यहाँ प्रस्तुत कुशल CRISPR/Cas9 ribonucleoप्रोटीन-मध्यस्थ जीन संपादन के लिए एक प्रोटोकॉल है स्तनधारी कोशिकाओं में ट्यूब इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग कर.
जीन संपादन nucleases, CRISPR द्वारा प्रतिनिधित्व संबद्ध प्रोटीन 9 (Cas9), जैव चिकित्सा अनुसंधान में मुख्यधारा के उपकरण होते जा रहे हैं. transfection द्वारा लक्ष्य कोशिकाओं में CRISPR/Cas9 तत्वों का सफल वितरण कुशल जीन संपादन के लिए एक शर्त है. इस प्रोटोकॉल दर्शाता है कि ट्यूब इलेक्ट्रोपोरोनेशन (टीई) मशीन CRISPR/Cas9 ribonucleoप्रोटीन (RNP) की डिलीवरी, एकल-संक्षिप्त ओलिगोडोऑक्सीन्यूक्लिओटाइड (sODN) दाता टेम्पलेट्स के साथ स्तनधारी कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के लिए, मजबूत करने के लिए सुराग सटीक जीन संपादन की घटनाओं. सबसे पहले, टीई CRISPR/Cas9 RNP और ssODNs देने के लिए interleukin 2 रिसेप्टर सबयूनिट गामा (IL2RG) जीन और sepiapterin रिडक्टेज (एसपीआर) जीन खरगोश फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं में रोग पैदा करने वाले उत्परिवर्तनों को प्रेरित करने के लिए लागू किया गया था। 3.57%-20% की सटीक उत्परिवर्तन दर जीवाणु टीए क्लोनिंग अनुक्रमण द्वारा निर्धारित के रूप में प्राप्त किया गया. एक ही रणनीति तो epidermal विकास कारक रिसेप्टर (EGFR), मायोसिन बाध्यकारी प्रोटीन सी, कार्डियक (Mybpc3), और हीमोग्लोबिन subunit बीटा (HBB) सहित कई नैदानिक रूप से प्रासंगिक जीन पर मानव iPSCs में इस्तेमाल किया गया था. लगातार, अत्यधिक सटीक उत्परिवर्तन दर हासिल की गई (11.65%-37.92%) के रूप में गहरी अनुक्रमण (DeepSe) द्वारा निर्धारित. वर्तमान कार्य दर्शाता है कि CRISPR/Cas9 RNP की ट्यूब इलेक्ट्रोपोट्रेशन स्तनधारी कोशिकाओं में जीन संपादन के लिए एक कुशल transfection प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करता है.
CRISPR/Cas9 जीन संपादन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रोग्राम योग्य न्यूक्लीज है। यह जीनोम में एकल गाइड आरएनए (sgRNA) दोनों लक्ष्य दृश्यों और एक आसन्न प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (पीएएम) अनुक्रम की मध्यस्थता मान्यता के माध्यम से काम करता है। Cas9 न्यूक्लेस एक डबल-स्लेड डीएनए ब्रेक (डीएसबी) पीएएम अनुक्रम1के ऊपर तीन न्यूक्लिओटाइड स्थित उत्पन्न करता है। DSBs या तो त्रुटि-प्रवण गैर-homologous अंत में शामिल होने (NHEJ) या homology निर्देशित मरम्मत (HDR) रास्ते के माध्यम से मरम्मत कर रहे हैं. HDR मार्ग के माध्यम से सटीक जीन संपादन प्राप्त करने के लिए, दाता टेम्पलेट्स अक्सर प्लाज्मिड डीएनए (pDNA) या एकल-स्लेड ओलिगोडियोक्सिन्यूक्लिओटाइड (sODN) के प्रारूप में प्रदान की जाती हैं।
CRISPR/Cas9 और sgRNA तीन स्वरूपों में कोशिकाओं को दिया जा सकता है: Cas9 प्रोटीन और gRNA2,3के ribonucleoप्रोटीन (RNP) परिसर ; Cas9 mRNA और sgRNA4,5; या प्लाज्मिड डीएनए (पीडीएनए) जिसमें आवश्यक प्रमोटर, संचालित एसजीआरए, और कैस9 कोडिंग क्षेत्र6,7,8शामिल हैं । कई समूहों ने दिखा दिया है कि जब CRISPR/Cas9 RNP के रूप में दिया जाता है, जीन संपादन दक्षता अक्सर pDNA या MRNA प्रारूपों में प्राप्त उन outperforms, न्यूक्लिक एसिड9की तुलना में RNP के बहुत छोटे आकार के कारण . इसके अलावा, यह पहले से पता चला है कि एक उपन्यास ट्यूब electroporation (टीई) मशीन विशेष रूप से कई सेल प्रकार9में जीन संपादन अनुप्रयोगों में प्रभावी है.
