Summary
En ny metode til forberedelse af prøven blev udviklet for at imødekomme celle og væv coculture for at opdage små molekyle udveksling ved hjælp af billedbehandling massespektrometri.
Abstract
Imaging massespektrometri (IMS) er rutinemæssigt blevet anvendt på tre typer af prøver: væv sektioner, spheroids og mikrobielle kolonier. Disse prøve typer har været analyseret ved hjælp af matrix assisted laser desorption/Ionisation time of flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) for at visualisere fordelingen af proteiner, lipider og metabolitter på tværs af den biologiske prøve af interesse. Vi har udviklet en roman prøve forberedelse metode, der kombinerer styrken af de tre tidligere ansøgninger til at tage en underexplored tilgang til at identificere kemiske kommunikation i kræft, ved såning pattedyr cellekulturer til Agarosen i coculture med sundt væv efterfulgt af udtørring af prøven. Mammale væv og celler er cocultured i umiddelbar nærhed af tillader kemisk kommunikation via diffusion mellem væv og celler. På særlige tidspunkter tørres Agarosen-baserede prøven på samme måde som mikrobielle kolonier forberedt til IMS analyse. Vores metode blev udviklet til model kommunikation mellem høj grade serøs æggestokkræft stammer fra æggelederen som det interagerer med æggestokken under metastaser. Optimering af prøveforberedelsen resulterede i identifikation af noradrenalin som et nøgleelement i æggestokkene mikromiljø kemiske. Dette nyligt udviklede metode kan anvendes til andre biologiske systemer, der kræver en forståelse for kemisk kommunikation mellem tilstødende celler eller væv.
Introduction
Imaging massespektrometri (IMS) har været optimeret til at karakterisere den geografiske fordeling af molekylære funktioner i tre almindeligt brugte programmer: væv skiver, spheroids og mikrobielle kolonier1,2,3. Væv skiver kan bruges til at evaluere lokalisering af metabolitter i forbindelse med biologiske forhold i et værtsland, enten målrettet eller ikke-målrettede inden for en bestemt masseinterval. Men forskellene mellem molekylære funktioner er den vigtigste og mest indlysende når et sundt væv er i forhold til en syge tilstand, for eksempel, en tumor. Denne IMS tilgang er særligt tilpasset til påvisning af sygdommen biomarkører, dog erhverve vævsprøver ved diskrete stadier i sygdomsprogression (f.eks tumor lønklasse) er til hinder for identifikation af signaler, der kunne være vigtige for indledningen af den sygdom. Udveksling af oplysninger gennem rummet er en allestedsnærværende funktion af mange biologiske systemer, og væv skiver kan ikke indfange denne dynamiske kemiske relæ. En teknik, der er i stand til at visualisere kemiske exchange og diffusion er IMS af mikrobielle kolonier dyrkes på agar plader; små molekyler kan diffuse gennem og på tværs af agar og kan hentes via matrix assisted laser desorption/Ionisation (MALDI-TOF) massespektrometri4. Denne vækst opsætning kan bruges til at identificere molekyler udveksles mellem diskrete biologiske enheder (kolonier) og kan også bestemme retningen af metabolitten produktion. Platformen oprindeligt designet til kimtal vækst blev tilpasset til at udforske den primære metabolisme af væv explants vokset med pattedyrceller, og IMS blev brugt til at evaluere den dynamiske kemiske exchange i en in vitro-pattedyr system.
I de sidste mange år, er det blevet klart, at høj kvalitet serøs ovariecancer (HGSOC) ofte stammer i æggelederen epitel (FTE) og derefter metastasizes til æggestokkene under tidlig sygdom udvikling5,6, 7 , 8. grunden til at tumorfremkaldende FTE celler spredning til æggestokkene, hvor store tumorer i sidste ende udgør og metastaserer yderligere, er i øjeblikket uklart. Tidligere forskning har fokuseret på rollen som æggestokkene proteiner i primære metastaser til æggestokkene; Det er imidlertid for nylig påvist, at overgangen fra en sund til en tumorfremkaldende væv resulterer i massive afbrydelse af cellulære metabolisme og ændrer produktion af små molekyler9,10,11. Derfor, vi hypotese at små molekyler udveksles mellem FTE og æggestokkene kan være delvis ansvarlig for primære metastase af HGSOC.
