Этот протокол описывает процедуры оптимизации в вирусной двойной флуоресценции помечены опухоли ксенотрансплантат модели с использованием личиночных зебр в качестве хостов. Эта неоднородная модель ксенотрансплантата имитирует состав тканей микроокружения рака поджелудочной железы in vivo и служит более точным инструментом для оценки лекарственных реакций в персонализированных моделях zPDX (зебрафиш пациента, полученных ксенотрансплантатом).
Пациент полученных опухоли ксенотрансплантат (PDX) и клеточной опухоли ксенотрансплантата (CDX) являются важными методами для доклинической оценки, лекарства руководства и основных исследований рака. Поколения моделей PDX у традиционных мышей-хозяев отнимают много времени и работают только на небольшую часть образцов. В последнее время зебрафиш PDX (zPDX) стала уникальной системой хоста, с характеристиками мелкомасштабной и высокой эффективности. Здесь мы описываем оптимизированную методологию для создания двойной модели ксенотранспланта опухоли с двойной флуоресценцией для сравнительной химиотерапии в моделях zPDX. Опухолевые клетки и фибробласты обогащались из свежесобранной или замороженной ткани рака поджелудочной железы в различных условиях культуры. Обе группы клеток были помечены лентивирусом, выражающим зеленые или красные флуоресцентные белки, а также антиапоптозным геном BCL2L1. Трансинфицированные клетки были предварительно смешаны и совместно введены в 2 dpf личильных зебры, которые затем были выведены в модифицированной среде E3 при 32 градусах Цельсия. Модели ксенотрансплантата лечились химиотерапевтическими препаратами и/или ингибитором BCL2L1, и одновременно исследовались возможности как опухолевых клеток, так и фибробластов. Таким образом, этот протокол позволяет исследователям быстро генерировать большое количество моделей zPDX с разнородной микросредой опухоли и обеспечивает более длинное окно наблюдения и более точную количественную оценку в оценке эффективности кандидатов на наркотики.
Точность онкологии стремится найти наиболее полезные терапевтические стратегии для отдельных пациентов1. В настоящее время, многочисленные доклинические модели, такие как в пробирке первичной культуры, в пробирке органоидной культуры2, и пациента полученных ксенотрансплантатов (PDX) у мышей до или после органоидной культуры предлагаются для диагностики и для проверки / оценки потенциала терапевтический выбор3. Модель PDX, генерируемая инъекцией первичных раковых клеток человека в иммунных мышей, является одним из наиболее перспективных инструментов для персонализированного скрининга наркотиков в клинической онкологии3,4. В отличие от культивируемой клеточной линии in vitro, модели PDX обычно сохраняют целостность и неоднородность опухолевой среды in vivo, лучше имитируя разнообразие и особенности различных опухолевых пациентов, и, следовательно, могут предсказать потенциальный медицинский исход пациентов4. Тем не менее, генерация моделей PDX у мышей требует высококачественных образцов пациентов и месяцев времени, чтобы собрать достаточное количество клеток и моделей для многогрупповых экспериментов, а клеточные/генетические композиции ксенотранспланта могут дрейфовать от исходных биопсии пациента. Уровень успеха для создания мышей PDX модель также низка, что затрудняет широкое внедрение в клинической практике. Для пациентов, перевозящих быстро прогрессирует рака, как рак поджелудочной железы, они не могут быть в состоянии получить ценную информацию из PDX экспериментов во времени.
