Summary
Un nuovo metodo di preparazione del campione è stato sviluppato per ospitare coculture delle cellule e del tessuto per rilevare cambio piccola molecola usando la spettrometria totale imaging.
Abstract
Spettrometria di massa (IMS) di imaging ordinariamente è stato applicato a tre tipi di campioni: sezioni di tessuto, sferoidi e le colonie microbiche. Questi tipi di campioni sono stati analizzati mediante spettrometria di massa tempo-di-volo del desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI-TOF MS) per visualizzare la distribuzione di proteine, lipidi e metaboliti attraverso il campione biologico di interesse. Abbiamo sviluppato un metodo di preparazione del campione romanzo che unisce i punti di forza delle tre applicazioni precedenti per affrontare un approccio underexplored per l'identificazione di comunicazione chimica nel cancro, tramite la semina di colture di cellule di mammifero in agarosio in coculture con tessuti sani seguiti da essiccazione del campione. Cellule e tessuti di mammiferi sono cocultured nelle immediate vicinanze permettendo la comunicazione chimica tramite diffusione tra i tessuti e le cellule. Intervalli di tempo specifici, il campione basato su agarosio è asciugato nello stesso modo come colonie microbiche preparato per l'analisi IMS. Il nostro metodo è stato sviluppato per la comunicazione tra cancro ovarico sieroso di alta qualità derivata dal tubo fallopian come interagisce con l'ovaia durante metastasi di modello. Ottimizzazione della preparazione del campione ha portato alla identificazione di noradrenalina come componente chimico chiave nel microambiente ovarico. Questo metodo di recente sviluppato può essere applicato ad altri sistemi biologici che richiedono una comprensione della comunicazione chimica tra celle adiacenti o tessuti.
Introduction
Spettrometria di massa (IMS) di imaging è stato ottimizzato per caratterizzare la distribuzione spaziale delle caratteristiche molecolari in tre applicazioni ampiamente usate: fettine di tessuto, sferoidi e colonie microbiche1,2,3. Fettine di tessuto possono essere utilizzati per valutare la localizzazione di metaboliti nel contesto di condizioni biologiche in un host, mirati o ciechi in uno specifico intervallo di massa. Tuttavia, le differenze tra le caratteristiche molecolari sono il più significativo ed evidente quando un tessuto sano è rispetto a una condizione di malato, ad esempio, un tumore. Questo approccio IMS è particolarmente adatto alla rilevazione di biomarcatori di malattia, tuttavia, l'acquisizione di campioni di tessuto alle fasi discrete in progressione di malattia (ad esempio, classi di tumore) esclude l'identificazione dei segnali che potrebbero essere importanti per l'inizio della malattia. Lo scambio di informazioni attraverso lo spazio è una caratteristica onnipresente di molti sistemi biologici, e fettine di tessuto non possono catturare questo relè chimico dinamico. Una tecnica che è in grado di visualizzare la diffusione e lo scambio chimico è IMS di colonie microbiche coltivate su piastre di agar; piccole molecole sono in grado di diffondere attraverso e l'agar e possono essere acquisiti tramite spettrometria di massa di matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI-TOF)4. Questa configurazione di crescita può essere utilizzata per identificare le molecole scambiati tra entità biologiche discrete (colonie) e può anche determinare la direzionalità della produzione del metabolita. La piattaforma progettata originariamente per la crescita di colonie microbiche è stata adattata per esplorare il metabolismo primario degli espianti di tessuto coltivato con cellule di mammifero e IMS è stato usato per valutare lo scambio chimico dinamico in un sistema di mammiferi in vitro.
Negli ultimi anni, è diventato chiaro che il cancro ovarico sieroso di alto grado (HGSOC) spesso ha origine nell'epitelio del tubo fallopian (FTE) e quindi si riproduce per metastasi all'ovaia durante malattia precoce sviluppo5,6, 7 , 8. il motivo che FTE tumorigeniche cellule diffusione all'ovaia, dove grandi tumori alla fine formano e riprodurrsi per metastasi ulteriormente, è attualmente poco chiaro. Precedenti ricerche si sono concentrate sul ruolo delle proteine ovariche nella metastasi primaria all'ovaia; Tuttavia, recentemente è stato dimostrato che la transizione da un sano ad un tessuto cancerogeno provoca enorme perturbazione del metabolismo cellulare e altera la produzione di piccole molecole9,10,11. Di conseguenza, abbiamo supposto che piccole molecole scambiati tra il FTE e l'ovaia possono essere parzialmente responsabile di metastasi primaria di HGSOC.