Ved hjælp af vores nyudviklede IMS procedure, har vi besluttet, at coculture af tumorfremkaldende FTE og sunde æggestokkene væv inducerer produktion af noradrenalin fra æggestokken. Men andre celletyper eller normale FTE celler ikke fremkalde denne virkning. En ekstraordinær fordel ved denne metode er, at den molekylære produktion og udveksling af signaler, der repræsenterer virkelige molekyler kan visualiseres, så selv i en coculture er det muligt at fastslå kilden til et signal. Dette er en fordel i forhold til analysen af homogeniserede prøver, hvor alle geografisk information går tabt. I vores modelsystem kunne vi tydeligt tildele æggestokken produktion af noradrenalin. Noradrenalin er blevet forbundet med metastaser og chemoresistance af ovariecancer, og vores påvisning af dette molekyle har valideret at metoden roman IMS kan afdække biologisk relevante molekyler12,13, 14. denne validering lader os foreslå, at dette nye program for IMS kan være særligt nyttigt til forskergrupper, der forsøger at identificere små molekyler i coculture miljøer og for at forstå de tidlige begivenheder, der påvirker celle transformation og metastaser. Det overordnede mål med denne metode er at belyse identitet og rumlige fordeling af små molekyler under udveksling mellem væv og organer, repræsenteret ved in vitro- 3D cellekulturer eller ex vivo væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr procedurer var i overensstemmelse med de nationale institutter sundhed retningslinjer for pleje og anvendelse af forsøgsdyr og godkendt af den institutionelle dyr brug og pleje (IACUC) på University of Illinois i Chicago.
1. forberedelse af reagenser
- Vedligeholde murine oviductal epitel (MOE) celler ved 37° C med 5% CO2 i en fugtig inkubator i alpha Minimum afgørende Medium (αMEM) medier suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 10 mg/mL insulin, transferrin, selen (ITS) , 1,8 ng/mL epidermal vækstfaktor (EGF), 100 U/mL penicillin-streptomycin, 1 mg/mL phosphatbufferet og 18.2 ng/mL østradiol-17β. Passere cellerne hver 3-4 dage, at sikre, at der er nok celler på samme dag mus vil blive ofret.
- Forberede 2% Agarosen ved at blande 1 g af lav-smeltende Agarosen med 50 mL destilleret vand. Autoklave agarosegelelektroforese, lad den køle, og derefter prøve (1 mL) i 2 mL rør (Se Tabel af materialer) før Agarosen størkner. Agarosen kan opbevares ved-20 ° C på ubestemt tid.
- Forbered mindst 2 mL 1 x Dulbecco ændret Eagle Medium (DMEM) medier.
- For matrixen for MALDI-TOF MS, forberede 10 mL af 5 mg/mL 1:1 alpha-cyano-4-hyroxycinnamic syre (CHCA): dihydroxybenzoic syre (DHB) (Se Tabel af materialer) i 90:10 ACN:H2O + 0,1% trifluoreddikesyre (TFA). Der sonikeres løsning indtil matrix er opløst.
2. med musen koloni og æggestok fjernelse
- Vedligeholde ynglende par af CD-1 mus ved hjælp af standard boliger procedurer. I nærheden af dagen for fødsel, tjekke mus hver dag så alder af hvalpene er kendt.
- Aflive unger på 16-18 dage af alder af CO2 indånding pr. NIH retningslinjer. Levere CO2 (100%) en flow sats på 10%-20% kammer volumen pr. minut og fortsætte i to minutter efter respiration havde stoppet. Bekræfte eutanasi af cervikal dislokation.
- Desinficere alle kirurgiske udstyr ved nedsænkning i 70% ethanol. Varm Leibovitz's L-15 medier med 1 x penicillin-streptomycin til 37 ° C.
- Våd abdominal overfladen med 70% ethanol til at desinficere området og minimere forurening med hår. Greb i huden, der dækker den abdominale væg ved hjælp af stump pincet og brug kirurgisk saks til at gøre en stor V-form skære igennem huden og bugvæggen, udsætter de indre organer.
- Flyt de indre organer til side ved hjælp af pincet. Individuelt grab hver uterin horn med fine pincet og løfte lidt.
- Find æggestokkene, som vil være i slutningen af den uterine horn, umiddelbart under nyren. Brug kirurgisk saks til at dissekere æggestokken gratis af bindevæv. Derefter skæres æggestokkene horn i halve.
- Flytte æggestokken, oviduct, og cirka en halv af hver uterin horn til pre varmede Leibovitz L-15 medier.
- Under en dissekere mikroskop flytte omhyggeligt hver æggestok fra de omkringliggende bursa, frigøre det fra ovidukten, bursa og enhver fedtvæv. Flytte hver æggestok til en ny parabol Leibovitz's L-15 medier.
- Skær hver æggestok i halve aksialt. Holde de æggestokkene stykker (nu kaldet explants) holdt ved 37 ° C indtil plating af agarosegelelektroforese.
