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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

इमेजिंग द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर ऊतकों और कोशिकाओं के बीच छोटे अणु संचार पर कब्जा

Published: April 3, 2019 doi: 10.3791/59490
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Department of Medicinal Chemistry and Pharmacognosy, University of Illinois at Chicago, 2Department of Animal Science, University of Illinois at Urbana-Champaign

Summary

नमूना तैयार करने की एक उपंयास विधि कोशिका और ऊतक coculture को समायोजित करने के लिए छोटे अणु का पता लगाने के लिए इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग विनिमय विकसित किया गया था ।

Abstract

इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईएमएस) के नमूने के तीन प्रकार के लिए नियमित रूप से लागू किया गया है: ऊतक वर्गों, spheroids, और माइक्रोबियल कालोनियों. इन नमूना प्रकार का उपयोग कर विश्लेषण किया गया है मैट्रिक्स की सहायता से लेजर विशोषण/ionization समय की उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MALDI-TOF MS) प्रोटीन, लिपिड के वितरण की कल्पना करने के लिए, और ब्याज के जैविक नमूना भर चयापचयों. हम एक उपंयास नमूना तैयार करने की विधि है कि तीन पिछले अनुप्रयोगों की ताकत को जोड़ती कैंसर में रासायनिक संचार की पहचान करने के लिए एक underअन्वेषित दृष्टिकोण को संबोधित विकसित किया है, में ऐगेरोस में स्तनधारी सेल संस्कृतियों बोने के द्वारा स्वस्थ ऊतकों के साथ सहसंस्कृति जिसके बाद नमूने का सुखाना होता है. स्तनधारी ऊतक और कोशिकाओं को ऊतक और कोशिकाओं के बीच प्रसार के माध्यम से रासायनिक संचार की अनुमति करीब निकटता में cocultured हैं । विशिष्ट समय बिंदुओं पर, ऐगरोस-आधारित प्रतिदर्श को आईएमएस विश्लेषण के लिए तैयार माइक्रोबियल कालोनियों के रूप में एक ही तरीके से सुखा लिया जाता है । हमारी विधि के लिए उच्च ग्रेड तरल डिम्बग्रंथि के कैंसर के बीच संचार मॉडल विकसित किया गया था फैलोपियन ट्यूब के रूप में यह मेटास्टेसिस के दौरान अंडाशय के साथ इंटरैक्ट करता है । नमूना तैयारी के अनुकूलन के परिणामस्वरूप डिम्बग्रंथि microenvironment में एक प्रमुख रासायनिक घटक के रूप में norepinephrine की पहचान । यह नव विकसित विधि अंय जैविक प्रणालियों के लिए लागू किया जा सकता है कि आसंन कोशिकाओं या ऊतकों के बीच रासायनिक संचार की समझ की आवश्यकता है ।

Introduction

इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईएमएस) तीन व्यापक रूप से इस्तेमाल किया अनुप्रयोगों में आणविक सुविधाओं के स्थानिक वितरण की विशेषता के लिए अनुकूलित किया गया है: ऊतक स्लाइस, spheroids, और माइक्रोबियल कालोनियों1,2,3. ऊतक स्लाइस एक मेजबान में जैविक स्थितियों के संदर्भ में चयापचयों के स्थानीयकरण का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या तो लक्षित या एक विशिष्ट मास रेंज के भीतर अलक्षित । हालांकि, आणविक सुविधाओं के बीच अंतर सबसे महत्वपूर्ण और स्पष्ट कर रहे हैं जब एक स्वस्थ ऊतक एक रोगग्रस्त हालत की तुलना में है, उदाहरण के लिए, एक ट्यूमर. इस आईएमएस दृष्टिकोण विशेष रूप से रोग biomarkers का पता लगाने के लिए अनुकूलित है, तथापि, रोग प्रगति में असतत चरणों में ऊतक के नमूने प्राप्त (जैसे ट्यूमर ग्रेड के रूप में) संकेत है कि दीक्षा के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है की पहचान precludes रोग. अंतरिक्ष के माध्यम से सूचना के आदान प्रदान कई जैविक प्रणालियों की एक सर्वव्यापी सुविधा है, और ऊतक स्लाइस इस गतिशील रासायनिक रिले पर कब्जा नहीं कर सकते । एक तकनीक है कि रासायनिक विनिमय और प्रसार visualizing में सक्षम है माइक्रोबियल की कालोनियों के आईएमएस है आगर प्लेटों पर उगाया जाता है; छोटे अणुओं के माध्यम से और आगर भर में फैलाना कर सकते है और मैट्रिक्स के माध्यम से कब्जा कर लिया जा सकता है-लेजर desorption सहायता/ इस वृद्धि सेटअप असतत जैविक संस्थाओं (कालोनियों) के बीच विनिमय अणुओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और यह भी metabolite उत्पादन की दिशात्मकता का निर्धारण कर सकते हैं । मूल रूप माइक्रोबियल कॉलोनी विकास के लिए डिज़ाइन मंच स्तनधारी कोशिकाओं के साथ हो ऊतक explants के प्राथमिक चयापचय का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया गया था, और आईएमएस एक विट्रो स्तनधारी प्रणाली में गतिशील रासायनिक विनिमय का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता था ।

पिछले कई वर्षों में, यह स्पष्ट हो गया है कि उच्च ग्रेड तरल डिम्बग्रंथि कैंसर (hgsoc) अक्सर फैलोपियन ट्यूब उपकला (fte) में निकलती है और फिर जल्दी रोग विकास के दौरान अंडाशय के लिए metastasizes5,6, 7 , 8. कारण यह है कि तुमॉर्जेनिक fte कोशिकाओं अंडाशय है, जहां बड़े ट्यूमर अंततः फार्म और metastasize के लिए फैला है, वर्तमान में स्पष्ट नहीं है । पिछले अनुसंधान अंडाशय के लिए प्राथमिक मेटास्टेसिस में डिम्बग्रंथि प्रोटीन की भूमिका पर ध्यान केंद्रित किया है; हालांकि, यह हाल ही में प्रदर्शित किया गया है कि संक्रमण से एक स्वस्थ ऊतक सेलुलर चयापचय के बड़े पैमाने पर व्यवधान में परिणाम और छोटे अणुओं9,10,11के उत्पादन बदल जाता है । इसलिए, हम कि fte और अंडाशय के बीच विनिमय छोटे अणुओं आंशिक रूप से hgsoc के प्राथमिक मेटास्टेसिस के लिए जिंमेदार हो सकता है डोडो ।

