इस प्रोटोकॉल मेजबान के रूप में लार्वा ज़ेब्राफ़िश का उपयोग कर एक वायरस आधारित दोहरी फ्लोरोसेंट लेबल ट्यूमर exograft मॉडल में अनुकूलन प्रक्रियाओं का वर्णन करता है। इस विषम xenograft मॉडल vivo में अग्नाशय के कैंसर microenvironment के ऊतक संरचना mimics और व्यक्तिगत zPDX में दवा प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए एक और अधिक सटीक उपकरण के रूप में कार्य करता है (जेब्राफ़िश रोगी व्युत्पन्न xenograft) मॉडल.
रोगी व्युत्पन्न ट्यूमर xenograft (PDX) और सेल व्युत्पन्न ट्यूमर xenograft (CDX) पूर्व नैदानिक आकलन, दवा मार्गदर्शन और बुनियादी कैंसर शोध के लिए महत्वपूर्ण तकनीक हैं. पारंपरिक मेजबान चूहों में PDX मॉडल की पीढ़ियों समय लेने वाली हैं और केवल नमूनों का एक छोटा सा अनुपात के लिए काम कर रहे. हाल ही में, ज़ेब्राफ़िश PDX (zPDX) एक अद्वितीय मेजबान प्रणाली के रूप में उभरा है, छोटे पैमाने पर और उच्च दक्षता की विशेषताओं के साथ. यहाँ, हम zPDX मॉडल में तुलनात्मक रसायन चिकित्सा आकलन के लिए एक दोहरी फ्लोरोसेंट लेबल ट्यूमर xenograft मॉडल पैदा करने के लिए एक अनुकूलित पद्धति का वर्णन. ट्यूमर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट्स विभिन्न संस्कृति की स्थिति में ताजा फसल या जमे हुए अग्नाशय के कैंसर के ऊतकों से समृद्ध थे। दोनों कोशिका समूहों को lentivirus द्वारा हरे या लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के साथ-साथ एक एंटी-एपोप्टोसिस जीन BCL2L1द्वारा लेबल किया गया था। ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं को पहले से मिश्रित किया गया था और 2 डीपीएफ लार्वा जेब्राफ़िश में सह-इंजेक्शन किया गया था जिसे तब संशोधित ई 3 माध्यम में 32 डिग्री सेल्सियस में पैदा किया गया था। xenograft मॉडल रसायन चिकित्सा दवाओं और / या BCL2L1 अवरोध करनेवाला द्वारा इलाज किया गया, और दोनों ट्यूमर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट्स की viabilities एक साथ जांच की गई. सारांश में, इस प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को जल्दी से एक विषम ट्यूमर microenvironment के साथ zPDX मॉडल की एक बड़ी राशि उत्पन्न करने के लिए अनुमति देता है और एक लंबे समय तक अवलोकन खिड़की और दवा उम्मीदवारों की दक्षता का आकलन करने में एक और अधिक सटीक परिमाण प्रदान करता है.
प्रेसिजन ऑन्कोलॉजी व्यक्तिगत रोगी1के लिए सबसे अधिक लाभकारी चिकित्सीय रणनीतियों को खोजने के लिए करना है। वर्तमान में, कई पूर्व नैदानिक मॉडल जैसे इन विट्रो प्राथमिक संस्कृति, इन विट्रो ऑर्गनॉइड संस्कृति2, और रोगी व्युत्पन्न जेनोग्रैफ्ट्स (पीडीएक्स) चूहों में पहले या बाद में ऑर्गनॉइड संस्कृति निदान के लिए और स्क्रीन/ चिकित्सीय विकल्प3| प्रतिरक्षा समझौता चूहों में मानव प्राथमिक कैंसर कोशिकाओं के इंजेक्शन द्वारा उत्पन्न PDX मॉडल, नैदानिक ऑन्कोलॉजी में व्यक्तिगत दवा स्क्रीनिंग के लिए सबसे होनहार उपकरणों में से एक है3,4. इन विट्रो में सुसंस्कृत सेल लाइन के विपरीत, PDX मॉडल आमतौर पर अखंडता और विवो ट्यूमर वातावरण की विषमता की रक्षा, बेहतर विविधता और विभिन्न ट्यूमर रोगियों की विलक्षण विशेषताओं नकल, और इसलिए, भविष्यवाणी कर सकते हैं रोगियों के संभावित चिकित्सा परिणाम4| हालांकि, चूहों में PDX मॉडल की पीढ़ी उच्च गुणवत्ता रोगी के नमूने और समय के महीनों की आवश्यकता के लिए पर्याप्त कोशिकाओं और बहु समूह प्रयोगों के लिए मॉडल इकट्ठा, और विदेशी के सेलुलर / रोगीकी बायोप्सी . चूहों PDX मॉडल की स्थापना के लिए सफलता की दर भी कम है, यह मुश्किल मोटे तौर पर नैदानिक अभ्यास में लागू किया जा करने के लिए कर रही है. अग्नाशय के कैंसर की तरह तेजी से प्रगति कैंसर ले जाने के रोगियों के लिए, वे समय में PDX प्रयोगों से बहुमूल्य जानकारी प्राप्त करने में सक्षम नहीं हो सकता है.