वर्तमान कार्य में प्रस्तुत कई नैदानिक रूप से प्रासंगिक लोसी में विभिन्न प्रजातियों के स्तनधारी कोशिकाओं को CRISPR/Cas9 RNP के वितरण के लिए TE का उपयोग करने में एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल है। इस उपन्यास ते transfection तकनीक और उच्च HDR दर घटना जैव चिकित्सा अनुसंधान में व्यापक अनुप्रयोगों मिल सकता है.
ट्यूब इलेक्ट्रोपोर्नेशन विधि CRISPR/Cas9 RNP और खरगोश और मानव कोशिकाओं को ssODNs देने में प्रभावी था, मजबूत सटीक जीन संपादन के लिए अग्रणी (पीजीई). टीई और अन्य पारंपरिक इलेक्ट्रोपोरोनेशन उपकरणों के बीच प्राथमिक अंतर एक ट्यूब का उपयोग है, जिसमें दो इलेक्ट्रोड ट्यूब के ऊपर और नीचे हैं और नमूना पूर्ण में लोड किया जाता है तो इलेक्ट्रोपोरेशन पर बंद कर दिया जाता है (चित्र 1)। इसके विपरीत, एक पारंपरिक cuvette में, इलेक्ट्रोड पक्षों पर हैं और नमूना पूरी तरह से विद्युत पोरेटेशन के दौरान बंद नहीं है. इस नए डिजाइन हवा बुलबुला पीढ़ी को कम कर देता है और हवा बुलबुला आकार है, जो फलस्वरूप बिजली वोल्टेज के भी वितरण में सुधार, और एक परिणाम के रूप में कम सेल मौत और उच्च transfection दक्षता9की ओर जाता है compresses. वर्तमान कार्य में, उच्च पीजीई दरें (15%-37%) मानव iPSCs में EGFR, Mybpc3 और HBB जीन को लक्षित हासिल किया गया. ये परिणाम एक पूर्व रिपोर्ट के अनुरूप हैं जिसमें मानव स्टेम कोशिकाओं9में उच्च पीजीई दर प्राप्त की गई थी .
रोग पैदा करने वाले उत्परिवर्तनों को खरगोश कोशिकाओं में आईएल2आरजी और एसपीआर जीनों में लक्षित किया गया था। हाल ही में, आईएल2आरजी-नॉकआउट खरगोशों को मानव एक्स से जुड़े गंभीर संयुक्त इम्यूनोडेफिशियेंसी (एससीआईडी-एक्स 1)16,17के लिए मॉडल के रूप में तैयार किया गया है। वर्तमान काम से पता चलता है कि रोगी IL2RG उत्परिवर्तनों (उदा., C231Y और Q235X) कुशलतापूर्वक खरगोश कोशिकाओं में उत्पन्न किया जा सकता है, रोगी उत्परिवर्तनले जाने वाले SCID-X1 खरगोश मॉडल बनाने की व्यवहार्यता का प्रदर्शन. यह भी दिखा दिया गया था कि एसपीआर R150G उत्परिवर्तनों कुशलतापूर्वक खरगोश कोशिकाओं में बनाया जा सकता है. इस उत्परिवर्तन से 12 बच्चोंमें मोटर और संज्ञानात्मक कमी होती है . इन IL2RG और एसपीआर उत्परिवर्तन खरगोश मॉडल, एक बार उत्पन्न, translational अध्ययन के लिए मूल्यवान पूर्व नैदानिक मॉडल के रूप में सेवा कर सकते हैं. वे भी इन मोनोजेनिक रोगों के लिए जीन संपादन आधारित चिकित्सकीय स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