В последние несколько лет, зебрафиш, как сообщается, потенциальные хозяева не только CDX (клеточная опухоль xenograft) модели, но и МОДЕЛИ PDX5,6,7,8,9, 10. Как позвоночных модели животных, зебра гавани достаточно общего с млекопитающими в генетике и физиологии, с двумя значительными преимуществами: прозрачность и небольшой размер11. Зебрафиш также очень плодовитость, и сотни инбредных личинок могут быть получены в течение нескольких дней из одной пары взрослых12. Несколько исследований использовали зебры для создания трансгенных и ксенотрансплантата модели онкологических заболеваний13,14. По сравнению с мышами ксенотрансплантатов, зебрафиш ксенотрансплантатов позволяют отслеживать в одном разрешении клеток. Определенное количество человеческих тканей способен генерировать сотни моделей зебры PDX (zPDXs), в то время как может быть достаточно только для создания нескольких мышей PDX модели15,16. Кроме того, личинки зебры при 2-5 dpf уже развивают сядочечные системы кровообращения и метаболические органы, такие как печень и почки, но не иммунная система17, в то время как оставшийся желтковый мешок является естественной 3D-средой, идеально подходит для скрининга наркотиков, наркотиков тесты на устойчивостьи наблюдения миграции опухоли 6,18,19,20,21.
С конечной попыткой использовать zPDX в качестве скрининга / тестирования платформы для клинического использования, здесь, мы описываем оптимизированное предложение для zPDX модель рака поджелудочной железы, которая позволяет in vivo кандидат оценки наркотиков в течение короткого времени, используя меньше клеток при меньших затратах. По сравнению с предыдущими ссылками о zPDX6,9,10, мы ввели несколько оптимизаций, чтобы сделать систему более осуществимой и надежной для клинической персонализированной диагностики: 1) предварительной сортировки различных клеток группы в первичных опухолевых тканях и стабилизация первичных клеток в течение одной недели до дальнейших экспериментов; 2) маркировка клеток человека и повышение жизнеспособности клеток в ксенотрансплантате с помощью лентивирусной генетической модификации; 3) оптимизация состояния культуры зебры как в пищевых добавках (глюкоза и глутамин) и температуре; 4) количественная оценка лекарственных реакций различных типов клеток в сравнительной манере. Мы также внесли изменения в инъекционное решение, добавив несколько дополнительных материалов. В целом, эти улучшения дают возможность быстро генерировать более терпеливый ксенотрансвант в хостах зебры, которые могут быть использованы в качестве надежного инструмента для оценки реакции кандидатов наркотиков.
Оба модели PDX и CDX являются жизненно важными платформами в области биологии опухоли22, и критический шаг успешной межвидовой трансплантации является улучшение выживания ксенотрансплантата. Недавно некоторые исследования показали, что переходное выражение BCL2L1 (BCL-XL…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая 81402582, Фондом естественных наук Шанхая 12D-2295100, 14YF1400600 и 18’1404500
DMEM | GIBCO | C11995500BT | |
FBS | Hyclone | sv30087.03 | |
Y-27632 | Cliniscience | Y0503 | Rho kinase inhibitor |
Primocin | invivogen | ant-pm-1 | an antibiotic for primary cell cultures |
Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
Nicotinamide | Sigma | N3376 | |
penicillin streptomycin | GIBCO | 15140122.00 | |
phosphate buffer (PBS) | GIBCO | C10010500CP | |
HBSS | GIBCO | 14170112.00 | |
collagenase type IV | GIBCO | 17104019.00 | |
hyaluronidase | Sigma | H3884 | |
DnaseⅠ | Sigma | D5025 | |
insulin | Sigma | I9278 | |
b-FGF | GIBCO | PHG0264 | |
EGF | GIBCO | PHG0314 | |
pancreatic cancer fibroblasts inhibitor | CHI Scientific | FibrOUT | |
0.45 μm sterile filter | Millipore | SLHV033RB | |
concentration column | Millipore | Millipore UFC910008 | Concentrate the virus |
polybrene | Sigma | H9268 | |
Hyaluronic Acid Sodium Salt | Sigma | H7630 | |
L-glutamine | GIBCO | 21051024.00 | |
gemcitabine | Gemzan | ||
methylcellulose | Sigma | M0262 | |
Navitoclax(ABT-263) | Selleck | S1001 | Bcl-xL inhibitor |
Equipment | |||
Microinjector | NARISHIGE | ||
stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
Confocal Microscope | LEICA | SP8 | 0.00 |