पिछले कुछ वर्षों में, ज़ेब्राफ़िश न केवल CDX (सेल व्युत्पन्न ट्यूमर xenograft) मॉडल के लिए संभावित मेजबान होने की सूचना दी गई है, लेकिन यह भी PDX मॉडल5,6,7,8,9, 10.एक कशेरुकी मॉडल जानवर के रूप में, जेब्राफ़िश आनुवंशिकी और शरीर क्रिया विज्ञान दोनों में स्तनधारियों के साथ पर्याप्त समानताएं बंदरगाह, दो महत्वपूर्ण लाभ के साथ: पारदर्शिता और आकार11में छोटे . ज़ेब्राफ़िश भी अत्यधिक fecundity है, और वयस्कों की एक जोड़ी12से कुछ ही दिनों के भीतर inbred लार्वा के सैकड़ों प्राप्त किया जा सकता है. अनेक अध्ययनों में जेब्राफिश को कैंसर रोगों केट्रांसजेनिक और एक्सोग्रेफ्ट दोनों मॉडल तैयार करने के लिए नियुक्त किया गयाहै. चूहों की तुलना में xenografts, ज़ेब्राफ़िश xenografts एकल सेल संकल्प पर ट्रैकिंग की अनुमति देते हैं. मानव ऊतकों की एक निश्चित राशि ज़ेब्राफ़िश PDX मॉडल (zPDXs) के सैकड़ों पैदा करने में सक्षम है, जबकि केवल चूहों PDX मॉडल15,16के एक जोड़े को उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त हो सकता है. इसके अलावा, 2-5 dpf पर ज़ेब्राफ़िश लार्वा पहले से ही पूर्ण संचार प्रणाली और यकृत और गुर्दे जैसे चयापचय अंगों का विकास, लेकिन प्रतिरक्षा प्रणाली17नहीं, जबकि शेष जर्दी थैली एक प्राकृतिक 3 डी माध्यम है, दवा स्क्रीनिंग के लिए आदर्श, दवा प्रतिरोध परीक्षण और ट्यूमर प्रवास टिप्पणियों6,18,19,20,21.
नैदानिक उपयोग के लिए एक स्क्रीनिंग / परीक्षण मंच के रूप में zPDX का उपयोग करने के लिए एक अंतिम प्रयास के साथ, यहाँ, हम अग्नाशय के कैंसर के zPDX मॉडल के लिए एक अनुकूलित प्रस्ताव का वर्णन है, जो एक कम समय के भीतर vivo उम्मीदवार दवा मूल्यांकन में कम लागत पर कम कोशिकाओं का उपयोग करने की अनुमति देता है. zPDX6,9,10के बारे में पिछले संदर्भ की तुलना में, हम प्रणाली और अधिक व्यावहारिक और नैदानिक व्यक्तिगत निदान के लिए विश्वसनीय बनाने के लिए कई अनुकूलन शुरू की: 1) पूर्व विभिन्न सेल की तरह प्राथमिक ट्यूमर ऊतकों में समूहों और आगे के प्रयोगों से पहले एक सप्ताह के लिए प्राथमिक कोशिकाओं को स्थिर; 2) मानव कोशिकाओं लेबलिंग और lentivirus आधारित आनुवंशिक संशोधन के माध्यम से xenograft में सेल व्यवहार्यता बढ़ाने; 3) दोनों nutriment की खुराक (ग्लूकोज और glutamine) और तापमान में ज़ेब्राफ़िश संस्कृति हालत का अनुकूलन; 4) एक तुलनात्मक तरीके से विभिन्न सेल प्रकार की दवा प्रतिक्रियाओं की मात्रा निर्धारित. हम भी कई अनुपूरक सामग्री जोड़कर इंजेक्शन समाधान करने के लिए परिवर्तन किए हैं। कुल मिलाकर, उन सुधारों को जल्दी से एक और अधिक रोगी की तरह ज़ेब्राफ़िश मेजबान है कि उम्मीदवार दवाओं की प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है में xenograft उत्पन्न करने की संभावना प्रदान करते हैं.
दोनों PDX और CDX मॉडल ट्यूमर जीव विज्ञान22के क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्लेटफार्मों रहे हैं, और एक सफल अंतर प्रजातियों प्रत्यारोपण के महत्वपूर्ण कदम के लिए exograft के अस्तित्व में सुधार है. हाल ही में, कु…
The authors have nothing to disclose.
यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन 81402582, शंघाई 12D के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था 12D $2295100, 14YF1400600 और 18$R1404500
DMEM | GIBCO | C11995500BT | |
FBS | Hyclone | sv30087.03 | |
Y-27632 | Cliniscience | Y0503 | Rho kinase inhibitor |
Primocin | invivogen | ant-pm-1 | an antibiotic for primary cell cultures |
Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
Nicotinamide | Sigma | N3376 | |
penicillin streptomycin | GIBCO | 15140122.00 | |
phosphate buffer (PBS) | GIBCO | C10010500CP | |
HBSS | GIBCO | 14170112.00 | |
collagenase type IV | GIBCO | 17104019.00 | |
hyaluronidase | Sigma | H3884 | |
DnaseⅠ | Sigma | D5025 | |
insulin | Sigma | I9278 | |
b-FGF | GIBCO | PHG0264 | |
EGF | GIBCO | PHG0314 | |
pancreatic cancer fibroblasts inhibitor | CHI Scientific | FibrOUT | |
0.45 μm sterile filter | Millipore | SLHV033RB | |
concentration column | Millipore | Millipore UFC910008 | Concentrate the virus |
polybrene | Sigma | H9268 | |
Hyaluronic Acid Sodium Salt | Sigma | H7630 | |
L-glutamine | GIBCO | 21051024.00 | |
gemcitabine | Gemzan | ||
methylcellulose | Sigma | M0262 | |
Navitoclax(ABT-263) | Selleck | S1001 | Bcl-xL inhibitor |
Equipment | |||
Microinjector | NARISHIGE | ||
stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
Confocal Microscope | LEICA | SP8 | 0.00 |