie Daten zu sammeln, während vergleichbare Ergebnisse zu erzielen. Räumliche Auflösung ist auch abhängig von der Fähigkeit, sich den Laser in der MALDI-TOF Massenspektrometer zu konzentrieren.
Alles in allem haben wir dieser Folie Setup, um am besten erkennen ausgetauschten kleine Moleküle in Coculture optimiert. Bei der Datenanalyse suchen wir daher molekulare Eigenschaften, die nur vorhanden oder sind deutlich häufiger in eine Agarose-Stecker, der den biologischen Zustand des Interesse darstellt. Da gibt es die Möglichkeit, sieben weitere Kontrollen und Auflagen auf der Folie einzufügen, kann dies visuell und mit Hilfe statistischer Software für IMS-Daten erreicht werden. Unsere Dereplication-Prozess nach der Aufdeckung von räumlich relevanten Massen ist umfangreich, so dass wir eine Masse und Fragmentierung Feindaten orthogonal erhalten können. Der erste Schritt, den wir für Dereplication zu nehmen ist eine Suche von der nominalen Masse durch eine Datenbank, z. B. menschliche Metabolom Datenbank (Morbiditätsmuster) für Säugetier-Metaboliten. Die meisten der Moleküle in der Datenbank haben eine beträchtliche Anzahl von Spektren für viele Techniken für den Vergleich mit experimentellen Daten. Sobald nominalen Massen potenzielle Kandidaten Molekülen als ihre vermeintliche Identität haben, ist es oft möglich, physikalische Daten wie z. B. MS/MS-Fragmentierung, UV Profil und Verweilzeit zwischen Kandidat und einen Standard zu vergleichen.
Identifizierung von Noradrenalin im Coculture tumorigenic FTE Zellen inkubiert mit Eierstockgewebe hat beispielsweise überprüft, dass diese IMS Methode Erkennung von relevanten kleine Moleküle aus diesem System16. Abbildung 6 zeigt die Empfindlichkeit der IMS läuft, zeigt die Art der Daten, die man erwarten kann, folgt das Protokoll für ungeteilte Kammern. Abbildung 7 zeigt auch repräsentative Daten für den geteilten Kammer-Setup.
Abbildung 1: Workflow für die Probenvorbereitung von ungeteilten Coculture. (A) befolgen 8-Brunnen Kammer auf leitfähigen ITO-beschichtete Folie. (B) Ort halbiert Eierstöcke in Mitte der Brunnen für Coculture Bedingungen. (C) fügen Sie 300 µL Agarose/Zellsuspension direkt in Brunnen. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind und dass der Fruchtknoten in der Mitte des Brunnens bleibt. Verwenden Sie pipetted Agarose Eierstock gestört, sanft Pipettieren Tipp, um ihn zu zentrieren, bevor die Agarose kühlt. (D) nach vier Tagen Inkubationszeit (oder anderweitig optimiert Zeit) 8-Well-Kammer von Folie zu entfernen. Wenn Sie Agarose Kammer verbunden bleibt, sanft lösen Sie Agarose Stecker aus Kammer mit einem Spatel und positionieren Sie es auf der Folie. Die Agarose haften nicht an der Folie, so wird es leicht zu bewegen. Ein "X" an jeder Ecke der Folie zu zeichnen und fotografieren. (E) trocknen die Folie in einem 37 ° C Backofen für 4 h, rotierenden 90 ° pro Stunde. Agarose sollte vollständig ausgetrocknet und sollte flach auf der Folie liegen. (F) anwenden Matrix Wahl über einen Sprayer oder Airbrush zu schieben. Matrixschicht sichtbar sein soll als gelb. Scannen Sie die Folie auf einem Scanner mit 1.200 dpi und fügen Sie Kalibrierstandards oder Standards für die MALDI-TOF MS-Analyse. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Workflow für die Probenvorbereitung von geteilten Coculture. (A) Schnitt Registerkarten aus Medien Becken (~ 13 mm) und sorgen dafür, dass Seiten gestreckt sind. (B) anhängen 8-Brunnen Kammer auf leitfähigen ITO-beschichtete Folie. (C) legen Sie Teiler diagonal in Brunnen. (D) hinzufügen 150 µL Zellkultur in Agarose auf der einen Seite des Teilers, Agarose abkühlen lassen und Teiler zu entfernen. (E) Add Eierstock in Mitte des leeren Hälfte gut und Deckel mit 150 µL der Medien und Agarose Suspension. Diese Zahl reproduziert mit freundlicher Genehmigung von Zink Et Al. 201816. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Falten in Agarose Stecker. Falten können sich in die Agarose-Stecker bilden, wenn die Folie in den Ofen zu lang gelassen wird. Dies wird die Probe aus MALDI-TOF MS-Analyse nicht entgegen, sondern beeinträchtigen die Qualität der Daten. (A) Bild einer optimal getrocknete Folie. All die Agarose rund um das Eierstockgewebe ist völlig flach und frei von Falten, bietet reichlich Raum für IMS-Analyse. (B) Bild einer schlecht getrocknete Folie mit faltigen Agarose im gesamten Beispiel. Diese Zahl reproduziert mit freundlicher Genehmigung von Zink Et Al. 201816. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Positionierung der Gewebe. Position des Gewebes in getrockneten Probe ist sehr wichtig für die Datenerfassung. (A) getrocknete Agarose Stecker geteilte Kammern zeigen die Fruchtknoten in der Mitte einer Hälfte des Brunnens, das optimal für die Bildgebung. (B) getrocknet Agarose Stecker der geteilten Kammer wo Eierstock sich nicht für die Inkubation oder trocknen konzentrierte. Das Eierstockgewebe auf den Umfang der Agarose Stecker getrocknet und daher nicht analysieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Trocknung Folien mit dem Chamber. Wenn die Folie in den Ofen vor dem Entfernen der Kammer festgelegt ist, die Agarose-Stecker halten stärker auf den Kunststoff als sich selbst und beginnen, in der Hitze auseinander ziehen. Dies führt zu schweren Risse in der Agarose und wenig Haftung auf der Folie selbst. Diese große Risse sind nicht förderlich für IMS-Analyse. Oben: Schieben Sie nach 2 h Austrocknung mit 8-Well-Kammer eingehalten. Alle Agarose-Stecker nur zwei Risse durch die Mitte durch Adhäsion an die 8-Well-Kammer. Unten: Nach Entfernung des 8-Well-Kammer schieben. Nur ein Agarose Stecker blieb auf der Folie. Diese Zahl reproduziert mit freundlicher Genehmigung von Zink Et Al. 201816. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: eindeutige Signale erkennen. Beim Vergleich von 8 Bedingungen ist es möglich, Signale zu erkennen, die für eine einzelne Bedingung eindeutig sind. (A) die getrocknete Folienbild wird verwendet, um die MALDI-TOF Massenspektrometer Lehren, welche Regionen zum Bild. Hier haben wir kleine Regionen rund um den Ovargewebe für IMS bei 50 µm. (B) A repräsentative Image eines m/Z -Signals ausgewählt hochreguliert in einem Zustand im Vergleich zu acht auf derselben Folie. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: repräsentative Daten aus geteilten Kammer Setup. Eierstockgewebe wird weiß umrandet. M/Z 112 wird von der Hälfte der gut mit den Eierstöcken abgesondert. IMS wurde auf 50 µm durchgeführt. Diese Zahl reproduziert mit freundlicher Genehmigung von Zink Et Al. 201816. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Es gibt eine wachsende Zahl von beweisen, die Noradrenalin Rolle HGSOC12,17,18impliziert, und diese Technik hat mehr mechanistischen Informationen beigetragen. Mit mindestens acht biologischen Bedingungen auf derselben Folie vorhanden kann die Methode biologische Kontrollen entfallen, wie gen sowie Zelle Spezifität und Medienkontrolle in einem einzigen IMS laufen. Während die Methode optimiert wurde zur Bewertung ausgetauscht kleine Moleküle in einem Modell der primären Metastasen in HGSOC, jede Zelle oder Gewebetyp, die in Agarose platziert werden können ersetzt werden kann, um eine Vielzahl von biologischen Fragestellungen und Krankheitszustände zu analysieren.
Einer der wichtigsten Schritte im Protokoll stellt sicher, dass die Gewebe oder Zellen-Typen in unmittelbarer Nähe zueinander sind und sind in der Mitte des Steckers Agarose. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Optimierung der Trocknungszeit für die gesamte Folie. Diese Methode wurde mit Eierstockgewebe, die leicht getrocknet und deren geringe Größe führte zu wenig trocknen Komplikationen optimiert. Jedoch andere Gewebe mit unterschiedlicher Zusammensetzung wie Fett, haben sehr unterschiedliche Trocknung Profile und erfordern daher weitergehenden Austrocknung Optimierung. Nach Trocknung der biologischen Probe optimiert wurde, sollten die restlichen Workflow nur minimale Veränderung erfordern.
Während Masse spektralen Erwerb ist es wahrscheinlich, dass viele Projekte die Analyse der zusammengesetzten Gruppen als kleine Moleküle erfordert. Die IMS-Parameter für den Erwerb und die Auswahl der Matrix, sollte daher zum Generieren der besten Daten für das jeweilige Ziel angepasst werden, wenn es bekannt ist. Darüber hinaus haben wir nur die Datenerfassung im positiven Modus mit einer 50: 50-CHCA:DHB-Matrix durchgeführt aber negativ Modus Experimente können es vorziehen, eine andere Art von Matrix und größere Moleküle würde in eine andere Matrix sowie leichter erkannt werden. Die Methode kann mit einer breiten Masse Reihe in eine ungezielte Ansatz oder mit einem schmaleren Massenbereich für eine gezielte Suche verwendet werden. Im Fall der oben besprochenen Methode wurden kleine Moleküle zum Ziel von Interesse, weil im Mittelpunkt stand die Moleküle zu erkennen, die durch die Agarose zwischen Zelle und Gewebe Vertreter ausgetauscht wurden. Obwohl wir nicht, die Einschränkungen in Bezug auf Größe und Struktur, die Bewegung durch Agarose hemmen behaupten, war unser Ziel, kleine Moleküle zu erkennen, so dass unsere Matrix Entscheidung und MALDI-TOF MS Parameter für dieses Ziel optimiert wurden. Zukünftige Experimente werden entwickelt, um gezielt Lipide und Proteine, die in unserer ursprünglichen Erwerbsmethode vielleicht verpasst habt.