3. opsætning og inkubere diasset ITO-behandlet for Cocultures
-
Udelte cocultures
- Blødgør Agarosen ved 70 ° C på en varm tallerken.
- Placer 8-godt skillevæg på toppen af indium tinoxide (ITO)-behandlede dias (figur 1A). Gummi bund på adskilleren aids i vedhæftning til diaset, men sørg for at anvende løbende Blid nedadgående pres under Agarosen plating at sikre ingen utæt eller blanding mellem brønde.
- Indsamle celler i en 15 mL konisk slange, centrifugeres (5 min på 800 rpm), og pelleten til 50k celler pr. 150 µL i 1 x DMEM medier. Hvis en anden celle tæthed er optimal, Sørg for at cellesuspension på dette trin er 2 x den endelige tæthed ønske (f.eks. til en endelig koncentration på 50.000 celler i 300 µL, celle tæthed på dette trin er 50.000 celler i 150 µL).
- Før plating cellekultur, tilføje æggestokkene eksplantat til midten af godt (figur 1B).
- Tilføje Agarosen til hver cellekultur i individuelle 2 mL rør lige før plating. For hver brønd, kombinere 200 µL af cellesuspension og 200 µL af flydende Agarosen i et 2 mL tube. For eksempel, for fire brønde, kombinere 800 µL af cellesuspension og 800 µL af 2% agarosegelelektroforese. Nogle blanding vil være tilovers, men gør lidt mere end nødvendigt undgås luftbobler under pipettering.
- Tilføje Agarosen til individuelle cellekulturer umiddelbart før plating den cellekultur. Agarosen vil køle i under et minut, så vær forberedt på at plade hurtigt.
- Straks tilføje 300 µL af celle/Agarosen blandingen til hver brønd (figur 1 c). Figur 1 c viser tre celle betingelser og ét medie betingelse, hver belagt med og uden en æggestok.
- Inkuber dias ved 37 ° C og 5% CO2 i en fugtig inkubator.
-
Delte Cocultures.
- Skære dividers fra tynde, glatte plast (figur 2A).
Bemærk: Dette eksperiment bruger sider af et sterilt engangs media bassin, fordi de er flade og tynde. Skær dem lige bred nok til at passe stramt ind i hypotenusen af brønden (~ 13 mm). - Blødgør Agarosen ved 70 ° C på en varm tallerken.
- Placer 8-godt opdeleren oven på diasset ITO-behandlede (figur 2B). Gummi bund på adskilleren aids i vedhæftning til diaset, men sørg for at anvende løbende Blid nedadgående pres under Agarosen plating at sikre ingen utæt eller blanding mellem brønde.
- Indsamle celler i en 15 mL konisk slange, centrifugeres (5 min på 800 rpm), og pelleten til 50k celler pr. 150 µL i 1 x DMEM medier. Hvis en anden celle tæthed er optimal, Sørg for, på dette trin cellesuspension er 2 x den endelige tæthed ønske (f.eks. til en endelig koncentration på 50.000 celler i 300 µL celle tæthed på dette trin er 50.000 celler i 150 µL).
- Indsæt plastik dividers diagonalt i wells (figur 2 c).
- Tilføje Agarosen til hver cellesuspension, en ad gangen lige før plating. For hver brønd, kombinere 100 µL af cellesuspension og 100 µL af flydende Agarosen i et 2 mL tube. For eksempel, for fire brønde, kombinere 400 µL af cellekultur og 400 µL af 2% agarosegelelektroforese. Nogle celle/Agarosen blanding vil være tilovers, men gør lidt mere end nødvendigt undgås luftbobler under pipettering.
- Tilføje Agarosen til individuelle cellekulturer umiddelbart før plating den cellekultur. Agarosen vil køle i under et minut, så vær forberedt på at plade hurtigt.
- På den ene side af skillevæg, plade 150 µL af celle/Agarosen blanding. Tillad Agarosen at køle og størkne (ca. én min.) og derefter fjerne skillevæg (figur 2D).
- Placer æggestokken eksplantat i midten af den tomme halvdel af brønden. Sted 150 µL medier/Agarosen blandingen over toppen af æggestokken, og kun i den rigtige side af brønden (figur 2E).
- Inkuber dias ved 37 ° C og 5% CO2 i en fugtig inkubator.
- Skære dividers fra tynde, glatte plast (figur 2A).