हमारे नव विकसित आईएमएस प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, हमने यह निर्धारित किया है कि ट्यूमोर्जेनिक फ्टे और स्वस्थ डिम्बग्रंथि ऊतक की सहसंस्कृति अंडाशय से नोरेपपीनेरीन के उत्पादन को प्रेरित करती है । हालांकि, अंय कक्ष प्रकारों या सामांय FTE कक्षों ने इस प्रभाव को प्राप्त नहीं किया । इस विधि का एक असाधारण लाभ यह है कि आणविक उत्पादन और संकेतों का आदान-प्रदान है कि वास्तविक अणुओं का प्रतिनिधित्व visualized जा सकता है, तो भी एक coculture यह एक संकेत के स्रोत का निर्धारण करने के लिए संभव है में । यह homogenized नमूनों, जहां सभी स्थानिक जानकारी खो दिया है के विश्लेषण पर एक फायदा है । हमारे मॉडल प्रणाली में, हम स्पष्ट रूप से अंडाशय को norepinephrine के उत्पादन को निर्दिष्ट करने में सक्षम थे । Norepinephrine मेटास्टेसिस और डिम्बग्रंथि के कैंसर के chemoresistance से जुड़ा हुआ है, और हमारे इस अणु का पता लगाने की पुष्टि की है कि उपंयास आईएमएस विधि जैविक रूप से प्रासंगिक अणुओं को उजागर कर सकते है12,13, 14. इस मांयता की मदद से हमें प्रस्ताव है कि आईएमएस के इस नए आवेदन विशेष रूप से अनुसंधान समूहों है कि coculture वातावरण में छोटे अणुओं की पहचान करने के लिए प्रयास कर रहे है और जल्दी घटनाओं को समझने के लिए उपयोगी हो सकता है कि प्रभाव कोशिका परिवर्तन और मेटास्टेसिस । इस विधि का समग्र लक्ष्य ऊतकों और अंगों के बीच विनिमय के दौरान छोटे अणुओं की पहचान और स्थानिक वितरण को स्पष्ट करना है, या तो विट्रो 3d सेल संस्कृतियों या पूर्व vivo ऊतक में द्वारा प्रतिनिधित्व किया ।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं की देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए स्वास्थ्य दिशानिर्देश के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार थे और शिकागो में इलिनोइस विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु उपयोग और देखभाल (IACUC) समिति द्वारा अनुमोदित ।

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. 5% CO2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर murine अंडवाहिनी उपकला (moe) कोशिकाओं को बनाए रखें अल्फा ंयूनतम आवश्यक माध्यम (α मेम) में एक humidified मशीन में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (fbs), 2 मिमी L-glutamine, 10 मिलीग्राम/एमएल इंसुलिन, transferrin, सेलेनियम (ITS) के साथ पूरक , १.८ एनजी/एमएल एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (EGF), १०० यू/एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1 एमजी/एमएल जेंटेमाइसिन, और १८.२ एनजी/एमएल एस्ट्राडियोल-17β । कोशिकाओं को हर ३-४ दिन में पास कर देना, यह सुनिश्चित करना कि वहाँ पर पर्याप्त कोशिकाएँ हैं उसी दिन चूहों की बलि दी जाएगी.
  2. डिस्टिल्ड पानी की ५० मिलीलीटर के साथ कम पिघलने ऐगेरोस के 1 जी मिश्रण से 2% ऐगेरोस तैयार करें । आटोक्लेव, शांत करने के लिए अनुमति देते हैं, और फिर aliquot (1 मिलीलीटर) 2 मिलीलीटर ट्यूबों में ( सामग्री की मेजदेखें) से पहले ऐगेरोस जम जाता है । Agarose पर संग्रहित किया जा सकता है-20 डिग्री सेल्सियस अनिश्चित काल के ।
  3. 1x Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) मीडिया के कम से 2 मिलीलीटर तैयार करें ।
  4. माल्डी-TOF MS के लिए मैट्रिक्स के लिए, 10 मिलीलीटर की 5 मिलीग्राम/एमएल 1:1 अल्फा-cyano-4-hyroxycinnamic एसिड (CHCA):d ihydroxybenzoic एसिड (DHB) ( सामग्री की तालिकादेखें) में 90:10 acn: H2O + ०.१% trifluoroacetic एसिड (tof) । Sonicate समाधान जब तक मैट्रिक्स भंग है ।

2. माउस कॉलोनी और अंडाशय हटाने

  1. मानक आवास प्रक्रियाओं का उपयोग कर सीडी-1 चूहों के प्रजनन जोड़े बनाए रखें । प्रसव के दिन के पास, हर दिन चूहों की जांच करें ताकि पिल्ले की उंर जाना जाता है ।
  2. Nih दिशा निर्देशों के अनुसार सह2 साँस लेने के द्वारा 16 – 18 दिन की उंर में पिल्ले euthanize । सीओ2 उद्धार (१००%) 10% की प्रवाह दर पर-प्रति मिनट 20% चैंबर मात्रा और श्वसन बंद कर दिया था के बाद दो मिनट के लिए जारी है । ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा इच्छामृत्यु की पुष्टि करें ।
  3. ७०% इथेनॉल में submerging द्वारा सभी शल्य चिकित्सा उपकरण कीटाणुरहित । ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए 1x पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ गर्म Leibovitz के एल-15 मीडिया ।
  4. गीला ७०% इथेनॉल के साथ पेट की सतह क्षेत्र कीटाणुरहित करने के लिए और बालों के साथ संदूषण को कम करने । कुंद संदंश का उपयोग कर पेट की दीवार को कवर त्वचा को पकड़ और शल्य कैंची का उपयोग करने के लिए एक बड़े वी आकार त्वचा और पेट की दीवार के माध्यम से काट कर, आंतरिक अंगों को उजागर ।
  5. Forceps का उपयोग कर पक्ष करने के लिए आंतरिक अंगों ले जाएँ. व्यक्तिगत रूप से ठीक संदंश के साथ प्रत्येक गर्भाशय सींग हड़पने और थोड़ा उठा ।
  6. अंडाशय का पता लगाएँ, जो गर्भाशय के अंत में हो जाएगा, तुरंत गुर्दे के नीचे. संयोजी ऊतक से मुक्त अंडाशय विच्छेदन करने के लिए शल्य कैंची का प्रयोग करें । फिर, आधा में डिम्बग्रंथि सींग काट ।
  7. अंडाशय, ओवीडक्ट, और प्रत्येक गर्भाशय सींग के लगभग एक आधा पूर्व गर्म है Leibovitz एल-15 मीडिया के लिए ले जाएं ।
  8. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत ध्यान से प्रत्येक अंडाशय को आसपास के बर्सा से ले जाएं, इसे अंडवाहिनी, बर्सा, और किसी भी वसा ऊतक से मुक्त करें । Leibovitz के एल-15 मीडिया के एक नए पकवान के लिए प्रत्येक अंडाशय ले जाएं ।
  9. प्रत्येक अंडाशय को आधे अक्षत में काट लें । डिम्बग्रंथि के टुकड़े रखें (अब explants कहा जाता है) ३७ डिग्री सेल्सियस पर रखा agarose के चढ़ाना तक ।