CRISPR/Cas9-मध्यस्थ जीन संपादन अनुप्रयोगों के लिए एक चिंता का विषय है ऑफ-लक्ष्य संपादन घटनाओं. पहले वर्णित विधियों का उपयोग करते हुए इस अध्ययन ( तालिकाS1)में प्रयुक्तsgRNAs के लिए अनुमानित शीर्ष ऑफ-लक्ष्य स्थलों पर इनडेल दरों का विश्लेषण किया गया . कुल में, सात संभावित शीर्ष ऑफ-लक्ष्य loci sg-rb-IL2RG-01 के लिए विश्लेषण किया गया, एसजी-आरबी-एसपीआर के लिए पांच, एसजी-hEGFR के लिए सात, एसजी-hMybpc3 के लिए पांच, और sg-HHBB के लिए सात, तालिका S2में सूचीबद्ध प्राइमर का उपयोग कर. T7E1 परख (चित्र S1)द्वारा कोई ऑफ-लक्ष्य indels का खुलासा नहीं किया गया था, जो इन sgRNAs का उपयोग करके CRISPR/Cas9-मध्यस्थ जीन संपादन के लिए न्यूनतम ऑफ-लक्ष्य जोखिमों को दर्शाता है। यह यह भी इंगित करता है कि ट्यूब इलेक्ट्रोपोयोजन विधि स्वयं के कारण या ऑफ-लक्ष्य संपादन में वृद्धि नहीं करता है। फिर भी, अवांछनीय ऑफ-लक्ष्य संपादनों को कम करने या समाप्त करने के लिए प्रयास ों को समर्पित किया जाना चाहिए। पूरे जीनोम अनुक्रमण नैदानिक अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया जा करने के लिए इरादा कर रहे हैं कि कोशिकाओं के लिए ऐसी घटनाओं को बाहर करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
तकनीकी स्तर पर, CRISPR/Cas9 RNP ट्यूब इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा कुशल सटीक जीनोम संपादन प्राप्त करने के लिए निम्नलिखित प्रमुख कारक माना जाता है। सबसे पहले, यह भविष्यवाणी कम बंद लक्ष्य क्षमता के साथ एक कुशल sgRNA का चयन करने के लिए सलाह दी जाती है. यह खूंटी अनुप्रयोगों के लिए उपयोग करने से पहले चयनित sgRNA की indel दक्षता को मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह दुर्लभ नहीं है कि एक सॉफ्टवेयर की भविष्यवाणी अच्छा sgRNA सत्यापन चरण में विफल रहता है.
दूसरा, उच्च PGE प्राप्त करने के लिए, यह जब भी संभव हो ssODN दाता के लिए एक पीएएम उत्परिवर्तन प्रेरित करने के लिए सिफारिश की है. तर्क यह है कि ऐसा करके, CRISPR/Cas9 दाता टेम्पलेट एकीकरण के बाद फिर से काटने को रोका है. कुछ मामलों में, पीजीई ही पीएएम उत्परिवर्तनों का परिचय देता है। अन्य मामलों में, पीएएम अनुक्रम में मूक उत्परिवर्तनों को पेश करना संभव है। अगर एक पीएएम उत्परिवर्तन संभव नहीं है, तो यह सलाह दी जाती है कि दाता में कई मूक उत्परिवर्तनों को शामिल करने का प्रयास करें जो sgRNA अनुक्रम से मेल खाती है।
तीसरे, विशेष रूप से टीई के लिए प्रासंगिक, यह महत्वपूर्ण है हवा बुलबुले के गठन से बचने के लिए जब कोशिकाओं और RNP मिश्रण विद्युत नली को स्थानांतरित. जबकि एक टीई ट्यूब के डिजाइन पहले से ही हवा बुलबुला गठन को कम करता है, सावधान हैंडलिंग आगे कम हो जाएगा और यहां तक कि हवा बुलबुला गठन से बचने के पूरा कर सकते हैं। CRISPR/Cas9 ribonucleoप्रोटीन मध्यस्थता सटीक जीन संपादन के लिए ट्यूब इलेक्ट्रोपोरेशन के अनुप्रयोग में सामना किया जा सकता है कि लगातार समस्याओं के लिए एक मुसीबत शूटिंग गाइड तालिका 2में प्रदान की गई है।
अंत में, यह यहाँ का प्रदर्शन किया है कि ट्यूब इलेक्ट्रोपोरिओशन CRISPR/Cas9 RNP और स्तनधारी कोशिकाओं को ssODNs के वितरण के लिए एक प्रभावी साधन है उच्च PGE दरों को प्राप्त करने के लिए. इस नए TE transfection तकनीक और अपनी मजबूत सटीक जीन संपादन दर जीन संपादन अनुप्रयोगों के विकास की सुविधा हो सकती है.