4. tørring dias og forberede MALDI-TOF MS
- Efter fire dage (eller nogen foretrukne tidspunkt), fjerne kammer skillevæg fra Agarosen stik og dias (fig. 1 d). Forsigtigt løsne sider af Agarosen fra salen med en flad spatel og træk forsigtigt salen opad, være omhyggelig med ikke at flytte nogen Agarosen stik. Hvis de flytter forsigtigt flytte dem, så at de ikke rører hinanden.
- Sted diaset i et 37 ° C ovnen i ca. 4 h, roterer 90° alle h.
Bemærk: Rotation af diaset er vigtigt at sikre selv varme distribution i hele prøven. - Når tør, skal du fjerne diasset fra ovn (figur 1E).
- Anvende matrix løsning ved hjælp af sprøjte (figur 1F), med følgende parametre: temperatur = 30 ° C, strømningshastighed = 0,2 mL/min., antal passerer = 8, retning = CC og dyse afstand = 40 mm.
Bemærk: I stedet for en matrix sprøjte, en kunstnerisk airbrush kan bruges til at anvende flydende matrix. Den samme løsning ved matrix kan bruges til at sprøjte, men ca dobbelt så meget løsning er påkrævet. Med dias fastspændt så at det hænger lodret, sprøjte dias fra en 90° vinkel fra cirka én mund væk (Adapted fra Hoffmann15) indtil matrixen lag er synlige. - Tilføj 1 µL af kalibratoren (fosfor rød for mål < 500 Da, en peptid blanding (Se Tabel af materialer) for mål < 5.000 Da) at klare spot på diaset. Fosfor rød kræver ingen blanding med matrix, men peptid blandingen kræver 1:1 blanding med matrix til at støtte ionisering. Vent til kalibratoren tørre.
- Tegne en X ved hjælp af en permanent markør i hvert hjørne af dias og tage et optisk billede med et kamera eller en scanner på 1.200 dpi.
5. imaging massespektrometri dataopsamling
- Åbn en ny sekvens på IMS data analyse software (Se Tabel af materialer). Indstille raster bredde til ønskede rumlige opløsning, mindst 50 µm.
- Uploade den optisk billede af diaset til analyse software og sæt tre undervise points ved vejkryds i de X'er trukket i hvert hjørne.
- Udpege områder af interesse for billeddannelse i erhvervelse software og navngive dem i overensstemmelse hermed.
- Kalibrere instrument bruger data erhvervelse software (Se Tabel af materialer) inden for 5 ppm fejl.
- Gemmer den optimerede metode og begynder at køre. Dette eksperiment optimeret følgende parametre: polaritet = positiv, detektor = Reflectron, Laser størrelse = 2, Laser power = 50%, reflektor tilstand detektor gevinst = 3 x.
6. behandling IMS Data
- Importer .mis fil i statistisk software (Se Tabel af materialer) til analyse af betydning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et optimalt tørrede ITO dias vil resultere i en flad udtørret prøve med minimal til ingen rynker over overfladen af Agarosen og Agarosen stykker, der opretholder rumlig adskillelse på diaset (figur 3). Figur 3A viser optimal tørring, mens figur 3B viser de rynker, der bør undgås. Denne optimering kræver omhyggelig overvågning af diaset i ovnen, som nøjagtige tidspunkter kan variere baseret på den relative luftfugtigheden. Mens rynker kan let påvirke højden, og derfor masse nøjagtigheden af IMS signaler, påvirker mindre rynker ikke kvaliteten af dataene. Derfor kan enhver agarosegelelektroforese, der i sidste ende har mindre rynker stadig analyseres via MALDI-TOF MS. Diaset skal være helt tørret eller dette kunne føre til en eksplosion af prøven i den høje vakuum miljø af MALDI-TOF massespektrometer.
Andre substrater bortset fra Agarosen kan arbejde, men ofte gange opretholder ikke deres strukturelle integritet ved tørring eller fjernelse af godt salen, hvilket resulterer i at udbrede på tværs af ITO dias og tab af geografisk information. For eksempel, vi har tidligere testet kollagen som substrat og dette resulterede i at sprede og tab af geografisk information når godt salen blev fjernet (data ikke vist). Væv bruges bør være i centrum af godt hvis det er udelte eller i midten af trekanten halv hvis den er delt, således at erhvervelse af IMS data ikke er forurenet med kant effekter. Figur 4 viser eksempler på optimalt placeret væv (panel A) og dårligt placerede væv (panel B). I figur 4B, vævet er beliggende i udkanten af agarosegelelektroforese, når afbildet, kan medføre falske masse signaler fra kanteffekterne, og tillader ikke brugere at billede Agarosen omkringliggende væv, hvilket betyder, at udskilles signaler kan blive savnet under analysen. Væv bør være så tæt på centrum som muligt, som vist i figur 4A.