3. स्थापित करने और संस्कृति के लिए ITO-उपचारित स्लाइड इनसेबटिंग

  1. अविभाजित सहसंस्कृतियां
    1. एक गर्म थाली पर ७० डिग्री सेल्सियस पर ऐगेरोस द्रव ।
    2. इंडियम टिनॉक्साइड (ITO)-उपचारित स्लाइड (चित्र 1a) के शीर्ष पर 8-कूप विभाजक रखें । डिवाइडर पर रबड़ नीचे स्लाइड करने के लिए आसंजन में एड्स, लेकिन सुनिश्चित करने के लिए कोई लीक या कुओं के बीच मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए ऐगेरोस चढ़ाना के दौरान निरंतर कोमल नीचे दबाव लागू करते हैं ।
    3. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा, सेंट्रीफ्यूज (८०० rpm पर 5 मिनट), और 1x DMEM मीडिया में १५० μL प्रति 50k कोशिकाओं को resuspend । यदि एक अलग कोशिका घनत्व इष्टतम है, सुनिश्चित करें कि इस कदम पर सेल निलंबन 2x अंतिम घनत्व वांछित है (जैसे, ३०० μL में ५०,००० कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता के लिए, इस कदम पर सेल घनत्व है ५०,००० कोशिकाओं में १५० μL) ।
    4. सेल संस्कृति चढ़ाना से पहले, अच्छी तरह से केंद्र के लिए डिम्बग्रंथि एक्सप्लांट जोड़ें (चित्र 1b) ।
    5. बस चढ़ाना से पहले व्यक्तिगत 2 मिलीलीटर ट्यूबों में प्रत्येक कोशिका संस्कृति के लिए ऐगेरोस जोड़ें । प्रत्येक कूप के लिए, एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में सेल सस्पेंशन और २०० μL का द्रवीकृत ऐग्राज का २०० μL संयोजित करें । उदाहरण के लिए, चार कुओं के लिए, सेल निलंबन के ८०० μL और 2% agarose के ८०० μL गठबंधन । कुछ मिश्रण पर छोड़ दिया जाएगा, लेकिन थोड़ा से अधिक आवश्यक बनाने के लिए पाइपलाइन के दौरान हवा के बुलबुले से बचा जाता है ।
      1. सेल संस्कृति को चढ़ाना से पहले तुरंत व्यक्तिगत सेल संस्कृतियों के लिए ऐगेरोस जोड़ें । एक मिनट के तहत ऐगेरोस में ठंडा हो जाएगा, तो जल्दी से थाली तैयार हो ।
    6. तुरंत एक अच्छी तरह से (चित्रा 1C) सेल के ३०० μl जोड़ें/ चित्रा 1 सी तीन सेल शर्तों और एक मीडिया की स्थिति से पता चलता है, प्रत्येक के साथ और एक अंडाशय के बिना चढ़ाया ।
    7. ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2 में एक humidified इनयूबेटर में स्लाइड सेते ।
  2. विभाजित Cocultures ।
    1. पतली, चिकनी प्लास्टिक से डिवाइडर कट (चित्रा 2A) ।
      नोट: यह प्रयोग एक डिस्पोजेबल मीडिया बेसिन के पक्षों का उपयोग करता है क्योंकि वे फ्लैट और पतली हैं । उंहें काट बस काफी चौड़ा करने के लिए अच्छी तरह से (~ 13 मिमी) के कर्ण में snugly फिट ।
    2. एक गर्म थाली पर ७० डिग्री सेल्सियस पर ऐगेरोस द्रव ।
    3. ITO-उपचारित स्लाइड के शीर्ष पर 8-well विभाजक रखें (चित्र 2b) । डिवाइडर पर रबड़ नीचे स्लाइड करने के लिए आसंजन में एड्स, लेकिन सुनिश्चित करने के लिए कोई लीक या कुओं के बीच मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए ऐगेरोस चढ़ाना के दौरान निरंतर कोमल नीचे दबाव लागू करते हैं ।
    4. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा, सेंट्रीफ्यूज (८०० rpm पर 5 मिनट), और 1x DMEM मीडिया में १५० μL प्रति 50k कोशिकाओं को resuspend । यदि एक अलग कोशिका घनत्व इष्टतम है, सुनिश्चित करें कि इस कदम पर सेल निलंबन 2x अंतिम घनत्व वांछित है (जैसे ५०,००० कोशिकाओं के ३०० μL में अंतिम एकाग्रता के लिए, इस कदम पर सेल घनत्व है ५०,००० कोशिकाओं में १५० μL) ।
    5. कुओं में तिरछे प्लास्टिक के डिवाइडर डालें (चित्र 2c) ।
    6. बस चढ़ाना से पहले एक समय में एक सेल निलंबन एक को ऐगेरोस जोड़ें । प्रत्येक कूप के लिए, एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में सेल सस्पेंशन और १०० μL का द्रवीकृत ऐग्राज का १०० μL संयोजित करें । उदाहरण के लिए, चार कुओं के लिए, सेल संस्कृति के ४०० μL और 2% agarose के ४०० μL गठबंधन । कुछ सेल/एगार्स मिश्रण पर छोड़ दिया जाएगा, लेकिन थोड़ा अधिक आवश्यक बनाने के लिए पाइपलाइन के दौरान हवा के बुलबुले से बचा जाता है ।
      1. सेल संस्कृति को चढ़ाना से पहले तुरंत व्यक्तिगत सेल संस्कृतियों के लिए ऐगेरोस जोड़ें । एक मिनट के तहत ऐगेरोस में ठंडा हो जाएगा, तो जल्दी से थाली तैयार हो ।
    7. डिवाइडर के एक तरफ, प्लेट १५० μL की कोशिका/ अग्से को शांत और जमना (लगभग एक मिनट) और फिर डिवाइडर (चित्र 2d) को हटाने की अनुमति दें ।
    8. अच्छी तरह से खाली आधा के केंद्र में जगह अंडाशय एक्सप्लांट । जगह १५० μL मीडिया/agarose मिश्रण अंडाशय के शीर्ष पर, और केवल अच्छी तरह से (चित्रा 2E) के सही पक्ष में ।
    9. ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2 में एक humidified इनयूबेटर में स्लाइड सेते ।