Utilizzando la nostra procedura IMS recente sviluppato, abbiamo determinato che coculture delle FTE tumorigeniche e tessuto ovarico sano induce la produzione di noradrenalina dall'ovaio. Tuttavia, in altri tipi cellulari o cellule normali FTE non hanno provocato questo effetto. Un beneficio straordinario di questo metodo è che la produzione molecolare e lo scambio di segnali che rappresentano molecole reali possono essere visualizzati, quindi anche in un coculture è possibile determinare l'origine di un segnale. Questo è un vantaggio sopra l'analisi dei campioni omogeneizzati, dove si perde tutte le informazioni spaziali. Nel nostro sistema modello, siamo stati in grado di assegnare chiaramente la produzione di noradrenalina all'ovaia. Noradrenalina è stata collegata alla metastasi e chemioresistenza dei cancri ovarici, e nostro rilevamento di questa molecola ha convalidato che il nuovo metodo IMS può scoprire molecole biologicamente rilevanti12,13, 14. questa convalida ci permette di proporre che questa nuova applicazione di IMS può essere particolarmente utile per ricercare gruppi che tentano di identificare piccole molecole in ambienti coculture e per comprendere i primi eventi che influenzano la trasformazione delle cellule e la metastasi. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di delucidare l'identità e la distribuzione spaziale di piccole molecole durante lo scambio tra tessuti e organi, rappresentati da in vitro colture cellulari 3D o ex vivo del tessuto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure di animali erano in conformità con gli istituti nazionali di salute orientamenti per la cura e l'uso di animali da laboratorio e approvato dal Comitato istituzionale animale uso e cura (IACUC) presso l'Università dell'Illinois a Chicago.
1. preparazione dei reagenti
- Mantenere cellule di epitelio oviduttali murino (MOE) a 37° C con 5% di CO2 in un incubatore alfa media minimo essenziale medio (αMEM) completati con 10% siero bovino fetale selenio (FBS), 2 mM L-Glutammina, 10mg/mL insulina, transferrina, (ITS) , 1,8 ng/mL fattore crescita epidermico (EGF), 100 U/mL di penicillina-streptomicina, la gentamicina 1mg/mL e 18,2 ng/mL estradiolo-17 β. Passare le cellule ogni 3 – 4 giorni, assicurando che non ci sono abbastanza cellule nello stesso giorno i topi saranno sacrificati.
- Preparare agarosio al 2% con 1 g di agarosio basso punto di fusione con 50 mL di acqua distillata. Autoclave l'agarosio, lasciarlo raffreddare e poi aliquota (1 mL) in 2 mL provette (Vedi Tabella materiali) prima dell'agarosi si solidifica. Dell'agarosi possono essere memorizzati a-20 ° C a tempo indeterminato.
- Preparare almeno 2 mL di media Medium (DMEM) dell'Aquila di 1 x Dulbecco per volta.
- Per la matrice per MALDI-TOF MS, preparare 10 mL di 5 mg/mL 1:1 l'acido alfa-ciano-4-hyroxycinnamic (CHCA): acido diidrossibenzoico (DHB) (Vedi Tabella materiali) in 90: 10 ACN:H2O + 0,1% acido trifluoroacetico (TFA). Sonicare soluzione fino a matrice è dissolto.
2. mouse Colony e rimozione dell'ovaio
- Mantenere le coppie riproduttrici di topi CD-1 utilizzando le procedure di custodia standard. Vicino il giorno del parto, controllare i topi ogni giorno in modo che l'età dei cuccioli è nota.
- Eutanasia cuccioli a 16 – 18 giorni di età per CO2 inalazione secondo le linee guida NIH. Consegnare la CO2 (100%) flusso di tasso del 10% – 20% volume al minuto della camera e continuare per due minuti dopo che aveva smesso di respirazione. Confermare l'eutanasia di dislocazione cervicale.
- Disinfettare tutte le apparecchiature chirurgiche immergendo in etanolo al 70%. Caldo L-15 media di Leibovitz con 1x penicillina-streptomicina a 37 ° C.
- Bagnare la superficie addominale con etanolo al 70% per disinfettare la zona e minimizzare la contaminazione con i capelli. Afferrare la pelle che copre la parete addominale utilizzando smussato forcipe e uso forbici chirurgiche per rendere una grande forma di V tagliata attraverso la pelle e la parete addominale, esponendo gli organi interni.
- Spostare gli organi interni al lato usando il forcipe. Individualmente, afferrare ogni corno uterino con una pinzetta e sollevare leggermente.
- Individuare l'ovario, che sarà alla fine del corno uterino, immediatamente di sotto del rene. Usare le forbici chirurgiche per sezionare l'ovario libero del tessuto connettivo. Quindi, tagliare il corno ovarico a metà.
- Spostare l'ovaia, ovidotto e circa una metà di ogni corno uterino di media L-15 di Leibovitz pre-riscaldato.
- Sotto un microscopio per dissezione muovere con cautela ogni ovaia da bursa circostante, liberandola dal ovidotto, bursa e qualsiasi tessuto adiposo. Spostare ogni ovaia un nuovo piatto di media L-15 di Leibovitz.
- Tagliare ogni ovaia a metà assialmente. Tenere i pezzi ovarici (ora chiamati espianti) mantenuti a 37 ° C fino al fasciame di agarosio.
