En ny metode for eksempel forberedelse ble utviklet for å imøtekomme celler og vev coculture for å oppdage små molekyl utveksling ved hjelp av tenkelig massespektrometri.
Imaging massespektrometri (IMS) rutinemessig brukes på tre typer eksempler: vev inndelinger, spheroids og mikrobiell kolonier. Slike eksempler er analysert bruker matrix-assistert laser desorpsjon/ionisering tid-av-flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) for å visualisere fordelingen av proteiner og lipider metabolitter over biologiske utvalget av interesse. Vi har utviklet en roman eksempel forberedelse metode som kombinerer styrken i de tre forrige programmene å ta en underexplored tilnærming for å identifisere kjemisk kommunikasjon i Krepsen, av seeding pattedyr cellekulturer i agarose i coculture med friske vevet etterfulgt av uttørking av prøven. Pattedyr vev og celler er cocultured i nærheten av La kjemisk kommunikasjon via spredning mellom vev og celler. På bestemte tidspunkt tørket agarose-baserte prøven på samme måte som mikrobiell kolonier forberedte IMS analyse. Vår metode ble utviklet for å modellere kommunikasjonen mellom høy klasse serous eggstokkreft avledet fra egglederen som den kommuniserer med eggstokken under metastasering. Optimalisering av eksempel utarbeidelsen resulterte i identifikasjon av noradrenalin som en kjemisk nøkkelkomponent i eggstokkreft microenvironment. Denne nyutviklet metoden kan brukes til andre biologiske systemer som krever en forståelse av kjemisk kommunikasjon mellom tilstøtende celler og vev.
Imaging massespektrometri (IMS) er blitt optimert for å karakterisere den romlige fordelingen av molekylære funksjoner i tre brukte programmer: vev skiver, spheroids og mikrobiell kolonier1,2,3. Vev skiver kan brukes til å evaluere lokaliseringen av metabolitter i forbindelse med biologiske forhold i en vert, enten mål eller uønskede innenfor et bestemt masse. Men er molekylær funksjonsforskjellene den mest betydelige og åpenbare sammenlignet med et sunt vev er syke betingelse, for eksempel en svulst. Denne IMS er spesielt tilpasset påvisning av sykdom biomarkers, imidlertid anskaffe vevsprøver på separate stadier i sykdomsprogresjon (for eksempel svulst karakterer) utelukker identifikasjon av signaler som kan være viktig for initiering av den sykdom. Utveksling av informasjon gjennom rommet er en allestedsnærværende funksjon i mange biologiske systemer, og vev skiver ta ikke dette dynamiske kjemiske relé. En teknikk som kan visualisere kjemiske utveksling og diffusjon er IMS mikrobiell kolonier dyrket på agar platene. små molekyler kan diffus gjennom og over agar og kan hentes via matrix-assistert laser desorpsjon/ionisering (MALDI-TOF) massespektrometri4. Denne veksten oppsett kan brukes til å identifisere molekyler utveksles mellom atskilte biologiske enheter (kolonier) og kan også bestemme retningen for metabolitten produksjon. Plattformen er konstruert for mikrobiell kolonien vekst var tilpasset utforske primære metabolismen av vev explants vokst med pattedyrceller, og IMS ble brukt til å evaluere dynamisk kjemiske utveksling i et i vitro pattedyr system.
I de siste årene, har det blitt klart at høy klasse serous eggstokkreft (HGSOC) ofte kommer i egglederen epitel (FTE) og deretter metastasizes til eggstokken under tidlig sykdom utvikling5,6, 7 , 8. det at tumorigenic FTE celler spredning til eggstokkene, hvor store svulster til slutt danne og metastase ytterligere, er foreløpig uklart. Tidligere forskning har fokusert på rollen ovarian proteiner i primære metastasering til eggstokken; men har det nylig blitt demonstrert at overgangen fra en sunn til en tumorigenic vev resulterer i svær forstyrrelsen av cellenes stoffskifte og endrer produksjon av små molekyler9,10,11. Derfor hypotese vi at små molekyler utveksles mellom FTE og eggstokken kan være ansvarlig for primære metastasering av HGSOC.
Bruker vår nylig utviklede IMS prosedyre, har vi bestemt at coculture tumorigenic FTE og sunn ovarian vev induserer produksjon av noradrenalin fra eggstokken. Men andre celletyper eller normale FTE celler ikke framprovosere denne effekten. En ekstraordinær fordelen med denne metoden er at molekylær produksjon og utveksling av signaler som representerer virkelige molekyler kan visualiseres, så selv i en coculture er det mulig å finne kilden til et signal. Dette er en fordel over analyse av homogenisert prøver, hvor alle romlig informasjon er tapt. I vår modellsystem kunne vi tydelig tilordnes produksjon av noradrenalin eggstokken. Noradrenalin har vært knyttet til metastasering og chemoresistance av ovarian kreft og vår påvisning av dette molekylet har validert at metoden for romanen IMS kan avdekke biologisk relevante molekyler12,13, 14. denne valideringen lar oss foreslår at denne ny søknad av IMS kan være spesielt nyttig å forskningsgrupper prøver å identifisere små molekyler i coculture miljøer og forstå tidlige hendelser som påvirker celle transformasjon og metastasering. Det overordnede målet med denne metoden er å belyse identitet og romlige fordelingen av små molekyler under utvekslingen mellom vev og organer, representert i vitro 3D cellekulturer eller ex vivo vev.
Det er en voksende mengde bevis implicates noradrenalins rolle i HGSOC12,17,18, og denne teknikken har bidratt mer mekanistisk informasjon. Med minst åtte biologiske forhold finnes i samme lysbilde, kan metoden konto for biologiske kontroller som gene og celle spesifisitet samt media kontrollene i en enkelt IMS kjøre. Mens metoden var optimalisert for å evaluere utvekslet små molekyler i en modell av primære metastasering i…
The authors have nothing to disclose.
Midler ble gitt av Chicago biomedisinsk Consortium med støtte fra Searle midlene på The Chicago samfunnet Trust (C-076) (L.M.S.); University of Illinois at Chicago oppstart midler (L.M.S.); Gi 543296 fra Ovarian Cancer Research Fund Alliansen (MD); og UG3 ES029073 (J.E.B.) og National Center for fremme translasjonsforskning Sciences, National Institute of Health, gjennom stipend UL1TR002003 (JEB & LMS).
15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | To collect cells |
8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent for sprayed matrix |
Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Cell culture media |
Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | For IMS data analysis | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | To collect cells and remove supernatant |
CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix sprayed onto dried slide |
DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix sprayed onto dried slide |
Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | For removal of the ovaries |
Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | For removal of the ovaries |
DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media mixed with agarose |
epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Cell culture media supplement |
Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | For agarose aliquots |
Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Cell culture media supplement |
Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Cell culture media supplement |
FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS data acquisition software | |
FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data analysis software | |
Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | For removal of the ovaries |
Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Cell culture media supplement |
Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Cell culture media supplement |
ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform for co-culture incubation |
Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media used during tissue dissection |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Cell culture media supplement |
Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mixed with media for plating |
Media basin | Corning | 4870 | Used to cut plastic dividers for divided chambers |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture media supplement |
Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant for medium mass range |
Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant for low mass range |
SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistical analysis | |
Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | For removal of the ovaries |
TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Added to matrix solution |
TM Sprayer | HTX Technologies | For applying matrix |