4. सुखाने स्लाइड और मालदी के लिए तैयारी-TOF MS

  1. चार दिनों के बाद (या किसी भी पसंदीदा समय बिंदु), ऐगेरोस प्लग और स्लाइड से चैंबर विभक्त निकालें (चित्रा 1 डी). धीरे से एक फ्लैट रंग के साथ चैंबर से ऐगेरोस के पक्षों को अलग और धीरे चैंबर ऊपर खींचो, सावधान किया जा रहा है किसी भी एगरोस प्लग कदम नहीं है । अगर वे कदम है, धीरे से उंहें फिर से स्थिति है कि वे एक दूसरे को छू नहीं रहे हैं ।
  2. लगभग 4 ज के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस ओवन में स्लाइड प्लेस, ९० ° हर एच घूर्णन ।
    नोट: स्लाइड के रोटेशन के नमूने भर में भी गर्मी वितरण सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  3. एक बार सूखी, ओवन से स्लाइड निकालें (चित्रा 1E) ।
  4. स्प्रेयर (चित्रा 1F), निम्नलिखित मापदंडों के साथ का उपयोग मैट्रिक्स समाधान लागू करें: तापमान = 30 ° c, प्रवाह दर = ०.२ मिलीलीटर/मिनट, गुजरता की संख्या = 8, दिशा = सीसी, और नोक दूरी = ४० mm.
    नोट: एक मैट्रिक्स स्प्रेयर के एवज में, एक कलात्मक एयरब्रश तरल मैट्रिक्स लागू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक ही मैट्रिक्स समाधान स्प्रे करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन लगभग दो बार के रूप में ज्यादा समाधान की आवश्यकता है । स्लाइड के साथ इतना बेन्च कि यह खड़ी लटकी हुई है, लगभग एक फुट दूर से एक ९० ° कोण से स्लाइड स्प्रे (हॉफमैन से अनुकूलित15) जब तक मैट्रिक्स परत दिखाई है ।
  5. 1 μL अंशमापी (लक्ष्य के लिए फास्फोरस लाल < 500 डीए, एक पेप्टाइड मिश्रण ( सामग्री की तालिकादेखें) ≪ 5000 डीए) लक्ष्य के लिए स्लाइड पर हाजिर स्पष्ट करने के लिए जोड़ें । फास्फोरस लाल मैट्रिक्स के साथ कोई मिश्रण की आवश्यकता है, लेकिन पेप्टाइड मिश्रण को ionization सहायता के लिए मैट्रिक्स के साथ 1:1 मिश्रण की आवश्यकता है । सूखी करने के लिए अंशांकन के लिए रुको ।
  6. स्लाइड के प्रत्येक कोने में एक स्थायी मार्कर का उपयोग कर एक एक्स ड्रा और १,२०० डीपीआई में एक कैमरा या एक स्कैनर का उपयोग कर एक ऑप्टिकल छवि ले लो ।

5. इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा अधिग्रहण

  1. आईएमएस डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर एक नया अनुक्रम खोलें ( सामग्री की तालिकादेखें) । निर्धारित स्थानिक संकल्प करने के लिए रेखापुंज चौड़ाई कम से कम ५० μm सेट करें ।
  2. विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए स्लाइड की ऑप्टिकल छवि अपलोड करें और एक्स में चौराहों का उपयोग कर तीन सिखाने अंक सेट प्रत्येक कोने में खींचा ।
  3. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में इमेजिंग के लिए ब्याज के क्षेत्रों को नामित और उंहें तदनुसार नाम ।
  4. 5 पीपीएम त्रुटि के भीतर डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग कर उपकरण जांचना ।
  5. ऑप्टिमाइज़ की गई विधि सहेजें और चलाएं प्रारंभ करें । यह प्रयोग निंनलिखित मापदंडों अनुकूलित: Polarity = सकारात्मक, डिटेक्टर = परावर्तक, लेजर आकार = 2, लेजर पावर = ५०%, प्रतिक्षेपक मोड डिटेक्टर लाभ = 3x ।

6. आईएमएस डेटा प्रसंस्करण

  1. सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर में आयात. mis फ़ाइल ( सामग्री की तालिकादेखें) महत्व के विश्लेषण के लिए ।

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Representative Results

एक इष्टतम सूख ito स्लाइड के साथ एक फ्लैट शुष्क नमूना में परिणाम होगा ऐगेरोस और ऐगेरोस टुकड़े की सतह भर में कोई झुर्रियां है कि स्लाइड पर स्थानिक जुदाई बनाए रखने (चित्रा 3) । चित्रा 3a इष्टतम सुखाने से पता चलता है, जबकि चित्रा 3a झुर्रियों कि बचना चाहिए पता चलता है । इस अनुकूलन ओवन में स्लाइड के सावधान निगरानी की आवश्यकता है, के रूप में सटीक समय सापेक्ष आर्द्रता के आधार पर भिंन हो सकते हैं । जबकि झुर्रियां थोड़ा ऊंचाई को प्रभावित कर सकते हैं, और इसलिए आईएमएस संकेतों की जन सटीकता, थोड़ा झुर्रियां डेटा की गुणवत्ता को प्रभावित नहीं करेगा । इसलिए, किसी भी ऐगेरोस है कि अंततः मामूली झुर्रियां अभी भी maldi के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है-tof MS । स्लाइड पूरी तरह से सूख जाना चाहिए या यह मालदी-TOF मास स्पेक्ट्रोमीटर के उच्च वैक्यूम वातावरण में नमूना का एक विस्फोट करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

अंय सब्सट्रेट से अग्राज़ के अलावा काम कर सकते हैं, लेकिन अक्सर बार सुखाने या अच्छी तरह से चैंबर, जो ITO स्लाइड और स्थानिक जानकारी के नुकसान भर में फैलने में परिणाम के हटाने पर अपने संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने नहीं है । उदाहरण के लिए, हम पहले से एक सब्सट्रेट के रूप में कोलेजन का परीक्षण किया है और यह फैल रहा है और स्थानिक जानकारी के नुकसान में हुई जब अच्छी तरह से चैंबर (डेटा नहीं दिखाया) हटा दिया गया था. इस्तेमाल ऊतक अच्छी तरह से अगर यह अविभाजित है के केंद्र में होना चाहिए, या आधा त्रिकोण के केंद्र में अगर यह विभाजित है, ताकि आईएमएस डेटा के अधिग्रहण के किनारे प्रभाव के साथ दूषित नहीं है । चित्रा 4 इष्टतम स्थित ऊतक (पैनल ए) और बुरी तरह से तैनात ऊतक (पैनल बी) के उदाहरण से पता चलता है । चित्रा 4bमें, ऊतक एगरोस के किनारे पर स्थित है जो, जब imaged, परिणाम हो सकता है बढ़त प्रभाव से झूठी जन संकेत है, और उपयोगकर्ताओं को छवि के लिए अनुमति नहीं देता है ऊतकों, जिसका अर्थ है कि स्रावित संकेतों याद किया जा सकता है आसपास के ऐगेरोस विश्लेषण के दौरान । ऊतक के रूप में संभव के रूप में केंद्र के करीब होना चाहिए, के रूप में चित्र 4aमें प्रदर्शन किया ।