The authors have nothing to disclose.
यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (R21OD023194 से JX के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था. यह काम मिशिगन मेडिकल सेंटर के विश्वविद्यालय में अनुवाद विज्ञान और चिकित्सा (CAMTraST) के लिए उन्नत मॉडल के लिए केंद्र द्वारा समर्थित कोर सेवाओं का उपयोग किया.
Accutase | STEMCELL Technologies | 792 | Cell detachment solution for human iPSCs, first used in Step 1.1.2. |
Cas9 Nuclease 3NLS | IDT | 1074182 | Cas9 protein, first used in Step 3.3. |
DMEM | Thermo Fisher | 11965092 | For cell culture, first used in Step 1.2.3. |
DPBS | Thermo Fisher | 1708075 | For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. |
EDTA | Lonza | 51201 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
Electroporation buffer | Celetrix | 13–0104 | The electroporation buffer, first used in Step 3.2. |
Electroporation tubes | Celetrix | 20 μL: 12–0107; 120 μL: 12–0104 | The electroporation tube, first used in Step 3.4. |
Electroporator | Celetrix | CTX-1500A LE | The tube electroporation machine, first used in Step 3.5 |
Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | For cell culture, first used in Step 1.2.2. |
Forma CO2 Incubators | Thermo Fisher | Model 370 | For cell culture, first used in Step 1.1. |
Gel Extraction Kit | Qiagen | 28115 | For gel purification, first used in Step 4.3. |
Human induced pluripotent stem cells | American Type Culture Collection | ACS-1030 | Human iPSCs, first used in Step 1.1. |
Matrigel | Corning | 354277 | Artificial extracellular matrix; for precoating cell culture plate, first used in Step 1.1. |
mTeSR 1 medium | STEMCELL Technologies | 85850 | Feeder-free cell culture medium for human iPSCs, first used in Step 1.1. |
PCR SV mini | GeneAll | 103-102 | For PCR product purification, first used in Step 4.3. |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. |
Phenol-chloroform | Thermo Fisher | 15593031 | For DNA extraction, first used in Step 4.2. |
Precision gRNA Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For the generation of full length gRNA (guide RNA), first used in Step 2.4. |
Proteinase K Solution | Thermo Fisher | AM2548 | For DNA extraction, first used in Step 4.1. |
Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491 | For PCR amplification, first used in Step 4.3. |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
TA Cloning Kit | Thermo Fisher | K457502 | For TA clone sequencing, first used in Step 4.4. |
Tissue Culture Dish (10 cm) | FALCON | 353003 | For cell culture, first used in Step 1.2.3. |
Tissue Culture Dish (12 well) | FALCON | 353043 | For cell culture, first used in Step 3.7. |
Tissue Culture Dish (6 cm) | FALCON | 353004 | For cell culture, first used in Step 1.2.2. |
Tris HCl | Thermo Fisher | BP1757-500 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200056 | For cell digestion, first used in Step 1.2. 4. |
Universal Fit Pipette Tips | Celetrix | 14-0101 | For electroporation, first used in Step 3.4. |
Y27632 | LC Labs | Y-5301 | The apoptosis inhibotor, first used in Step 1.1.1. |