3. impostazione e incubando il vetrino ITO-trattati per Cocultures
-
Cocultures indivisa
- Fluidifica l'agarosio a 70 ° C su una piastra calda.
- Posizionare il divisore 8 pozzetti in cima il tinoxide di Indio (ITO)-trattato diapositiva (Figura 1A). Il fondo in gomma sul divisore aiuta nella adesione alla diapositiva, ma assicurarsi di applicare continuo leggera pressione verso il basso durante la placcatura dell'agarosi per garantire nessuna colatura o miscelazione tra pozzetti.
- Raccogliere le cellule in una provetta conica da 15 mL, centrifugare (5 min a 800 giri/min) e risospendere a 50K cellule per 150 µ l 1 x DMEM media. Se una cella diversa densità è ottima, assicurarsi che in questa fase la sospensione cellulare è 2x la densità finale desiderata (ad esempio, per una concentrazione finale di 50.000 cellule a 300 µ l, densità delle cellule in questa fase è 50.000 cellule in 150 µ l).
- Prima coltura cellulare di placcatura, aggiungere explant ovarico al centro del pozzo (Figura 1B).
- Aggiungere dell'agarosi per ogni coltura cellulare in provette individuali 2 mL appena prima di placcatura. Per ciascun pozzetto, combinare 200 µ l di sospensione cellulare e 200 µ l di agarosio liquefatto in una provetta da 2 mL. Ad esempio, per quattro pozzi, combinare 800 µ l di sospensione cellulare e 800 µ l di agarosio al 2%. Qualche miscela sarà lasciato, ma che rende un po' più del necessario evita bolle d'aria durante il pipettaggio.
- Aggiungere dell'agarosi per colture cellulari individuali immediatamente prima di tale coltura cellulare di placcatura. L'agarosio sarà freddo in meno di un minuto, quindi preparatevi a piastra rapidamente.
- Immediatamente aggiungere 300 µ l di miscela delle cellule/agarosio in ciascun pozzetto (Figura 1). Figura 1 Mostra tre condizioni di cella e condizione uno dei media, che ognuno placcato con e senza un ovaio.
- Incubare il vetrino a 37 ° C e 5% di CO2 in un incubatore.
-
Cocultures diviso.
- Tagliare i divisori in plastica sottile, liscia (Figura 2A).
Nota: Questo esperimento utilizza i lati di un bacino di terreno sterile usa e getta, perché sono piatte e sottili. Tagliarli appena sufficientemente ampia per adattarsi comodamente l'ipotenusa del pozzo (~ 13 mm). - Fluidifica l'agarosio a 70 ° C su una piastra calda.
- Posizionare il divisore 8 pozzetti in cima alla diapositiva di ITO-trattati (Figura 2B). Il fondo in gomma sul divisore aiuta nella adesione alla diapositiva, ma assicurarsi di applicare continuo leggera pressione verso il basso durante la placcatura dell'agarosi per garantire nessuna colatura o miscelazione tra pozzetti.
- Raccogliere le cellule in una provetta conica da 15 mL, centrifugare (5 min a 800 giri/min) e risospendere a 50K cellule per 150 µ l 1 x DMEM media. Se una cella diversa densità è ottima, assicurarsi che in questa fase la sospensione cellulare è 2 volte la densità finale desiderato (ad esempio per una concentrazione finale di 50.000 cellule a 300 µ l, densità delle cellule in questa fase è 50.000 cellule in 150 µ l).
- Inserire i divisori in plastica diagonalmente in pozzetti (Figura 2).
- Aggiungere dell'agarosi per ogni sospensione cellulare uno alla volta poco prima di placcatura. Per ciascun pozzetto, combinare 100 µ l di sospensione cellulare e 100 µ l di agarosio liquefatto in una provetta da 2 mL. Ad esempio, per quattro pozzi, combinare 400 µ l di coltura cellulare e 400 µ l di agarosio al 2%. Alcune cellule/agarosio miscela sarà lasciato ma rendendo un po' più del necessario evita bolle d'aria durante il pipettaggio.
- Aggiungere dell'agarosi per colture cellulari individuali immediatamente prima di tale coltura cellulare di placcatura. L'agarosio sarà freddo in meno di un minuto, quindi preparatevi a piastra rapidamente.
- Su un lato del divisore, piastra 150 µ l di miscela delle cellule/agarosio. Consentire l'agarosio a raffreddare e solidificare (circa un minuto) e poi rimuovere il divisore (Figura 2D).
- Posizionare al centro della metà vuota del pozzo espianto dell'ovaia. Miscela di media/agarosio posto 150 µ l sopra la parte superiore dell'ovaia e solo nel lato corretto del pozzo (Figura 2E).
- Incubare il vetrino a 37 ° C e 5% di CO2 in un incubatore.
- Tagliare i divisori in plastica sottile, liscia (Figura 2A).