प्रयोगों की एक श्रृंखला निर्धारित किया है कि एक 8-well चैंबर ऊष्मायन के लिए सबसे अच्छा पोत था, के रूप में एक 6-अच्छी तरह से थाली और एक 24-अच्छी तरह से थाली की तुलना में, क्योंकि 8-अच्छी तरह से कक्ष के लिए ंयूनतम परेशान में चैंबर परिणाम है, जबकि अंय बड़े कक्षों की आवश्यकता ऐगेरोस स्लैब एक ito या स्टेनलेस स्टील इंक्यूबेशन16के बाद स्लाइड को हस्तांतरित किया जाएगा । चैंबर स्लाइड के कई ब्रांडों से 8-अच्छी तरह से कक्षों का इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन एक चिपकने वाला रबर नीचे और कुओं के समानांतर पक्षों के साथ उन आसान परिचय और विभाजित कुओं के लिए एक प्लास्टिक डिवाइडर के हटाने की सुविधा । 6-कूप प्लेट बहुत अधिक सामग्री की आवश्यकता है और ऐसे बड़े क्षेत्रों सुखाने के साथ कठिनाइयों का सामना करना पड़ा । 24-well चैंबर भी सुखाने के दौरान समस्याओं था, क्योंकि नवचंद्रक प्रभाव कुओं में स्पष्ट था और इसलिए, प्लग काफी उच्च किनारों के साथ सूख गया । 8-अच्छी तरह से चैंबर नवचंद्रक प्रभाव में परिणाम नहीं है जब ऐगेरोस सीधे के केंद्र में चढ़ाया जाता है, और ऐगेरोस प्लग करने के लिए स्थानांतरित नहीं किया है । इसके अतिरिक्त, 8-well चैंबर के लिए 8 शर्तों का परीक्षण या एक ही प्रयोग में नियंत्रित किया जा करने के लिए अनुमति देता है । प्रयोग पर निर्भर करता है, यह जैसे (1) कोई डिम्बग्रंथि explants या कोशिकाओं के साथ कुओं, (2) केवल कोशिकाओं के साथ कुओं, या (3) डिम्बग्रंथि explants के साथ ही कुओं के रूप में नियंत्रण शामिल महत्वपूर्ण हो सकता है । क्योंकि नमूना तैयारी (सटीक मीडिया और ऐगेरोस एकाग्रता, मैट्रिक्स राशि, आदि) रन के बीच थोड़ा अलग है, स्थितियों की तुलना की जानी चाहिए जब वे एक ही स्लाइड पर अधिग्रहण कर रहे हैं ।

इसके अलावा प्रयोगों निर्धारित किया है कि एक ITO-लेपित स्लाइड ऊष्मायन के लिए सबसे अच्छा मंच था जब एक इस्पात मालदी थाली की तुलना में क्योंकि स्लाइड सेल राज्य और स्थिति के दृश्य सत्यापन के लिए अनुमति देता है । उदाहरण के लिए, ito स्लाइड का उपयोग कर, हम पुष्टि कर सकते है कि कोशिकाओं को सामांय आकारिकी है और कि वे अग्राज़ भर में समरूप वितरण बनाए रखने से पहले और सुखाना16निंनलिखित । स्लाइड भी जरूरत के रूप में फ्लोरोसेंट सेल लाइनों के समावेश के लिए अनुमति देगा । इसके अतिरिक्त, सुखाना से पहले चैंबर के हटाने के लिए ऐगेरोस प्लग की संपूर्णता बनाए रखने के लिए आवश्यक है । यदि स्लाइड 8 अच्छी तरह से पालन चैंबर के साथ शुष्क है, प्लास्टिक ऐगेरोस प्लग अलग खींचती है और प्लग में प्रमुख दरारें में परिणाम । चित्रा 5 समस्याओं का सामना करना पड़ रहा है जब चैंबर सुखाने से पहले नहीं हटा दिया है दर्शाता है ।

जब सेल आबादी का विश्लेषण, यह महत्वपूर्ण है कि स्थानिक संकल्प कम से ५० μm है करने के लिए ऊतक और सेलुलर बातचीत के छोटे आकार पर कब्जा शुरू करते हैं । छिड़काव मैट्रिक्स के साथ, यह 5 μm संकल्प को प्राप्त करने के लिए संभव है, लेकिन इस समग्र समय बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा इकट्ठा करने के लिए जबकि तुलनीय परिणाम उपज लंबा । स्थानिक संकल्प भी मालदी-तोम मास स्पेक्ट्रोमीटर में लेजर ध्यान केंद्रित करने की क्षमता पर निर्भर है ।

कुल मिलाकर, हम सबसे अच्छा coculture में छोटे अणुओं के आदान-प्रदान का पता लगाने के लिए इस स्लाइड सेटअप अनुकूलित किया है । इसलिए, डेटा विश्लेषण के दौरान हम आणविक सुविधाओं है कि केवल मौजूद है या काफी अधिक प्रचुर मात्रा में एक ऐगेरोस प्लग में है कि ब्याज की जैविक हालत का प्रतिनिधित्व करता है की मांग कर रहे हैं । क्योंकि स्लाइड पर सात अंय नियंत्रणों और शर्तों को शामिल करने का विकल्प है, यह नेत्रहीन और आईएमएस डेटा के लिए डिज़ाइन किए गए सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर की सहायता से प्राप्त किया जा सकता है । हमारी dereplication प्रक्रिया स्थानिक प्रासंगिक लोगों का पता लगाने के बाद व्यापक इतना है कि हम एक उच्च संकल्प बड़े पैमाने पर और फ़्रेग्मेंटेशन डेटा प्राप्त कर सकते हैं । पहला कदम है कि हम के लिए ले लो के लिए एक डेटाबेस के माध्यम से नाममात्र मास की एक खोज है, इस तरह के मानव metabolome डेटाबेस (hmdb) स्तनधारी चयापचयों के लिए के रूप में । डेटाबेस में अणुओं की सबसे प्रयोगात्मक डेटा की तुलना के लिए कई तकनीकों को कवर स्पेक्ट्रा की एक महत्वपूर्ण संख्या है । एक बार नाममात्र जनता अपने ख्यात पहचान के रूप में संभावित उंमीदवार अणुओं है, यह अक्सर ऐसे एमएस/एमएस विखंडन, यूवी प्रोफाइल, और उंमीदवार संरचना और एक मानक के बीच अवधारण समय के रूप में भौतिक डेटा की तुलना संभव है ।

उदाहरण के लिए, डिम्बग्रंथि ऊतक के साथ इनक्यूबाटेड ट्यूमोर्जेनिक FTE कोशिकाओं की coculture में norepinephrine की पहचान है कि इस आईएमएस विधि इस प्रणाली16से प्रासंगिक छोटे अणुओं का पता लगाने में सक्षम है पुष्टि की है । चित्रा 6 आईएमएस चलाता है की संवेदनशीलता को दर्शाया गया है, डेटा के प्रकार एक अविभाजित मंडलों के लिए प्रोटोकॉल का पालन करके उंमीद कर सकते है दिखा । चित्रा 7 इसी तरह विभाजित चैंबर सेटअप के लिए प्रतिनिधि डेटा से पता चलता है.