En serie af eksperimenter fastslået, at en 8-godt kammer var det bedste skib til inkubation, i forhold til et 6-godt og en 24-godt plader, fordi 8-godt kammer resulterer i minimale perturbationer til cellerne, der henviser til, at de andre større kamre kræver Agarosen plader skal overføres til en ITO eller rustfrit stål dias efter inkubation16. 8-godt kamre fra flere mærker af kammeret dias kan bruges, men dem med en klæbende gummi bund og parallelle sider af brøndene lette nem introduktion og fjernelse af en plast skillevæg til delt brøndene. 6-godt plade kræves meget mere materiale og haft problemer med tørring sådanne store områder. 24-godt kammer havde også problemer under tørringen, fordi effekten menisk var tydeligt i brøndene og derfor propperne tørret med betydeligt højere kanter. 8-godt salen resulterer ikke i menisken effekt når Agarosen er belagt direkte i midten af brønden, og Agarosen stik ikke skal overføres. Derudover tillader 8-godt kammeret for 8 betingelser for at blive testet eller kontrolleret i et enkelt eksperiment. Afhængigt af eksperimentet, kan det være vigtigt at medtage kontrolelementer som (1) brønde uden æggestokkene explants eller celler, (2) brønde med celler kun, eller (3) brønde med ovarie explants kun. Fordi Prøveforberedelse (præcise medier og Agarosen koncentration, matrix beløb, etc.) er lidt forskellig mellem kørsler, bør betingelser sammenlignes, når de er erhvervet på den samme dias.
Yderligere eksperimenter fastslået, at en ITO-belagt slide var den bedste platform for inkubation i forhold til en MALDI stålplade, fordi diasset giver visuel kontrol af cellen statslige og positionering. For eksempel, kan bruger diasset ITO, vi kontrollere at cellerne har normal morfologi og at de fastholder homogen fordeling i hele Agarosen forud for og følgende udtørring16. Diasset vil også give mulighed for indarbejdelse af fluorescerende cellelinjer efter behov. Derudover er fjernelse af salen før udtørring forpligtet til at opretholde helhed af Agarosen plug. Hvis skydemekanismen er udtørret med 8-godt kammer overholdes, plast trækker Agarosen stikket fra hinanden og resulterer i store revner i stikkene. Figur 5 viser de problemer, når salen ikke fjernes før tørring.
Når du analyserer cellepopulationer, er det vigtigt at den rumlige opløsning er mindst 50 µm begynder at fange den lille størrelse af væv og cellulære vekselvirkninger. Med sprøjtede matrix, det er muligt at opnå 5 µm opløsning, men dette forlænger den samlede tid til at samle massespektrometri data samtidig giver tilsvarende resultater. Rumlige opløsning er også afhængigt af evnen til at fokusere laseren i MALDI-TOF massespektrometer.
Samlet set har vi optimeret denne slide opsætning at bedst påvise udvekslede små molekyler i coculture. Derfor forsøger vi under dataanalyse molekylære funktioner, der er kun til stede eller er betydeligt mere rigelige i en Agarosen plug, der repræsenterer den biologiske tilstand af interesse. Fordi der er mulighed for at medtage syv andre kontrolelementer og betingelser på diaset, kan dette opnås, visuelt og ved hjælp af statistisk software designet til IMS data. Vores dereplication proces efter påvisning af rumligt relevante masserne er omfattende, så vi kan ortogonalt opnå en høj opløsning masse og fragmentering data. Det første skridt, vi tager for dereplication er en ransagning af den nominelle masse gennem en database, som den menneskelige Metabolome Database (HMDB) for pattedyr metabolitter. De fleste af molekyler i databasen har et betydeligt antal spectra dækker mange teknikker til sammenligning med eksperimentelle data. Når nominelle masserne har potentielle kandidat molekyler som deres formodede identitet, er det ofte muligt at sammenligne fysiske data såsom MS/MS fragmentering, UV profil og retentionstiden mellem kandidat struktur og en standard.
For eksempel, har identifikation af noradrenalin i coculture af tumorfremkaldende FTE cellerne inkuberes med æggestokkene væv valideret at denne IMS metode er i stand til at opdage relevante små molekyler fra dette system16. Figur 6 viser følsomhed af IMS løber, viser typen data, man kan forvente ved at følge protokollen for udelt kamre. Figur 7 viser ligeledes repræsentative data for opsætningen af delte kammer.