4. Slide di essiccazione e preparazione per MALDI-TOF MS
- Dopo quattro giorni (o punto orario preferito), rimuovere il divisore camera dalle spine dell'agarosi e lo scivolo (Figura 1). Staccare delicatamente i lati dell'agarosi dalla camera con una spatola piatta e tirare delicatamente la camera verso l'alto, facendo attenzione a non spostare eventuali spine dell'agarosi. Se si muovono, delicatamente riposizionarli in modo che non toccano un l'altro.
- Porre il vetrino in un forno di 37 ° C per circa 4 h, rotazione di 90° ogni h.
Nota: La rotazione della diapositiva è importante per garantire la distribuzione uniforme del calore in tutto il campione. - Una volta asciutto, rimuovere il vetrino dal forno (Figura 1E).
- Applicare la soluzione di matrice usando lo spruzzatore (Figura 1F), con i seguenti parametri: temperatura = 30 ° C, portata = 0,2 mL/min, numero di passaggi = 8, direzione = CC e distanza dell'ugello = 40 mm.
Nota: Al posto di uno spruzzatore di matrice, un aerografo artistico consente di applicare la matrice liquida. La stessa soluzione di matrice può essere utilizzata per spruzzare, ma circa due volte tanto soluzione è necessaria. Con lo scivolo bloccato affinché si blocca in verticale, spruzzare la diapositiva da un angolo di 90° da circa un piede di distanza (adattato da Hoffmann15) fino a quando la matrice di livello è visibile. - Aggiungere 1 µ l di calibratore (fosforo rosso per obiettivi < 500 Da, una miscela di peptidi (Vedi Tabella materiali) per obiettivi < Da 5.000) a clear spot sulla diapositiva. Fosforo rosso non richiede nessuna mescolanza con matrice, ma la miscela peptidica miscela 1:1 con matrix per aiutare la ionizzazione. Attendere il calibratore a secco.
- Disegnare una X usando un pennarello indelebile in ogni angolo della diapositiva e prendere un'immagine ottica utilizzando una fotocamera o uno scanner a 1.200 dpi.
5. acquisizione di dati di spettrometria di massa imaging
- Aprire una nuova sequenza sul software di analisi dati IMS (Vedi Tabella materiali). Impostare la larghezza della trama per risoluzione spaziale desiderata, almeno 50 µm.
- Caricare l'immagine ottica della diapositiva per il software di analisi e insegnare set tre punti utilizzando le intersezioni nella x disegnata in ogni angolo.
- Designare le regioni di interesse per l'imaging del software di acquisizione e denominarli conseguenza.
- Calibrare lo strumento utilizzando il software di acquisizione dati (Vedi Tabella materiali) all'interno di errore di 5 ppm.
- Salvare il metodo ottimizzato e cominciare il funzionamento. Questo esperimento ottimizzato i seguenti parametri: polarità = positivo, rivelatore = Reflectron, dimensione Laser = 2, Potenza Laser = 50%, riflettore modalità rivelatore guadagno = 3x.
6. elaborazione dati IMS
- .Mis file di importazione in un software statistico (Vedi Tabella materiali) per l'analisi del significato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Una diapositiva in modo ottimale secca di ITO si tradurrà in un piatto campione essiccato con minima o nessuna rughe su tutta la superficie del agarosio e pezzi di agarosio che mantengono la separazione spaziale sulla diapositiva (Figura 3). Figura 3A Mostra asciugatura ottimale, mentre Figura 3B Mostra le rughe che dovrebbero essere evitate. Questa ottimizzazione richiede un'attenta sorveglianza della diapositiva nel forno, come orario esatto può variare basato sull'umidità relativa. Mentre le rughe possono influenzare leggermente l'altezza, e quindi segnala l'accuratezza di massa di IMS, lievi rughe non avrà un impatto la qualità dei dati. Pertanto, qualsiasi agarosio che in definitiva ha lievi rughe ancora possa essere analizzato con MALDI-TOF MS. La diapositiva deve essere asciugata completamente, o questo potrebbe portare ad un'esplosione del campione nell'ambiente di alto vuoto dello spettrometro di massa MALDI-TOF.
Altri substrati a parte dell'agarosi potrebbero funzionare, ma spesso non mantengono la loro integrità strutturale all'essiccazione o la rimozione della camera ben, che si traduce nella diffusione attraverso lo scivolo di ITO e la perdita delle informazioni territoriali. Ad esempio, in precedenza abbiamo testato collagene come substrato e questo ha provocato la diffusione e perdita di informazioni spaziali quando la camera ben fu rimosso (dati non mostrati). Il tessuto utilizzato dovrebbe essere al centro del pozzo se è indiviso, o al centro del triangolo metà se è divisa, affinché l'acquisizione dei dati IMS non è contaminato con effetti di bordo. La figura 4 Mostra esempi di tessuto in modo ottimale individuato (pannello A) ed il tessuto mal posizionato (pannello B). In Figura 4B, il tessuto è situato sul bordo dell'agarosio che, quando imaged, potrebbero verificarsi è falsi segnali massa dagli effetti di bordo e non consente agli utenti di immagine l'agarosio che circonda il tessuto, che significa che secreto segnali può essere mancata durante l'analisi. Tessuto dovrebbe essere più vicino al centro come possibili, come dimostrato nella Figura 4A.