Figure 1
चित्र 1: अविभाजित सहसंस्कृति के नमूना तैयार करने के लिए कार्यप्रवाह । (क) इटो-कोटेड स्लाइड के प्रवाहकीय पक्ष के लिए 8-कूप चैम्बर का अवपालन करें । (ख) कुसंस्कृतिक दशाओं के लिए कुओं के मध्य में आधी जगह पर आधा स्थान । (ग) सीधे कुओं में ३०० μl का आगरस/सेल सस्पेंशन जोड़ें । सुनिश्चित करें कि वहां कोई हवाई बुलबुले रहे है और यह कि अंडाशय अच्छी तरह के केंद्र में रहता है । यदि पाइपयुक्त ऐगेरोस अंडाशय परेशान, धीरे से यह केंद्र के लिए यह ऐगेरोस cools से पहले पिपेट टिप का उपयोग करें । (घ) इंक्यूबेशन के चार दिनों के बाद (या अंयथा अनुकूलित समय) स्लाइड से 8-well चेंबर निकालें । यदि ऐगेरोस चैंबर से जुड़ा रहता है, धीरे से एक रंग का उपयोग कर चैंबर से ऐगेरोस प्लग अलग और स्लाइड पर यह स्थिति । आगरसे स्लाइड का पालन नहीं होगा, इसलिए आगे बढ़ना आसान होगा । स्लाइड के प्रत्येक कोने पर ' X ' आरेखित करें और एक फ़ोटो लें । (ङ) 4 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस ओवन में स्लाइड शुष्क, ९० ° प्रत्येक घंटे घूर्णन । Agarose पूरी तरह से शुष्क होना चाहिए और स्लाइड पर फ्लैट लेट चाहिए । (च) स्लाइड करने के लिए एक स्प्रेयर या एयरब्रश के माध्यम से पसंद के मैट्रिक्स लागू करें । मैट्रिक्स परत पीले रंग के रूप में दिखाई जानी चाहिए । १,२०० dpi पर किसी स्कैनर पर स्लाइड स्कैन करें और मालदी-TOF MS विश्लेषण के लिए अंशकों या मानकों को जोड़ें । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2: विभाजित सहसंस्कृति के नमूना तैयार करने के लिए कार्यप्रवाह। (क) मीडिया बेसिन (~ 13 मिमी) से बाहर टैब्स काटें और सुनिश्चित करें कि पक्ष सीधे हैं । (ख) आईटो-कोटेड स्लाइड के अनुचालकीय पक्ष के लिए 8-कूप चैम्बर संलग्न करें । (ग) विकर्ण को कुओं में विभक्त करें । (घ) डिवाइडर के एक तरफ करने के लिए ऐगेरोस में १५० μl सेल संस्कृति जोड़ें, ऐगेरोस शांत करने के लिए अनुमति देते हैं, और डिवाइडर को हटा दें । (ङ) डिम्बग्रंथि को खाली कूप अर्ध के मध्य में डालिए और १५० μl के साथ मीडिया और अग्से के निलंबन से ढक दीजिये । यह आंकड़ा Zink एट अल. २०१८16से अनुमति के साथ reproduced । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: ऐगेरोस प्लग में झुर्रियां । अगर स्लाइड भी लंबे समय के लिए ओवन में छोड़ दिया जाता है, तो झुर्रियों को अगरसे प्लग में फार्म कर सकते हैं । यह नमूना मालदी-TOF MS विश्लेषण से नहीं रोकता है, लेकिन डेटा की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है । (क) इष्टतम रूप से सूख जाने वाली स्लाइड की छवि । डिम्बग्रंथि ऊतक आसपास के सभी ऐगेरोस पूरी तरह से सपाट और झुर्रियों से मुक्त है, आईएमएस विश्लेषण के लिए पर्याप्त क्षेत्र प्रदान । (ख) नमूना भर में झुर्रियों वाली होती है के साथ एक खराब सूखे स्लाइड की छवि । यह आंकड़ा Zink एट अल. २०१८16से अनुमति के साथ reproduced । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: ऊतक की स्थिति । सूखे नमूने में ऊतक की स्थिति डेटा अधिग्रहण के लिए बहुत महत्वपूर्ण है । (क) विभाजित कक्षों के सूखे आग्रासे प्लग, कूप के आधे भाग के मध्य में अंडाशय दर्शाते हैं, जो इमेजिंग के लिए इष्टतम है । (ख) विभक् त कक्ष के सूखे आग्रसे प्लग जहां अंडाशय ऊष्मायन या सुखाने के लिए केन्द्रित नहीं था डिम्बग्रंथि ऊतक अग्ने प्लग की परिधि पर सूख गया, और इसलिए विश्लेषण नहीं किया जा सकता. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: कक्ष के साथ स्लाइड सुखाने । जब स्लाइड ओवन में स्थापित करने से पहले चैंबर हटाने के लिए, ऐगेरोस प्लग प्लास्टिक से खुद को और अधिक दृढ़ता से पालन करें और गर्मी में अलग खींचने के लिए शुरू करते हैं । यह agarose में गंभीर दरारें में परिणाम है, और स्लाइड खुद को थोड़ा आसंजन । दरारें यह बड़े आईएमएस विश्लेषण के लिए अनुकूल नहीं हैं । शीर्ष: 2 एच के बाद स्लाइड 8-well चैंबर पालन के साथ सुखाना । सभी ऐगेरोस प्लग लेकिन दो के लिए आसंजन के कारण केंद्र के माध्यम से टूट 8-well चैंबर । नीचे: 8-well चैंबर को हटाने के बाद स्लाइड । केवल एक ऐगेरोस प्लग स्लाइड पर बने रहे । यह आंकड़ा Zink एट अल. २०१८16से अनुमति के साथ reproduced । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: अद्वितीय संकेतों का पता लगाना । जब 8 शर्तों की तुलना, यह संकेत है कि एक ही शर्त के लिए अद्वितीय है का पता लगाने के लिए संभव है । (क) सूखी स्लाइड छवि का उपयोग मालदी-तोकी मास स्पेक्ट्रोमीटर को सिखाने के लिए किया जाता है, जो क्षेत्र को प्रतिबिम्ब के लिए होता है । यहां हम ५० μm पर आईएमएस के लिए डिम्बग्रंथि ऊतक के आसपास छोटे क्षेत्रों का चयन किया है । (ख) एक ही स्लाइड पर सभी आठ बनाम एक हालत में upregulated है कि एक m/z संकेत की एक प्रतिनिधि छवि । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7: विभाजित चैंबर सेटअप से प्रतिनिधि डेटा । डिम्बग्रंथि ऊतक सफेद में उल्लिखित है. M/z ११२ अंडाशय से युक्त कूप के आधे भाग से स्रावित होता है । आईएमएस ५० μm पर प्रदर्शन किया गया था । यह आंकड़ा Zink एट अल. २०१८16से अनुमति के साथ reproduced । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

