Bu protokol, ev sahibi olarak larva zebra balığı kullanarak virüs tabanlı çift floresan etiketli tümör xenograft modelinde optimizasyon prosedürlerini açıklar. Bu heterojen xenograft modeli Pankreatik kanser mikroçevre in vivo doku bileşimi taklit ve kişiselleştirilmiş zPDX içinde ilaç yanıtlarını değerlendirmek için daha hassas bir araç olarak hizmet vermektedir (zebrafish hasta tarafından türetilen xenograft) modelleri.
Hasta türevi tümör xenograft (PDX) ve hücre türevi tümör xenograft (CDX) preklinik değerlendirme, ilaç rehberlik ve temel kanser araştırmaları için önemli tekniklerdir. Geleneksel ana fareler içinde PDX modellerinin nesiller zaman alıcı ve sadece numunelerin küçük bir oranı için çalışıyor. Son zamanlarda, zebra balığı PDX (zpdx), küçük ölçekli ve yüksek verimlilik özellikleri ile benzersiz bir ana bilgisayar sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Burada, zPDX modellerinde karşılaştırmalı kemoterapi değerlendirmesi için çift floresan etiketli bir tümör xenograft modeli oluşturmak için optimize edilmiş bir metodolojisi tarif ediyoruz. Tümör hücreleri ve fibroblastlar, farklı kültür koşullarında taze hasat edilen veya dondurulmuş pankreas kanseri dokusundan zenginleştirilmiştir. Her iki hücre grubu, yeşil veya kırmızı floresan proteinlerin yanı sıra bir anti-apoptozis geni BCL2L1ifade eden Lentivirus tarafından etiketlenmiştir. Transferleştirilmiş hücreler, 32 °c ‘ de modifiye E3 ortamında yetiştirilen 2 DPF larva zebra balığı içine önceden karıştırılmış ve ortak enjekte edildi. Xenograft modelleri kemoterapi ilaçları ve/veya BCL2L1 inhibitörü ile tedavi edildi ve hem tümör hücrelerinin hem de fibroblastların canları aynı anda incelenmiştir. Özetle, bu protokol, araştırmacılar hızlı bir şekilde heterojen bir tümör mikroçevre ile zPDX modelleri büyük miktarda oluşturmak için izin verir ve daha uzun bir gözlem penceresi ve ilaç adaylarının verimliliğini değerlendirirken daha hassas bir nicel sağlar.
Hassas Onkoloji bireysel hasta için en yararlı terapötik stratejileri bulmayı amaçlamaktadır1. Şu anda, in vitro primer kültür, in vitro nevuslardır kültür2gibi sayısız preklinik model ve nevuslardır kültürden önce veya sonra farelerde hasta türevi xenograflar (PDX) teşhis için önerilen ve potansiyel olarak ekran/değerlendirme terapötik seçimler3. İnsan primer kanser hücrelerinin bağışıklık tehlikeye fareler içine enjeksiyon tarafından oluşturulan PDX modeli, klinik Onkoloji kişiselleştirilmiş ilaç taraması için en umut verici araçlardan biridir3,4. İn vitro kültürlü hücre hattının aksine, PDX modelleri genellikle in vivo tümör ortamının bütünlüğünü ve heterojenliğini korur, farklı tümör hastalarının çeşitliliğini ve idosynkratik özelliklerini daha iyi taklit eder ve bu nedenle Hastaların potansiyel tıbbi sonucu4. Ancak, fareler PDX modellerinin nesil yüksek kaliteli hasta örnekleri ve çoklu grup deneyleri için yeterli hücre ve model toplamak için ay zaman gerektirir ve xenograft hücresel/genetik kompozisyonlar orijinal bu drift olabilir hastanınbiyopsisi. Fare PDX modeli kurulması için başarı oranı da düşük, zor geniş klinik uygulamada uygulanması için yapma. Pankreas kanseri gibi hızla ilerlemiştir kanserleri taşıyan hastalar için, zaman içinde PDX deneylerinden değerli bilgiler elde etmek mümkün olmayabilir.
