Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

CRISPR/Cas9 ריבונואופפרוטאין-תיווך מדויק לעריכה גנטית על ידי אלקטרופורציה

Published: June 20, 2019 doi: 10.3791/59512
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 1, 1
1Center for Advanced Models for Translational Sciences and Therapeutics, Department of Internal Medicine, University of Michigan Medical Center, 2Celetrix LLC
* These authors contributed equally

Summary

המוצג כאן הוא פרוטוקול עבור CRISPR/Cas9 ריבונאנאופלפרוטאין מתווך יעיל עריכת גנים בתאי מיונקים באמצעות אלקטרופורציה שפופרת.

Abstract

הנוקלאוסים לעריכת גנים, המיוצגים על ידי חלבון משויך של CRISPR 9 (Cas9), הופכים להיות כלים בזרם המרכזי במחקר ביו-רפואי. משלוח מוצלח של האלמנטים CRISPR/Cas9 לתוך התאים היעד על ידי החצייה היא תנאי מוקדם לעריכת גנים יעיל. פרוטוקול זה ממחיש כי אלקטרופורציה (TE) מכונה-בתיווך המסירה של CRISPR/Cas9 ריבונפרוטאין (RNP), יחד עם יחיד תקוע oligodeoxynucleotide (ssODN) התורמים תבניות לסוגים שונים של תאים היונקים, מוביל חזק מדויק לעריכת אירועים גנים. ראשון, TE הוחל כדי לספק crispr/Cas9 rnp ו ssodns כדי לגרום למחלות גרימת מוטציות ב-אינטרלויקין 2 הגמא היחידה משנה (IL2RG) גן ו sepiapterin רדוקטאז (spr) גן בתאי פיברוהפיצוץ תאים. שיעורי מוטציה מדויקים של 3.57%-20% הושגו כפי שנקבע על-ידי שיבוט החיידק TA השיבוט. אותה אסטרטגיה שימש אז iPSCs אנושי על כמה גנים רלוונטיים קליני כולל קולטן באפידרמיס גורם גידול (egfr), רירן מחייב חלבון C, לב (Mybpc3), ו-יחידת המוגלובין בטא (hbb). בעקביות, שיעורי מוטציה מדויקים מאוד הושגו (11.65%-37.92%) כפי שנקבע על ידי רצף עמוק (DeepSeq). העבודה הנוכחית ממחישה כי האלקטרופורציה של CRISPR/Cas9 RNP מייצגת פרוטוקול מעבר יעיל לעריכת גנים בתאי יונקים.

Introduction

Crispr/Cas9 הוא הנפוץ ביותר לתכנות נוקלאז עבור עריכת גנים. זה עובד דרך מדריך יחיד RNA (sgRNA)-הכרה בתיווך של שני רצפי היעד ומוטיב הסמוך פרוטומרווח הסמוך (פאם) רצף בגנום. Cas9 נוקלאז יוצר הפסקה כפולה DNA (dsb) הממוקם שלושה נוקלאוטידים בזרם של פאם רצף1. ה-DSBs מתוקנים באמצעות שגיאות מועדים שאינם הומוולוגיים הצטרפות (NHEJ) או הומולוגיה-תיקון מכוון (HDR) מסלולים. כדי להשיג את העריכה גנטי מדויק באמצעות מסלול HDR, תבניות תורם מסופקים לעתים קרובות בפורמט של DNA פלמיד (pDNA) או יחיד תקוע oligodeoxynucleotide (ssODN).

Crispr/Cas9 ו sgrna ניתן להעביר את התאים בשלושה פורמטים: הקומפלקס ribonuאופאנפרוטאין (rnp) של Cas9 חלבון ו grna2,3; Cas9 mrna ו sgrna4,5; או DNA פלמיד (pdna) המכיל את היזמים הדרושים, sgrna מונחה, ו Cas9 coding אזור6,7,8. קבוצות רבות הוכיחו כי כאשר CRISPR/Cas9 מועברת כמו RNP, היעילות לעריכת גנים לעתים קרובות מבצעת אלה שהושגו ב-pDNA או mRNA פורמטים, המיוחס לגודל הקטן ביותר של RNP לעומת חומצות גרעין9. יתר על כן, זה כבר הראו בעבר כי המכשיר הרומן אלקטרופורציה (TE) מכונה יעילה במיוחד ביישומים לעריכת גנים במספר סוגי תאים9.

הציג בעבודה הנוכחית הוא פרוטוקול צעד אחר צעד בניצול TE עבור המסירה של CRISPR/Cas9 RNP לתאי מיונקים של מינים שונים בתוך מספר הבית הרלוונטי קלינית. טכניקת הפיתוח החדשני של הטכניקה ותופעת הקצב הגבוה של HDR עשויה למצוא יישומים נרחבים במחקר ביו-רפואי.

Protocol

כל תחזוקת בעלי חיים, טיפול, ושימוש בהליכים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת מישיגן.

