Dit protocol beschrijft de optimalisatie procedures in een virus-gebaseerde Dual fluorescentie-gelabelde tumor xenotransplantaatmodellen is model met behulp van larvale zebravis als gastheren. Dit heterogene xenotransplantaatmodellen is-model bootst de weefsel samenstelling van de micro-omgeving van pancreaskanker na in vivo en dient als een preciezer hulpmiddel voor het beoordelen van geneesmiddel responsen in gepersonaliseerde zpdx (Zebrafish patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen is) modellen.
Patiënt-afgeleide tumor xenotransplantaatmodellen is (PDX) en cel-afgeleide tumor xenotransplantaatmodellen is (CDX) zijn belangrijke technieken voor Preklinische beoordeling, medicatie begeleiding en fundamentele kanker onderzoeken. Generaties PDX-modellen in traditionele hostmuizen zijn tijdrovend en werken slechts voor een klein deel van de monsters. Onlangs is zebravis PDX (zpdx) ontstaan als een uniek hostsysteem, met de kenmerken van kleinschalige en hoge efficiëntie. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde methodologie voor het genereren van een dubbel fluorescentie-gelabeld tumor xenotransplantaatmodellen is-model voor vergelijkende chemotherapie-evaluatie in zpdx-modellen. Tumor cellen en fibroblasten werden verrijkt met vers geoogst of bevroren pancreaskanker weefsel onder verschillende cultuuromstandigheden. Beide celgroepen werden gelabeld door lentivirus dat groene of rode fluorescentie eiwitten uitdrukt, evenals een gen BCL2L1dat anti-apoptosis heeft. De getransfeerde cellen werden voorgemengd en geïnjecteerd in de 2 DPF larvale zebravis die vervolgens werden gefokt in gemodificeerde E3 medium op 32 ° c. De xenotransplantaatmodellen is modellen werden behandeld door chemotherapie drugs en/of BCL2L1 inhibitor, en de vicapaciteiten van beide tumorcellen en fibroblasten werden gelijktijdig onderzocht. Samenvattend, dit protocol stelt onderzoekers in staat om snel een grote hoeveelheid zPDX modellen met een heterogene tumor micro-omgeving te genereren en biedt een langere observatie-venster en een preciezere kwantificerings bij het beoordelen van de efficiëntie van drugs kandidaten.
Precision oncologie streeft naar het vinden van de meest gunstige therapeutische strategieën voor individuele patiënt1. Momenteel worden talrijke preklinische modellen zoals in vitro primaire kweek, in vitro organoïde Culture2en patiënt-afgeleide xenotransplantaten (PDX) bij muizen voor of na de organoïde cultuur voorgesteld voor diagnose en om de potentiële therapeutische keuzes3. PDX-model dat wordt gegenereerd door de injectie van menselijke primaire kankercellen in immuungecompromitteerde muizen, is een van de meest veelbelovende hulpmiddelen voor gepersonaliseerde geneesmiddelen screening in klinische oncologie3,4. In tegenstelling tot de gekweekte cellijn in vitro, de PDX modellen meestal behouden de integriteit en heterogeniteit van de in vivo tumor omgeving, beter nabootsen van de diversiteit en idiosyncratische kenmerken van verschillende tumor patiënten, en daarom, kan voorspellen de potentiële medische uitkomst van patiënten4. De generatie van PDX-modellen in muizen vereist echter een hoge kwaliteit patiënt monsters en maanden tijd om voldoende cellen en modellen te verzamelen voor experimenten met meerdere groepen, en de cellulaire/genetische samenstellingen van de xenotransplantaatmodellen is kunnen afwijken van die van de oorspronkelijke debiopsie van de patiënt. Het succespercentage voor het vaststellen van model muizen PDX is ook laag, waardoor het moeilijk is om in de klinische praktijk breed te worden uitgevoerd. Voor de patiënten die snel gevorderde kankers zoals pancreaskanker dragen, kunnen ze niet tijdig waardevolle informatie van de PDX-experimenten verkrijgen.