Una serie di esperimenti ha determinato che una camera 8 pozzetti era la nave migliore per incubazione, rispetto ad una piastra a 6 pozzetti e una piastra a 24 pozzetti, perché la camera di 8 pozzetti risulta in minime perturbazioni alle cellule, mentre le altre camere più grandi richiedono agarosio lastre di essere trasferito a una diapositiva di ITO o in acciaio inox dopo incubazione16. Gli alloggiamenti di 8 pozzetti da diversi marchi di diapositive di camera possono essere utilizzati, ma quelli con i lati un adesivo gomma inferiore e parallelo dei pozzi facilitare introduzione facile e la rimozione di un divisore di plastica per i pozzetti divisi. La piastra a 6 pozzetti molto più materiale richiesto e affrontato difficoltà con tali grandi aree di essiccazione. La camera di 24 pozzetti anche avuto problemi durante l'asciugatura, perché l'effetto di menisco era evidente nei pozzetti e di conseguenza, le spine asciugati con bordi significativamente più alti. La camera di 8 pozzetti non comporta l'effetto di menisco quando l'agarosio è placcato direttamente nel centro del pozzo e spine dell'agarosi non devono essere trasferiti. Inoltre, la camera di 8 pozzetti permette 8 condizioni essere testati o controllati per in un singolo esperimento. A seconda dell'esperimento, è importante includere controlli quali (1) pozzi senza espianti ovarici o cellule, (2) i pozzetti con cellule soltanto, o (3) pozzi con ovarici espianti solo. Poiché la preparazione del campione (precisa concentrazione media e dell'agarosi, quantità di matrice, ecc.) differisce leggermente tra le esecuzioni, le condizioni devono essere confrontate quando vengono acquisite nella stessa diapositiva.
Ulteriori esperimenti ha determinato che una diapositiva rivestite con ITO era la migliore piattaforma per incubazione rispetto ad una piastra in acciaio di MALDI in quanto la diapositiva permette per la verifica visiva della cella statali e posizionamento. Per esempio, utilizzando la diapositiva di ITO, possiamo verificare che le cellule hanno morfologia normale e che essi mantengono la distribuzione omogenea in tutto l'agarosio prima e seguenti dissecazione16. La diapositiva permetterà anche di incorporazione delle linee cellulari fluorescente come necessario. Inoltre, per mantenere l'interezza della spina dell'agarosi è necessaria rimozione della camera prima dell'essiccazione. Se la diapositiva è essiccata con la camera di 8 pozzetti aderito, la plastica tira la spina dell'agarosi parte e si traduce in grandi crepe i tasselli. Figura 5 viene illustrato i problemi quando la camera non viene rimosso prima dell'essiccazione.
Quando si analizzano le popolazioni delle cellule, è importante che la risoluzione spaziale è almeno 50 µm per iniziare a catturare le piccole dimensioni delle interazioni tissutali e cellulari. Con spruzzato matrice, è possibile ottenere 5 µm risoluzione, ma questo allunga il tempo complessivo per raccogliere i dati di spettrometria di massa durante producendo risultati comparabili. Risoluzione spaziale dipende anche la capacità di concentrarsi il laser nello spettrometro di massa MALDI-TOF.
Nel complesso, abbiamo ottimizzato questa installazione di diapositiva per meglio rilevare scambiati piccole molecole in coculture. Pertanto, durante l'analisi di dati stiamo cercando caratteristiche molecolari che sono presenti solo o sono significativamente più abbondante in una spina di agarosio che rappresenta la condizione biologica di interesse. Perché c'è l'opzione per includere sette altri controlli e condizioni sulla diapositiva, ciò sarà possibile visivamente e con l'aiuto di software statistico progettato per i dati IMS. Il nostro processo di dereplication in seguito all'individuazione di masse rilevanti nello spazio è ampia, così che possiamo ottenere ortogonalmente un dati ad alta risoluzione di massa e la frammentazione. Il primo passo che prendiamo per dereplication è una ricerca della massa nominale attraverso un database, ad esempio Database di metaboloma umano (HMDB) per i metaboliti dei mammiferi. La maggior parte delle molecole nel database hanno un numero significativo di spettri che copre molte tecniche per il confronto con dati sperimentali. Una volta masse nominali hanno potenziali molecole candidate come loro identità presunta, è spesso possibile confrontare dati fisici come frammentazione MS/MS, profilo UV e tempo di ritenzione tra la struttura del candidato e standard.
Ad esempio, identificazione di noradrenalina nel coculture delle cellule cancerogene di FTE incubati con tessuto ovarico ha convalidato che questo metodo IMS è in grado di rilevare piccole pertinenti molecole da questo sistema16. Figura 6 raffigura la sensibilità delle piste IMS, mostrando il tipo di dati che ci si potrebbe aspettare seguendo il protocollo per indiviso chambers. La figura 7 Mostra allo stesso modo dati rappresentativi per l'installazione di camera divisa.