वहां सबूत है कि hgsoc12,17,18में norepinephrine की भूमिका को फंसाने के एक बढ़ती शरीर है, और इस तकनीक को और अधिक यंत्रवत जानकारी का योगदान दिया है । एक ही स्लाइड पर मौजूद कम से आठ जैविक स्थितियों के साथ, विधि जीन और सेल विशिष्टता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक एकल आईएमएस चलाने में मीडिया नियंत्रण के रूप में जैविक नियंत्रण के लिए खाते कर सकते हैं । जबकि विधि hgsoc में प्राथमिक मेटास्टेसिस के एक मॉडल में छोटे अणुओं के आदान प्रदान का मूल्यांकन करने के लिए अनुकूलित किया गया था, किसी भी कोशिका या ऊतक प्रकार है कि ऐगेरोस में रखा जा सकता जैविक प्रश्नों और रोग राज्यों की एक विस्तृत विविधता का विश्लेषण करने के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है ।

प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक यह सुनिश्चित करना है कि ऊतक या कोशिका प्रकार एक दूसरे के करीब निकटता में है और ऐगेरोस प्लग के केंद्र में मौजूद हैं । एक और महत्वपूर्ण विचार पूरी स्लाइड के लिए सुखाने समय का अनुकूलन है । इस विधि डिम्बग्रंथि ऊतक, जो आसानी से सूख गया और जिसका छोटा आकार थोड़ा सुखाने जटिलताओं के परिणामस्वरूप का उपयोग कर अनुकूलित किया गया था । हालांकि, अंय ऊतकों, जैसे वसा के रूप में विभिंन संरचना के साथ, बहुत अलग सूख प्रोफाइल है और इसलिए अधिक व्यापक सुखाना अनुकूलन की आवश्यकता है । सूखने के बाद जैविक नमूना के लिए अनुकूलित किया गया है, शेष कार्यप्रवाह केवल ंयूनतम परिवर्तन की आवश्यकता होनी चाहिए ।

मास स्पेक्ट्रल अधिग्रहण के दौरान, यह संभावना है कि कई परियोजनाओं के छोटे अणुओं के अलावा अन्य यौगिक समूहों के विश्लेषण की आवश्यकता होगी. अधिग्रहण के लिए आईएमएस पैरामीटर और मैट्रिक्स के चयन, इसलिए, संबंधित लक्ष्य के लिए सबसे अच्छा डेटा उत्पंन करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, अगर यह जाना जाता है । इसके अतिरिक्त, हम केवल एक 50:50 CHCA के साथ सकारात्मक मोड में डेटा अधिग्रहण प्रदर्शन किया है: DHB मैट्रिक्स, लेकिन नकारात्मक मोड प्रयोगों मैट्रिक्स के एक अलग प्रकार पसंद कर सकते हैं, और बड़े अणुओं और अधिक आसानी से एक अलग मैट्रिक्स में पता चला होगा के रूप में अच्छी तरह से । विधि एक अलक्षित दृष्टिकोण में एक व्यापक जन श्रेणी के साथ या एक लक्षित खोज के लिए एक संकरा जन सीमा के साथ प्रयोग किया जा सकता है । उपरोक्त चर्चा विधि के मामले में, छोटे अणुओं ब्याज का लक्ष्य था क्योंकि ध्यान अणुओं है कि सेल और ऊतक के प्रतिनिधियों के बीच ऐगेरोस के माध्यम से विमर्श किया गया का पता लगाने के लिए गया था । यद्यपि हम आकार और संरचना के संदर्भ में सीमाओं का दावा नहीं कर सकते कि agarose के माध्यम से आंदोलन को बाधित, हमारे उद्देश्य के लिए छोटे अणुओं का पता लगाने गया था, तो हमारे मैट्रिक्स निर्णय और MALDI-TOF एमएस मापदंडों कि लक्ष्य के लिए अनुकूलित किया गया । भविष्य के प्रयोगों को लक्ष्य लिपिड और प्रोटीन है कि हमारे मूल अधिग्रहण विधि में याद किया गया हो सकता है विकसित किया जा रहा है ।

यौगिक वर्ग का पता लगाने की सीमा के अलावा, इस विधि भी की आवश्यकता है कि कोशिकाओं agarose के साथ संगत हो, और है कि ऊतक नमूना (यदि प्रयोग किया जाता है) के लिए एक आठ अच्छी तरह से चैंबर में फिट अनुकूलित किया जा । कुछ ऊतकों बड़े कुओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है अगर कम जैविक स्थितियों की तुलना के लिए आवश्यक हैं, लेकिन यह महत्वपूर्ण है कि चयनित ऊतक सुखाना4के बाद १०० से कम २०० μm की एक समान ऊंचाई के लिए सुखाने में सक्षम है । एकाधिक जैविक नमूनों का मूल्यांकन ऐसे ऊतक के साथ संचार में एक से अधिक सेल प्रकार के रूप में किया जा सकता है । क्योंकि नमूना तैयार करने के लिए स्थानिक अलग agarose आधारित सेल संस्कृतियों में सक्षम है, यह संभव है के लिए दृश्य प्रसार पैटर्न के आधार पर कोशिका संस्कृति के स्रोत को कल्पना एम/

आईएमएस का उपयोग करने के लिए मानव नमूनों या ट्रांसजेनिक माउस मॉडल से ऊतक वर्गों का अध्ययन ऊतकों की जटिलता recapitulates. हालांकि, मानव नमूनों को प्राप्त करना मुश्किल है, जो नाटकीय रूप से रोग प्रगति की तरह बातें अध्ययन करने की क्षमता को सीमित कर सकते हैं । ट्रांसजेनिक माउस मॉडलों से ऊतक अच्छी तरह से परिभाषित समय बिंदुओं पर एकत्र किया जा सकता है । लेकिन, माउस मॉडल समय लगता है और विकसित करने के लिए महंगा हो सकता है । इसके अलावा, इन मॉडलों के दोनों में वास्तविक ऊतकों की पूरी जटिलता यह मुश्किल सही विशिष्ट कोशिकाओं या ऊतकों के बीच संचार का मूल्यांकन करने के लिए कर सकते हैं । इसके विपरीत, विधि यहां प्रस्तुत एक उच्च अनुकूलनीय है । संचार में अंतर की जांच करने के लिए एक ही स्लाइड पर विभिंन ऊतकों या कोशिका रेखाओं को सहचित्रित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, सामांय कोशिकाओं या एक ही ऊतक से ट्यूमर कोशिकाओं को एक ही स्लाइड पर सभ्य किया जा सकता है परिवर्तन के कारण मतभेदों को समझते हैं । समय पाठ्यक्रम अध्ययन कोशिकाओं, या छोटे अणु inhibitors और/या RNAi विशिष्ट संकेतन अणुओं या चयापचयों की भूमिका की जांच करने के लिए शामिल किया जा सकता है के बीच उपंयास संकेत cascades उजागर कर सकते हैं । हमें विश्वास है कि इन संभावनाओं के संदर्भों की एक विस्तृत विविधता में सेल के लिए सेल संचार के अध्ययन के लिए इस तकनीक उपयोगी बना देगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