Son birkaç yıl içinde, zebra balığı sadece CDX (hücre türetilen tümör xenograft) modelleri için potansiyel ev sahipleri olduğu bildirilmiştir, aynı zamanda PDX modelleri5,6,7,8,9, 10. vertebral model hayvan olarak, zebra balığı hem genetik hem de fizyolojide memeliler ile yeterli benzerlikleri vardır, iki önemli avantajı vardır: şeffaflık ve küçük boyutu11. Zebrafish de son derece saflık, ve yüzlerce doğuştan larva birkaç gün içinde yetişkin12tek bir çift elde edilebilir. Çeşitli çalışmalar kanser hastalıkları hem transjenik ve xenograft modelleri oluşturmak için zebra balığı istihdam var13,14. Farexenografts ile karşılaştırıldığında, zebra balığı ksenogreft tek hücreli çözünürlükte izlemeyi sağlar. İnsan dokularının belirli bir miktar zebra balığı PDX modelleri yüzlerce üretebilmek yeteneğine sahiptir (zpdxs), sadece fare PDX modelleri bir çift oluşturmak için yeterli olabilir iken15,16. Ayrıca, 2-5 DPF ‘de zebra balığı larvalar zaten tam dolaşım sistemleri ve karaciğer ve böbrek gibi metabolik organları geliştirmek, ancak bağışıklık sistemi17, kalan sarısı sac doğal bir 3D orta iken, ilaç taraması için ideal, ilaç direnç testleri ve tümör göç gözlemleri6,18,19,20,21.
Klinik kullanım için bir tarama/test platformu olarak zPDX kullanmak için nihai bir girişim ile, burada, pankreas kanseri zPDX modeli için optimize edilmiş bir öneri açıklamak, hangi izin verir in vivo aday ilaç değerlendirme kısa bir süre içinde düşük maliyetlerde daha az hücre kullanarak. Zpdx6,9,10hakkında önceki referanslar ile karşılaştırıldığında, biz sistem daha uygun ve güvenilir klinik kişiselleştirilmiş tanı için yapmak için birkaç optimizasyonlar tanıttı: 1) farklı hücre ön sıralama primer tümör dokularında gruplar ve daha fazla deneylerden önce bir hafta boyunca primer hücreleri stabilize; 2) insan hücrelerini etiketleme ve Lentivirus tabanlı genetik modifikasyon ile xenograft hücre canlılığı artırılması; 3) hem besin takviyeleri (glikoz ve glutamin) ve sıcaklık zebra balığı kültür durumu optimize; 4) farklı hücre türlerinin ilaç yanıtlarının karşılaştırmalı bir şekilde ölçülme. Ayrıca birkaç ek malzeme ekleyerek enjeksiyon çözümünde değişiklik yaptık. Tamamen, bu iyileştirmeler hızlı bir şekilde daha fazla hasta-xenograft zebra balığı hosts bu güvenilir bir araç olarak aday ilaçların tepkisi değerlendirmek için kullanılabilir oluşturmak için imkanı sağlar.
Hem PDX hem de CDX modelleri tümör biyoloji22alanında hayati platformlar ve başarılı bir türler arası transplantasyonun kritik adımı xenograft ‘in hayatta kalmasının geliştirilmesi. Son zamanlarda, bazı çalışmalar göstermiştir ki BCL2L1 geçici ifade (BCL-XL) veya BCL2 önemli ölçüde hücre kimliklerini etkilemeden fare ev sahibi insan embriyonik kök hücrelerinin canlılığı artırabilir ve kaderlerde23 , <s…
The authors have nothing to disclose.
Bu iş Çin 81402582 Ulusal Doğal Bilim Vakfı, Şanghay 12DZ2295100, 14YF1400600 ve 18ZR1404500 doğal Bilim Vakfı tarafından desteklenmektedir
DMEM | GIBCO | C11995500BT | |
FBS | Hyclone | sv30087.03 | |
Y-27632 | Cliniscience | Y0503 | Rho kinase inhibitor |
Primocin | invivogen | ant-pm-1 | an antibiotic for primary cell cultures |
Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
Nicotinamide | Sigma | N3376 | |
penicillin streptomycin | GIBCO | 15140122.00 | |
phosphate buffer (PBS) | GIBCO | C10010500CP | |
HBSS | GIBCO | 14170112.00 | |
collagenase type IV | GIBCO | 17104019.00 | |
hyaluronidase | Sigma | H3884 | |
DnaseⅠ | Sigma | D5025 | |
insulin | Sigma | I9278 | |
b-FGF | GIBCO | PHG0264 | |
EGF | GIBCO | PHG0314 | |
pancreatic cancer fibroblasts inhibitor | CHI Scientific | FibrOUT | |
0.45 μm sterile filter | Millipore | SLHV033RB | |
concentration column | Millipore | Millipore UFC910008 | Concentrate the virus |
polybrene | Sigma | H9268 | |
Hyaluronic Acid Sodium Salt | Sigma | H7630 | |
L-glutamine | GIBCO | 21051024.00 | |
gemcitabine | Gemzan | ||
methylcellulose | Sigma | M0262 | |
Navitoclax(ABT-263) | Selleck | S1001 | Bcl-xL inhibitor |
Equipment | |||
Microinjector | NARISHIGE | ||
stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
Confocal Microscope | LEICA | SP8 | 0.00 |