Figura 1: flusso di lavoro per la preparazione del campione di coculture indivisa. (A) aderire 8 pozzetti camera lato conduttivo della diapositiva rivestite con ITO. (B) posto dimezzato le ovaie nel centro di pozzi per condizioni di coculture. (C) aggiungere 300 µ l di sospensione di agarosio/cellulare direttamente nei pozzetti. Assicurarsi che ci siano bolle d'aria e che l'ovaio rimane al centro del pozzo. Se l'agarosio pipettato disturbato l'ovaia, utilizzare delicatamente il puntale per centrarlo prima l'agarosio si raffreddi. (D) dopo quattro giorni di incubazione (o altrimenti ottimizzato il tempo) rimuovere 8 pozzetti camera da diapositiva. Se dell'agarosi rimangono collegato alla camera, delicatamente staccare la spina dell'agarosi dalla camera con una spatola e riposizionarlo sulla diapositiva. L'agarosio non aderirà alla diapositiva, quindi sarà facile da spostare. Disegnare una 'X' in ogni angolo della diapositiva e scattare una foto. (E) a secco il vetrino in un forno di 37 ° C per 4 h, girevole di 90 ° ogni ora. Agarosio deve essere completamente essiccata e dovrebbe stendersi sulla diapositiva. (F) applica matrice di scelta tramite un spruzzatore o aerografo a scivolare. Strato di matrice devono essere visibile come giallo. La diapositiva su uno scanner a 1.200 dpi di scansione e aggiungere calibranti o standard per analisi MALDI-TOF MS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: flusso di lavoro per la preparazione del campione di coculture divisa. (A) taglio schede fuori bacino media (~ 13 mm) e assicurarsi che i lati sono dritti. (B) camera di 8 pozzetti Attach conduttivo lato della diapositiva rivestite con ITO. (C) inserire divisori in diagonale nei pozzetti. Coltura delle cellule (D), aggiungere 150 µ l in agarosio ad un lato del divisore, agarosio raffreddare ed eliminarne il divisore. (E) dell'ovaia Aggiungi al centro della metà vuota bene e coprire con 150 µ l di sospensione media e dell'agarosi. Questa figura è riprodotto con permesso da Zink et al 201816. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: le rughe in spine dell'agarosi. Le rughe possono formare i tasselli di agarosio se la diapositiva è lasciata in forno per troppo tempo. Questo non preclude il campione da analisi MALDI-TOF MS ma può incidere sulla qualità dei dati. (A) immagine di una diapositiva in modo ottimale secca. Tutto l'agarosio che circonda il tessuto ovarico è completamente piatto e privo di rughe, fornendo un'ampia area per l'analisi IMS. (B) immagine di una diapositiva scarsamente secca con agarosio rugosa in tutto il campione. Questa figura è riprodotto con permesso da Zink et al 201816. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: posizionamento del tessuto. Posizione del tessuto nel campione essiccato è molto importante per l'acquisizione dati. (A) spine dell'agarosi secca delle camere divise Visualizza ovaia al centro di una metà del pozzo, che è ottimo per l'imaging. (B) essiccati spine dell'agarosi della camera divisa dove ovaia non ha centrato per incubazione o essiccazione. Il tessuto ovarico secchi sul perimetro delle spine dell'agarosi e pertanto non può essere analizzato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: diapositive con la camera di essiccazione. Quando la diapositiva è impostata nel forno prima della rimozione di camera, le spine dell'agarosi aderiscano più fortemente alla plastica rispetto a se stessi e cominciano a tirare a parte nel calore. Ciò provoca gravi crepe in agarosio e poca adesione alla diapositiva stessa. Questo grande le crepe non sono favorevoli all'analisi IMS. Top: Slide dopo essiccazione di 2 h con 8 pozzetti camera aderito. Tutte le spine dell'agarosi ma due incrinato attraverso il centro a causa di adesione alla camera 8 pozzetti. Inferiore: Scorrevole dopo la rimozione della camera di 8 pozzetti. Sola presa dell'agarosi è rimasto sulla diapositiva. Questa figura è riprodotto con permesso da Zink et al 201816. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: rilevazione dei segnali unici. Quando si confrontano 8 condizioni, è possibile rilevare i segnali che sono unici per una singola condizione. Immagine della diapositiva (A) i secchi è usato per insegnare lo spettrometro di massa MALDI-TOF quali regioni all'immagine. Qui abbiamo selezionato piccole regioni intorno al tessuto ovarico per IMS a 50 µm. (B) A rappresentante image di un segnale di m/z che è aumentata in una condizione contro tutti e otto nella stessa diapositiva. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: dati rappresentativi da installazione diviso camera. Tessuto ovarico è delineato in bianco. M/z 112 è secreto dalla metà del bene che contiene l'ovario. IMS è stato effettuato a 50 µm. Questa figura è riprodotto con permesso da Zink et al 201816. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C'è un corpo crescente di prova che implica il ruolo di noradrenalina in HGSOC12,17,18, e questa tecnica ha contribuito più meccanicistici informazioni. Con almeno otto condizioni biologiche presenti nella stessa diapositiva, il metodo può rappresentare controlli biologici come gene e specificità delle cellule come pure i controlli multimediali in un singolo IMS eseguire. Mentre il metodo è stato ottimizzato per valutare scambiati piccole molecole in un modello della metastasi primaria in HGSOC, qualsiasi cella o tipo di tessuto che può essere collocato in agarosio può essere sostituito per analizzare una vasta gamma di domande biologiche e Stati di malattia.