Neben der Begrenzung der Verbindungsklasse Erkennung erfordert diese Methode auch, dass die Zellen mit Agarose kompatibel sein und die Gewebeprobe (wenn verwendet) an in einer acht-Well-Kammer angepasst werden. Bestimmte Gewebe können zu größeren Brunnen angepasst werden, wenn weniger biologische Bedingungen erforderlich für den Vergleich sind, aber es entscheidend ist, dass das ausgewählte Gewebe auf eine einheitliche Höhe von weniger als 100 bis 200 µm nach Austrocknung4trocknen kann. Mehreren biologische Proben konnten z. B. mehr als eine Zelle in der Kommunikation mit einem Taschentuch ausgewertet werden. Da die Probenvorbereitung Agarose-basierte Zellkulturen räumlich trennen kann, ist es möglich, weisen visualisiert m/Z 's, um die Zelle Kultur Quelle anhand von beobachteten Verbreitung Muster.
Mit IMS Gewebeschnitte aus humanen Proben oder transgenen Mausmodellen zu studieren, rekapituliert die Komplexität der Gewebe. Humanen Proben sind jedoch schwer zu bekommen, die können drastisch einschränken, der Fähigkeit, Dinge wie Fortschreiten der Krankheit zu studieren. Gewebe aus transgenen Mausmodellen kann zu definierten Zeitpunkten erfasst werden. Aber, Maus-Modellen können zeitaufwendig und teuer zu entwickeln. Darüber hinaus machen die volle Komplexität der realen Gewebe in die beiden Modelle es schwierig, präzise Kommunikation zwischen bestimmten Zellen oder Gewebe zu bewerten. Im Gegensatz dazu ist die hier vorgestellte Methode eine sehr anpassungsfähig. Verschiedenen Geweben oder Zell-Linien können auf derselben Folie, Unterschiede in der Kommunikation zu untersuchen cocultured. Beispielsweise können auf derselben Folie, Unterschiede durch Transformation zu verstehen normale Zellen oder Tumorzellen aus dem gleichen Gewebe kultiviert werden. Zeitstudien Kurs können neuartige Signalisierung Kaskaden zwischen Zellen aufzudecken, oder niedermolekularer Hemmer und/oder RNAi konnten übernommen werden, um die Rolle der bestimmte Signalmoleküle oder Metaboliten untersuchen. Wir glauben, dass diese Möglichkeiten werden diese Technik für Zell-Zell-Kommunikation in einer Vielzahl von Kontexten Lernen nutzbar zu machen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben
Acknowledgments
Von der Chicago biomedizinische Konsortium mit Unterstützung wurde der Searle-Fonds auf der Chicago Community Trust (C-076) (L.M.S); finanziert University of Illinois at Chicago Startup finanziert (L.M.S); Grant 543296 von Eierstockkrebs Research Fund Alliance (M.D.); und UG3 ES029073 (Jeb) und des nationalen Zentrums für die Förderung translationale Wissenschaften, Nationales Institut für Gesundheit, durch Grant UL1TR002003 (JEB & LMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | To collect cells |
| 8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent for sprayed matrix |
| Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Cell culture media |
| Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | For IMS data analysis | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | To collect cells and remove supernatant |
| CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix sprayed onto dried slide |
| DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix sprayed onto dried slide |
| Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | For removal of the ovaries |
| Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | For removal of the ovaries |
| DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media mixed with agarose |
| epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Cell culture media supplement |
| Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | For agarose aliquots |
| Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Cell culture media supplement |
| Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Cell culture media supplement |
| FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS data acquisition software | |
| FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data analysis software | |
| Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | For removal of the ovaries |
| Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Cell culture media supplement |
| Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Cell culture media supplement |
| ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform for co-culture incubation |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media used during tissue dissection |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Cell culture media supplement |
| Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mixed with media for plating |
| Media basin | Corning | 4870 | Used to cut plastic dividers for divided chambers |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture media supplement |
| Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant for medium mass range |
| Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant for low mass range |
| SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistical analysis | |
| Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | For removal of the ovaries |
| TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Added to matrix solution |
| TM Sprayer | HTX Technologies | For applying matrix |
References
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