In de afgelopen jaren, zebravis is gemeld dat potentiële hosts voor niet alleen CDX (cel-afgeleide tumor xenograft) modellen, maar ook PDX modellen5,6,7,8,9, 10. als een gewervelde model dier, zebravis herbergt voldoende gelijkenissen met zoogdieren in zowel genetica en fysiologie, met twee belangrijke voordelen: transparantie en kleine in maat11. Zebravis is ook zeer vruchtbaarheid, en honderden ingeteelde larven kunnen worden verkregen binnen een paar dagen vanaf één paar volwassenen12. Verschillende studies hebben gebruikt zebravis voor het genereren van zowel transgene en xenotransplantaatmodellen is modellen van kanker ziekten13,14. In vergelijking met muizen xenotransplantaten, zebravis xenotransplantaten toestaan tracking bij een enkele celresolutie. Een bepaalde hoeveelheid menselijk weefsel is in staat om honderden zebravis PDX-modellen (zpdxs) te genereren, terwijl het mogelijk alleen volstaat om een paar muizen PDX-modellen15,16te genereren. Behalve, de zebravis larven op 2-5 DPF al ontwikkelen complete bloedsomloop en metabole organen zoals lever en nieren, maar niet het immuunsysteem17, terwijl de overgebleven dooier SAC is een natuurlijke 3D-medium, ideaal voor drug screening, drug resistentie tests en tumor migratie observaties6,18,19,20,21.
Met een ultieme poging om zPDX te gebruiken als screening/testplatform voor klinisch gebruik, beschrijven we hier een geoptimaliseerd voorstel voor het zPDX-model van pancreaskanker, waarmee de in vivo kandidaatgeneesmiddelen beoordeling binnen korte tijd met minder cellen tegen lagere kosten mogelijk is. Vergeleken met de eerdere referenties over zpdx6,9,10, introduceerden we verschillende optimalisaties om het systeem realiseerbaar en betrouwbaarder te maken voor klinische gepersonaliseerde diagnoses: 1) verschillende cellen vooraf sorteren groepen in de primaire tumorweefsels en stabiliseert primaire cellen voor een week voor verdere experimenten; 2) labelen van de menselijke cellen en verbetering van de levensvatbaarheid van de cel in xenotransplantaatmodellen is via lentivirus gebaseerde genetische modificatie; 3) het optimaliseren van de zebravis cultuur conditie in beide voedingssupplementen (glucose en glutamine) en temperatuur; 4) kwantificeren van de Drug reacties van verschillende celtypen op een vergelijkende manier. We hebben ook wijzigingen aangebracht in de injectie oplossing door verschillende aanvullende materialen toe te voegen. In totaal bieden deze verbeteringen de mogelijkheid om snel een meer patiënt-achtige xenotransplantaatmodellen is in zebravis-hosts te genereren die kan worden gebruikt als een betrouwbaar hulpmiddel om de respons van kandidaatmedicijnen te beoordelen.
Zowel de PDX-als de CDX-modellen zijn vitale platformen op het gebied van tumor biologie22, en de kritieke stap van een succesvolle Inter-species transplantatie is het verbeteren van het voortbestaan van de xenograft. Onlangs hebben sommige studies aangetoond dat voorbijgaande expressie van BCL2L1 (BCL-XL) of BCL2 de levensvatbaarheid van menselijke embryonale stamcellen bij muizen hosts aanzienlijk kan verbeteren zonder de celidentiteiten en lot23</s…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door National Natural Science Foundation van China 81402582, Natural Science Foundation van Shanghai 12DZ2295100, 14YF1400600 en 18ZR1404500
DMEM | GIBCO | C11995500BT | |
FBS | Hyclone | sv30087.03 | |
Y-27632 | Cliniscience | Y0503 | Rho kinase inhibitor |
Primocin | invivogen | ant-pm-1 | an antibiotic for primary cell cultures |
Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
Nicotinamide | Sigma | N3376 | |
penicillin streptomycin | GIBCO | 15140122.00 | |
phosphate buffer (PBS) | GIBCO | C10010500CP | |
HBSS | GIBCO | 14170112.00 | |
collagenase type IV | GIBCO | 17104019.00 | |
hyaluronidase | Sigma | H3884 | |
DnaseⅠ | Sigma | D5025 | |
insulin | Sigma | I9278 | |
b-FGF | GIBCO | PHG0264 | |
EGF | GIBCO | PHG0314 | |
pancreatic cancer fibroblasts inhibitor | CHI Scientific | FibrOUT | |
0.45 μm sterile filter | Millipore | SLHV033RB | |
concentration column | Millipore | Millipore UFC910008 | Concentrate the virus |
polybrene | Sigma | H9268 | |
Hyaluronic Acid Sodium Salt | Sigma | H7630 | |
L-glutamine | GIBCO | 21051024.00 | |
gemcitabine | Gemzan | ||
methylcellulose | Sigma | M0262 | |
Navitoclax(ABT-263) | Selleck | S1001 | Bcl-xL inhibitor |
Equipment | |||
Microinjector | NARISHIGE | ||
stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
Confocal Microscope | LEICA | SP8 | 0.00 |