Uno dei passi più importanti nel protocollo è garantire che i tipi di tessuti o cellule sono nella prossimità vicina ad uno altro e sono presenti al centro della spina dell'agarosi. Un'altra considerazione importante è ottimizzare il tempo di essiccazione per l'intera diapositiva. Questo metodo è stato ottimizzato utilizzando tessuto ovarico, che secca facilmente e cui piccole dimensioni ha provocato poco essiccazione complicazioni. Tuttavia, altri tessuti, con differente composizione come il grasso, hanno profili molto diversi di asciugatura e pertanto richiedono più vasta ottimizzazione di essiccazione. Dopo l'essiccazione è stato ottimizzato per il campione biologico, il flusso di lavoro restante dovrebbe richiedere solo alterazione minima.
Durante l'acquisizione di massa spettrali, è probabile che molti progetti richiederà l'analisi di gruppi composti diversi da piccole molecole. I parametri IMS per l'acquisizione e la selezione della matrice, pertanto, devono essere adattati per generare i dati migliori per la rispettiva destinazione, se è noto. Inoltre, solo abbiamo effettuato acquisizione dati in modalità positiva con una matrice di CHCA:DHB 50: 50, ma gli esperimenti modalità negativa possono preferire un altro tipo di matrice e molecole più grandi sarebbero più facilmente rilevati in una matrice differente pure. Il metodo può essere utilizzato con una gamma ampia di massa in un approccio non mirato o con una gamma più ristretta di massa per una ricerca mirata. Nel caso del metodo discusso sopra, piccole molecole sono state il bersaglio di interesse perché il fuoco era di rilevare molecole che sono stati scambiati attraverso l'agarosio tra rappresentanti di cellule e tessuti. Anche se non possiamo pretendere le limitazioni in termini di dimensioni e struttura che inibiscono il movimento attraverso agarosio, il nostro obiettivo era di rilevare piccole molecole, così la nostra decisione di matrice e MALDI-TOF MS parametri sono stati ottimizzati per quell'obiettivo. Gli esperimenti futuri stanno sviluppandi per target lipidi e proteine che potrebbero essere stato perso nel nostro originale metodo di acquisizione.
Oltre il limite di rilevazione di mescola di classe, questo metodo richiede anche che le cellule siano compatibili con agarosio, e che il campione di tessuto (se utilizzato) essere adattato per andare bene in una camera di otto pozzetti. Alcuni tessuti possono essere adattati ai più grandi pozzi se meno condizioni biologiche sono necessarie per il confronto, ma è fondamentale che il tessuto selezionato è in grado di essiccazione fino a un'altezza uniforme di meno di 100 a 200 µm dopo essiccazione4. Più campioni biologici potrebbero essere valutati come più di un tipo di cellula in comunicazione con un fazzoletto. Poiché la preparazione del campione è in grado di separare spazialmente colture cellulari basati su agarosio, è possibile assegnare visualizzati m/z 's per la fonte di cultura cellulare basato su schemi di diffusione osservata.