Figur 1: arbejdsgang for prøveforberedelse af udelte coculture. (A) Adhere 8-godt kammer til ledende side af ITO-belagt slide. (B) sted halveret æggestokkene i midten af brønde for coculture betingelser. (C) tilføje 300 µL af Agarosen/cellesuspension direkte i brønde. Sørg for der er ingen luftbobler og at æggestokken forbliver i midten af brønden. Hvis den pipetted Agarosen forstyrret æggestokken, forsigtigt bruge afpipetteres tip til at centrere det før Agarosen køler. (D) efter fire dages inkubation (eller anden måde optimeret tid) fjerne 8-godt kammer fra dias. Agarosen stadig er forbundet til kammeret, forsigtigt løsne Agarosen plug fra kammeret ved hjælp af en spatel og flytte det på diaset. Agarosen vil ikke overholde diaset, så det bliver let at flytte. Tegne et 'X' på hvert hjørne af dias og tage et foto. (E) tør dias i et 37 ° C ovnen i 4 h, roterende 90 ° hver time. Agarosen bør være fuldt udtørret og skal ligge fladt på diaset. (F) Anvend matrix valg via en sprøjte eller airbrush til at glide. Matrix lag bør ses som gul. Scanne dias på en scanner på 1.200 dpi og tilføje calibrants eller standarder for MALDI-TOF MS analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: arbejdsgang for prøveforberedelse af delte coculture. (A) Cut faner ud af media bassin (~ 13 mm) og sikre, at siderne er lige. (B) Vedhæft 8-godt kammer til ledende side af ITO-belagt slide. (C) Indsæt dividers diagonalt i brønde. (D) Tilføj 150 µL cellekultur i Agarosen til den ene side af skillevæg, tillade Agarosen til cool og fjerne skillevæg. (E) Tilføj æggestokken til midten af Tom godt halv og dække med 150 µL af medier og Agarosen suspension. Denne figur er gengivet med tilladelse fra Zink et al. 201816. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: rynker i Agarosen stik. Rynker kan danne i Agarosen stik Hvis diasset er tilbage i ovnen i alt for lang tid. Dette vil ikke udelukke prøve fra MALDI-TOF MS analyse, men kan påvirke kvaliteten af data. (A) billede af et optimalt tørrede dias. Alle Agarosen omkring æggestokkene væv er helt flad og fri for rynker, giver rigelig område for IMS analyse. (B) billede af et dårligt tørrede dias med rynkede Agarosen hele prøven. Denne figur er gengivet med tilladelse fra Zink et al. 201816. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: placering af væv. Placeringen af væv i tørrede prøven er meget vigtigt for dataopsamling. (A) tørret Agarosen stik opdelt kamre Vis æggestokken i centrum for en halvdel af brønd, som er optimal for billeddannelse. (B) tørret Agarosen stik af delte kammer hvor æggestok ikke var centreret til inkubation eller tørring. Den æggestokkene væv tørret på kanten af Agarosen stik, og derfor ikke kan analyseres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: tørring dias med salen. Når diaset er sat i ovnen før kammer fjernelse, Agarosen stik overholde mere kraftigt plast end sig selv og begynde at trække fra hinanden i varmen. Dette resulterer i alvorlige revner i agarosegelelektroforese, og lille vedhæftning til selve diaset. Revner dette store er ikke befordrende for IMS analyse. Top: Slide efter 2 h udtørring med 8-godt kammer overholdes. Alle Agarosen stik men to krakket gennem centrum på grund af adhæsion til 8-godt kammer. Bund: Slide efter fjernelse af 8-godt kammer. Kun én Agarosen plug forblev på diaset. Denne figur er gengivet med tilladelse fra Zink et al. 201816. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: påvisning af entydige signaler. Når man sammenligner 8 betingelser, er det muligt at påvise signaler, der er unikke for en enkelt betingelse. (A) den tørrede diasbilledet bruges til at undervise MALDI-TOF massespektrometer hvilke regioner til billede. Her har vi udvalgt små regioner omkring æggestokkene væv for IMS på 50 µm. (B) et repræsentativt billede af en m/z -signal, der er upregulated i én betingelse versus alle otte på det samme dias. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: repræsentative data fra delte kammer setup. Æggestokkene væv er skitseret i hvid. M/z 112 udskilles fra halvdelen af den godt indeholdende æggestokken. IMS blev udført på 50 µm. Denne figur er gengivet med tilladelse fra Zink et al. 201816. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er en voksende mængde af beviser, der implicerer noradrenalins rolle i HGSOC12,17,18, og denne teknik har bidraget mere mekanistiske information. Med mindst otte biologiske betingelser til stede på det samme dias, kan metoden tegner sig for biologisk kontrol såsom gen samt celle specificitet og medier kontrol i en enkelt IMS opstille. Mens metoden var optimeret til at vurdere udveksles små molekyler i en model af primære metastaser i HGSOC, en celle eller vævstype, der kan placeres i Agarosen kan træde i stedet for at analysere en bred vifte af biologiske spørgsmål og sygdomstilstande.