अनुदान शिकागो सामुदायिक ट्रस्ट (C-०७६) (L.M.S.) में Searle धन से समर्थन के साथ शिकागो बायोमेडिकल कंसोर्टियम द्वारा प्रदान की गई थी; शिकागो स्टार्टअप फंड (L.M.S.) में इलिनोइस विश्वविद्यालय; डिम्बग्रंथि कैंसर रिसर्च फंड एलायंस (एमडी) से ५४३२९६ अनुदान; और UG3 ES029073 (J.E.B.) और राष्ट्रीय ट्रांसलेशनल साइंसेज, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, अनुदान UL1TR002003 (JEB & LMS) के माध्यम से आगे बढ़ाने के लिए केंद्र द्वारा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Falcon tubes Denville C1017-O To collect cells
8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) Millipore PEZGS0816 Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34998-4L Solvent for sprayed matrix
Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) Fisher 10-022-CV Cell culture media
Autoflex speed MALDI-TOF LRF Bruker For IMS data analysis
Centrifuge Eppendorf 5810 R To collect cells and remove supernatant
CHCA Matrix Bruker Daltonic 8201344 Matrix sprayed onto dried slide
DHB Matrix Bruker Daltonic 8201346 Matrix sprayed onto dried slide
Disposable Scalpels Fisher 22-079-707 For removal of the ovaries
Dissecting Scissors Fisher 13-804-6 For removal of the ovaries
DMEM Media Gibco 11995-065 Media mixed with agarose
epidermal growth factor Peprotech Inc. 100-15 Cell culture media supplement
Eppendorf tubes Genesee Scientific 22-282 For agarose aliquots
Estradiol-17β Simga-Aldrich E2758 Cell culture media supplement
Fetal Bovine Serum Denville fb5001 Cell culture media supplement
FlexControl 3.4 Bruker Daltonic IMS data acquisition software
FlexImaging 4.1 Bruker Daltonic IMS data analysis software
Forceps (fine) Fsiher 22-327379 For removal of the ovaries
Gentamycin Cellgro 30-005-CR Cell culture media supplement
Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) Sigma-Aldrich 11074547001 Cell culture media supplement
ITO-coated slide Bruker 8237001 Platform for co-culture incubation
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 11415064 Media used during tissue dissection
L-glutamine Gibco 25030-081 Cell culture media supplement
Low-melting agarose Sigma-Aldrich A9414-10G Mixed with media for plating
Media basin Corning 4870 Used to cut plastic dividers for divided chambers
Penicillin-streptomycin Gibco 15140-122 Cell culture media supplement
Peptide Calibration Standard Bruker Daltonic 8206195 Calibrant for medium mass range
Phophorus red Sigma-Aldrich 343-242-5G Calibrant for low mass range
SCiLS Lab 2015 Bruker Daltonic IMS data statistical analysis
Surgical Forceps (blunt) Fisher 08-875-8B For removal of the ovaries
TFA Fisher Technologies A116-50 Added to matrix solution
TM Sprayer HTX Technologies For applying matrix

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References

  1. Paine, M. R., et al. Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model. PLoS One. 11 (5), e0154837 (2016).
  2. Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating Metabolic Exchange with Imaging Mass Spectrometry. Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).
  3. Li, H., Hummon, A. B. Imaging Mass Spectrometry of Three-Dimensional Cell Culture Systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
  4. Yang, J. Y., et al. Primer on Agar-Based Microbial Imaging Mass Spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
  5. Coscia, F., et al. Integrative Proteomic Profiling of Ovarian Cancer Cell Lines Reveals Precursor Cell Associated Proteins and Functional Status. Nature Communications. 7, 12645 (2016).
  6. Labidi-Galy, S. I., et al. High Grade Serous Ovarian Carcinomas Originate in the Fallopian Tube. Nature Communications. 8 (1), (2018).
  7. Klinkebiel, D., Zhang, W., Akers, S. N., Odunsi, K., Karpf, A. R. DNA Methylome Analyses Implicate Fallopian Tube Epithelia as the Origin for High-Grade Serous Ovarian Cancer. Molecular Cancer Research. 14 (9), 787-794 (2016).
  8. Falconer, H., Yin, L., Gronberg, H., Altman, D. Ovarian Cancer Risk After Salpingectomy: A Nationwide Population-Based Study. JNCI Journal of the National Cancer Institute. 107 (2), dju410 (2015).
  9. Dean, M., Davis, D. A., Burdette, J. E. Activin A Stimulates Migration of the Fallopian Tube Epithelium, an Origin of High-Grade Serous Ovarian Cancer, through Non-Canonical Signaling. Cancer Letters. 391, 114-124 (2017).
  10. King, S. M., Burdette, J. E. Evaluating the Progenitor Cells of Ovarian Cancer: Analysis of Current Animal Models. BMB Reports. 44 (7), 435 (2011).
  11. Reznik, E., et al. Landscape of Metabolic Variation across Tumor Types. Cell Systems. 6 (3), 301-313 (2018).
  12. Watkins, J. L., et al. Clinical Impact of Selective and Nonselective Beta-Blockers on Survival in Patients with Ovarian Cancer: Beta-Blockers and Ovarian Cancer Survival. Cancer. 121 (19), 3444-3451 (2015).
  13. Lutgendorf, S. K., et al. Stress-Related Mediators Stimulate Vascular Endothelial Growth Factor Secretion by Two Ovarian Cancer Cell Lines. Clinical Cancer Research. 9 (12), 4514-4521 (2003).
  14. Sood, A. K. Stress Hormone-Mediated Invasion of Ovarian Cancer Cells. Clinical Cancer Research. 12 (2), 369-375 (2006).
  15. Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous Matrix Deposition on Dried Agar for MALDI Imaging Mass Spectrometry of Microbial Cultures. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
  16. Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Imaging Mass Spectrometry Reveals Crosstalk between the Fallopian Tube and the Ovary That Drives Primary Metastasis of Ovarian Cancer. ACS Central Science. 4 (10), 1360-1370 (2018).
  17. Armaiz-Pena, G. N., et al. Src Activation by β-Adrenoreceptors Is a Key Switch for Tumour Metastasis. Nature Communications. 4, 1403 (2013).
  18. Choi, M. J., et al. HTERT Mediates Norepinephrine-Induced Slug Expression and Ovarian Cancer Aggressiveness. Oncogene. 34 (26), 3402 (2015).

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Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (146), e59490, doi:10.3791/59490 (2019).

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