Utilizzando IMS per lo studio di sezioni di tessuto umani campioni o modelli murini transgenici ricapitola la complessità dei tessuti. Tuttavia, i campioni umani sono difficili da ottenere, che può limitare notevolmente la capacità di studiare le cose come la progressione della malattia. Tessuto da modelli murini transgenici possa essere raccolti a intervalli di tempo ben definito. Ma, modelli di mouse possono essere che richiede tempo e costosa da sviluppare. Inoltre, la grande complessità dei tessuti reali in entrambi di questi modelli può rendere difficile valutare con precisione la comunicazione tra specifiche cellule o tessuti. Al contrario, il metodo presentato qui è un altamente adattabile. Diversi tessuti o linee cellulari possono essere cocultured nella stessa diapositiva per esaminare le differenze nella comunicazione. Ad esempio, le cellule normali o le cellule del tumore dal tessuto stesso possono essere coltivate nello stesso vetrino per capire le differenze dovute a trasformazione. Studi del corso di tempo possono scoprire nuove cascate di segnalazione fra le cellule, o piccole molecole inibitori e/o RNAi potrebbe essere incorporato per esaminare il ruolo di specifiche molecole di segnalazione o di metaboliti. Crediamo che queste possibilità renderà questa tecnica utile per lo studio della comunicazione della cellula--cellula in un'ampia varietà di contesti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare
Acknowledgments
Finanziamento è stato fornito dal Consorzio biomedica di Chicago con il supporto dei fondi Searle a The Chicago Community Trust (C-076) (L.M.S.); University of Illinois at Chicago avvio fondi (L.M.S); Grant 543296 dall'alleanza di fondo di ricerca di cancro ovarico (M.D.); e UG3 ES029073 (J.E.B) e dal centro nazionale per avanzare traslazionale Scienze, Istituto nazionale di salute, attraverso la concessione UL1TR002003 (JEB & LMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | To collect cells |
| 8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent for sprayed matrix |
| Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Cell culture media |
| Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | For IMS data analysis | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | To collect cells and remove supernatant |
| CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix sprayed onto dried slide |
| DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix sprayed onto dried slide |
| Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | For removal of the ovaries |
| Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | For removal of the ovaries |
| DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media mixed with agarose |
| epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Cell culture media supplement |
| Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | For agarose aliquots |
| Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Cell culture media supplement |
| Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Cell culture media supplement |
| FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS data acquisition software | |
| FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data analysis software | |
| Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | For removal of the ovaries |
| Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Cell culture media supplement |
| Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Cell culture media supplement |
| ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform for co-culture incubation |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media used during tissue dissection |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Cell culture media supplement |
| Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mixed with media for plating |
| Media basin | Corning | 4870 | Used to cut plastic dividers for divided chambers |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture media supplement |
| Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant for medium mass range |
| Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant for low mass range |
| SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistical analysis | |
| Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | For removal of the ovaries |
| TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Added to matrix solution |
| TM Sprayer | HTX Technologies | For applying matrix |
References
- Paine, M. R., et al. Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model. PLoS One. 11 (5), e0154837 (2016).
- Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating Metabolic Exchange with Imaging Mass Spectrometry. Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).
- Li, H., Hummon, A. B. Imaging Mass Spectrometry of Three-Dimensional Cell Culture Systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
- Yang, J. Y., et al. Primer on Agar-Based Microbial Imaging Mass Spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
- Coscia, F., et al. Integrative Proteomic Profiling of Ovarian Cancer Cell Lines Reveals Precursor Cell Associated Proteins and Functional Status. Nature Communications. 7, 12645 (2016).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High Grade Serous Ovarian Carcinomas Originate in the Fallopian Tube. Nature Communications. 8 (1), (2018).
- Klinkebiel, D., Zhang, W., Akers, S. N., Odunsi, K., Karpf, A. R. DNA Methylome Analyses Implicate Fallopian Tube Epithelia as the Origin for High-Grade Serous Ovarian Cancer. Molecular Cancer Research. 14 (9), 787-794 (2016).
- Falconer, H., Yin, L., Gronberg, H., Altman, D. Ovarian Cancer Risk After Salpingectomy: A Nationwide Population-Based Study. JNCI Journal of the National Cancer Institute. 107 (2), dju410 (2015).
- Dean, M., Davis, D. A., Burdette, J. E. Activin A Stimulates Migration of the Fallopian Tube Epithelium, an Origin of High-Grade Serous Ovarian Cancer, through Non-Canonical Signaling. Cancer Letters. 391, 114-124 (2017).
- King, S. M., Burdette, J. E. Evaluating the Progenitor Cells of Ovarian Cancer: Analysis of Current Animal Models. BMB Reports. 44 (7), 435 (2011).
- Reznik, E., et al. Landscape of Metabolic Variation across Tumor Types. Cell Systems. 6 (3), 301-313 (2018).
- Watkins, J. L., et al. Clinical Impact of Selective and Nonselective Beta-Blockers on Survival in Patients with Ovarian Cancer: Beta-Blockers and Ovarian Cancer Survival. Cancer. 121 (19), 3444-3451 (2015).
- Lutgendorf, S. K., et al. Stress-Related Mediators Stimulate Vascular Endothelial Growth Factor Secretion by Two Ovarian Cancer Cell Lines. Clinical Cancer Research. 9 (12), 4514-4521 (2003).
- Sood, A. K. Stress Hormone-Mediated Invasion of Ovarian Cancer Cells. Clinical Cancer Research. 12 (2), 369-375 (2006).
- Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous Matrix Deposition on Dried Agar for MALDI Imaging Mass Spectrometry of Microbial Cultures. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
- Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Imaging Mass Spectrometry Reveals Crosstalk between the Fallopian Tube and the Ovary That Drives Primary Metastasis of Ovarian Cancer. ACS Central Science. 4 (10), 1360-1370 (2018).
- Armaiz-Pena, G. N., et al. Src Activation by β-Adrenoreceptors Is a Key Switch for Tumour Metastasis. Nature Communications. 4, 1403 (2013).
- Choi, M. J., et al. HTERT Mediates Norepinephrine-Induced Slug Expression and Ovarian Cancer Aggressiveness. Oncogene. 34 (26), 3402 (2015).