En af de vigtigste trin i protokollen er at sikre, at vævs- eller typer er i umiddelbar nærhed af hinanden og er til stede i midten af Agarosen plug. En anden vigtig overvejelse er optimering af tørretid for hele diaset. Denne metode blev optimeret ved hjælp af æggestokkene væv, som tørres let og hvis lille størrelse resulterede i lille tørring komplikationer. Men andre væv, med forskellig sammensætning som fedt, har meget forskellige tørring profiler og derfor kræver mere omfattende udtørring optimering. Efter tørring er blevet optimeret til den biologiske prøve, bør de resterende arbejdsgang kræver kun minimal ændring.
Under masse spektrale erhvervelse er det sandsynligt, at mange projekter vil kræve en analyse af sammensatte grupper end små molekyler. IMS parametre for erhvervelse og udvælgelse af matrix, bør derfor tilpasses til at generere den bedste data for de respektive mål, hvis det vides. Derudover vi kun har udført dataopsamling i positiv tilstand med et 50: 50 CHCA:DHB matrix, men negative tilstand eksperimenter kan foretrækker en anden type af matrix, og større molekyler ville blive lettere opdaget i en forskellige matrix så godt. Metoden kan bruges med en bred masseinterval i en ikke-målrettede tilgang eller en smallere masseinterval for en målrettet søgning. For de ovenfor omtalte metode var små molekyler mål for interesse fordi fokus var at opdage molekyler, der blev udvekslet gennem Agarosen mellem celle og væv repræsentanter. Selv om vi ikke kan kræve begrænsninger med hensyn til størrelse og struktur, der hæmmer bevægelse gennem agarosegelelektroforese, var vores mål at opdage små molekyler, så vores matrix beslutning og MALDI-TOF MS parametre var optimeret til dette mål. Fremtidige eksperimenter er ved at blive udviklet til at målrette lipider og proteiner, der kan have været glemt i vores oprindelige erhvervelse metode.
Ud over begrænsningen af sammensatte klasse påvisning kræver denne metode også at cellerne er forenelig med agarosegelelektroforese, og at vævsprøve (hvis anvendt) tilpasses for at passe ind i en otte-brønds kammer. Visse væv kan tilpasses større wells hvis færre biologiske forhold er nødvendige for sammenligning, men det er afgørende, at den valgte væv er habil i tørring til et ensartet højde på mindre end 100-200 µm efter udtørring4. Flere biologiske prøver kunne vurderes som mere end én celletype i kommunikation med en væv. Fordi prøveforberedelsen er købedygtig rumligt adskilte Agarosen-baserede cellekulturer, det er muligt at tildele visualiseret m/z 's til celle kultur source baseret på observerede diffusion mønstre.
Ved hjælp af IMS for at studere væv sektioner fra menneskelige prøver eller transgene musemodeller sammenfatter kompleksiteten af væv. Menneskelige prøver er imidlertid vanskelig at opnå, som dramatisk kan begrænse muligheden for at studere ting som sygdomsprogression. Væv fra transgene musemodeller kan afhentes på nøje fastlagte tidspunkter. Men musen modeller kan være tidskrævende og dyre at udvikle. Derudover kan virkelige væv i begge disse modeller fulde kompleksitet gør det vanskeligt at præcist vurdere kommunikation mellem bestemte celler eller væv. Derimod er metoden præsenteres her en meget fleksibel. Forskellige væv eller cellelinjer kan være cocultured på den samme dias til at undersøge forskelle i kommunikation. For eksempel, kan normale celler eller tumorceller fra det samme væv være kulturperler på de samme dias at forstå forskellene på grund af transformation. Tid kursus undersøgelser kan afdække roman signaling cascades mellem celler, eller lille molekyle hæmmere og/eller RNAi kunne indarbejdes for at undersøge rollen specifikke signaling molekyler eller metabolitter. Vi mener, at disse muligheder vil gøre denne teknik nyttigt for at studere celle-til-celle kommunikation i en lang række sammenhænge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at videregive
Acknowledgments
Finansieringen blev leveret af Chicago biomedicinsk konsortiet med støtte fra Searle midler på The Chicago Fællesskabet Trust (C-076) (L.M.S.); University of Illinois at Chicago start midler (L.M.S.); Grant 543296 fra kræft i æggestokkene forskning fond Alliance (MD); og UG3 ES029073 (J.E.B.) og af det nationale Center for fremme translationel videnskab, National Institute of Health, gennem tilskud UL1TR002003 (JEB & LMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | To collect cells |
| 8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent for sprayed matrix |
| Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Cell culture media |
| Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | For IMS data analysis | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | To collect cells and remove supernatant |
| CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix sprayed onto dried slide |
| DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix sprayed onto dried slide |
| Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | For removal of the ovaries |
| Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | For removal of the ovaries |
| DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media mixed with agarose |
| epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Cell culture media supplement |
| Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | For agarose aliquots |
| Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Cell culture media supplement |
| Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Cell culture media supplement |
| FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS data acquisition software | |
| FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data analysis software | |
| Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | For removal of the ovaries |
| Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Cell culture media supplement |
| Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Cell culture media supplement |
| ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform for co-culture incubation |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media used during tissue dissection |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Cell culture media supplement |
| Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mixed with media for plating |
| Media basin | Corning | 4870 | Used to cut plastic dividers for divided chambers |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture media supplement |
| Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant for medium mass range |
| Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant for low mass range |
| SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistical analysis | |
| Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | For removal of the ovaries |
| TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Added to matrix solution |
| TM Sprayer | HTX Technologies | For applying matrix |
References
- Paine, M. R., et al. Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model. PLoS One. 11 (5), e0154837 (2016).
- Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating Metabolic Exchange with Imaging Mass Spectrometry. Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).
- Li, H., Hummon, A. B. Imaging Mass Spectrometry of Three-Dimensional Cell Culture Systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
- Yang, J. Y., et al. Primer on Agar-Based Microbial Imaging Mass Spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
- Coscia, F., et al. Integrative Proteomic Profiling of Ovarian Cancer Cell Lines Reveals Precursor Cell Associated Proteins and Functional Status. Nature Communications. 7, 12645 (2016).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High Grade Serous Ovarian Carcinomas Originate in the Fallopian Tube. Nature Communications. 8 (1), (2018).
- Klinkebiel, D., Zhang, W., Akers, S. N., Odunsi, K., Karpf, A. R. DNA Methylome Analyses Implicate Fallopian Tube Epithelia as the Origin for High-Grade Serous Ovarian Cancer. Molecular Cancer Research. 14 (9), 787-794 (2016).
- Falconer, H., Yin, L., Gronberg, H., Altman, D. Ovarian Cancer Risk After Salpingectomy: A Nationwide Population-Based Study. JNCI Journal of the National Cancer Institute. 107 (2), dju410 (2015).
- Dean, M., Davis, D. A., Burdette, J. E. Activin A Stimulates Migration of the Fallopian Tube Epithelium, an Origin of High-Grade Serous Ovarian Cancer, through Non-Canonical Signaling. Cancer Letters. 391, 114-124 (2017).
- King, S. M., Burdette, J. E. Evaluating the Progenitor Cells of Ovarian Cancer: Analysis of Current Animal Models. BMB Reports. 44 (7), 435 (2011).
- Reznik, E., et al. Landscape of Metabolic Variation across Tumor Types. Cell Systems. 6 (3), 301-313 (2018).
- Watkins, J. L., et al. Clinical Impact of Selective and Nonselective Beta-Blockers on Survival in Patients with Ovarian Cancer: Beta-Blockers and Ovarian Cancer Survival. Cancer. 121 (19), 3444-3451 (2015).
- Lutgendorf, S. K., et al. Stress-Related Mediators Stimulate Vascular Endothelial Growth Factor Secretion by Two Ovarian Cancer Cell Lines. Clinical Cancer Research. 9 (12), 4514-4521 (2003).
- Sood, A. K. Stress Hormone-Mediated Invasion of Ovarian Cancer Cells. Clinical Cancer Research. 12 (2), 369-375 (2006).
- Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous Matrix Deposition on Dried Agar for MALDI Imaging Mass Spectrometry of Microbial Cultures. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
- Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Imaging Mass Spectrometry Reveals Crosstalk between the Fallopian Tube and the Ovary That Drives Primary Metastasis of Ovarian Cancer. ACS Central Science. 4 (10), 1360-1370 (2018).
- Armaiz-Pena, G. N., et al. Src Activation by β-Adrenoreceptors Is a Key Switch for Tumour Metastasis. Nature Communications. 4, 1403 (2013).
- Choi, M. J., et al. HTERT Mediates Norepinephrine-Induced Slug Expression and Ovarian Cancer Aggressiveness. Oncogene. 34 (26), 3402 (2015).