1. הכנת תאים

  1. לרכוש iPSCs אנושי (ACS-1030) מאוסף תרבות הסוג האמריקאי (ATCC). תרבות iPScs על מטריצה מלאכותית עם הגוף בינונית ללא מאכיל (ראה טבלת חומרים) בחממה לתרבות התא (5% CO2 ב 37 ° c) בעקבות הוראות הספק.
    1. 2 h לפני החצייה, לטפל iPSCs עם 10 μM רו-משויך, סליל מתפתל המכיל חלבון קינאז (ROCK) מעכב Y27632 (שימוש אשר מפחית אפופטוזיס של hiPSCs אנושי המנתק ומגביר את יעילות ההישרדות והשכפול של hiPSCs ללא המשפיעים על הגמישות שלהם.
    2. בעת ההעברה, הניתוק iPSCs עם פתרון התנתקות התא (ראה טבלת חומרים) לתאים בודדים ב 37 ° c עבור 5 דקות.. תספור את מספר הטלפון
  2. הקמת תרבות תא הארנב באמצעות התרבות העיקרית של ביופסיות רקמת העור באוזן, כפי שתוארה בעבר10.
    1. 0.5 ס מ x 0.5 ס מ ביופסיה של עור האוזן מתקבל מקצה האוזן ארנב. . תגלח את השיער מרקמת האוזן
    2. לשטוף 2x עם מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS) עם 5% פניצילין-סטרפטומיצין. העבר את רקמת האוזן לצלחת חדשה 6 ס מ רקמת הרקמה, ואז לחתוך את הרקמה לחתיכות קטנות (~ 1.0 mm x 1.0 מ"מ). להוסיף כמה טיפות של סרום העוברי העובר כדי למנוע את רקמת מתייבש.
    3. הפיצו את הרקמה הגרוחת לצלחת 10 ס מ רקמות רקמה, ולאחר מכן להוסיף 10 מ ל של מדיום התרבות. הארנבונים התאים הארנב הם מתורבתים ב בינונית שונה ביותר של הנשר של דולבקה (DMEM) עם 10% סרום עוברי העובר. שים את הצלחת תרבות הרקמה בחממה לתרבות התא (5% CO2 ב 37 ° c).
    4. שלושה עד חמישה ימים לאחר הציפוי, השתמשו בטריפסין-אדטה כדי לעכל תאים ב-37 ° c עבור 2 דקות.. תספור את מספר הטלפון

2. עיצוב וסינתזה של gRNAs והאוליגוס תורם

  1. עבור כל גן, מדריך לעיצוב RNA המבוסס על רצף המיקוד באמצעות כלי מקוון (לדוגמה, < http://crispor.tefor.net/>).
  2. . הדבק את רצף הדי. אנ. איי של הריבית
  3. בחר הגנום ואת המוטיב הסמוך מוטיב (פאם). רצפי מדריך אפשריים ברצפי DNA קלט יוצגו בדף הפלט. מומלץ לבחור gRNA עם יעילות גבוהה יותר והפוטנציאל התחתון של היעד.
  4. לסנתז דנ א על ידי ספק מסחרי עבור תעבינג gRNAs. לבצע שעתוק מחוץ גופית של gRNA באמצעות ערכת סינתזה gRNA על פי הוראות היצרן.
  5. לטהר את gRNA באמצעות העמודה מיקרו RNA טיהור הכלול בערכת סינתזה gRNA. למדוד את הריכוז, ואז לאחסן את gRNAs ב-80 ° c.
  6. עצב תבנית של תורם ssODN עבור כל אתר מוטציה. ה-ssODNs יכול להיות מסונתז על ידי ספקים מסחריים כגון IDT. באופן כללי, כל ssODN הוא 120-160 נוקלאוטידים (nt) באורך, המורכב של 60-80 nt זרוע הומולוגיה שמאל 60-80 nt בזרוע הומולוגיה הנכון. כדי למנוע חיתוך מחדש של ה-DNA שנערך, מוטציה שקטה על פאם צריך להיות הציג את ssODN ככל האפשר. אתר הגזירה של CRISPR צריך להיות ממוקם קרוב לשינוי גנומית המיועד ככל האפשר.

3. אלקטרופורציה של Cas9 RNP ו-ssODNs

  1. הכן את התאים כמתואר בסעיף 1.
  2. להשעות מחדש 2-3 x 105 תאים ב 20 μl של מאגר אלקטרופורציה. פיפטה למעלה ולמטה בזהירות כדי ליצור השעיה לתא אחד.
  3. עבור Cas9 RNP הזיהום, מראשות המלך 2 μg של Cas9-NLS חלבון עם 0.67 μg של gRNA בטמפרטורת החדר (RT) עבור 10-15 דקות. הבא, בעדינות לערבב את מתחם RNP הקימו יחד עם 2 μg של ssODN עם תאים.
  4. העבר את התערובת לתא לצינור אלקטרופורציה של 20 μL בעזרת התאמת הצנרת האוניברסלית המסופקת על-ידי ערכת אלקטרופורציה של הצינורית. כדי להשיג אלקטרופורציה טובה יותר, נסה להימנע מהיווצרות בועות אוויר במהלך ההעברה.
  5. הניחו את צינור החשמל בחריץ של האלקטרופוראטור והקישו "Go" כדי לסיים. בצע את הפרמטרים המוצעים של היצרן עבור כל סוג תא. לדוגמה, עבור התאים האנושיים iPSCs והארנב בתאי הפיצוץ, ערכת המתח הוא 420 V וזמן הדופק הוא 30 ms. מחזור אלקטרופורציה מוצלחת מצוין על-ידי דוח הדופק על מסך התצוגה של האלקטרופוראטור.
  6. לאחר האלקטרופורציה, העבר את תאי ה-iPS האנושיים ל-1 מ ל של החברה המכילה את מדיום התרבות מראש-27632 שתוארה בחלק התרבותי של התאים. עבור התאים הארנבונים הפיצוץ בתאי, להעביר אותם DMEM עם 10% סרום עוברי העובר.
  7. צלחת להתאים את התאים לאחד היטב של 12 צלחת תרבות התא הטוב.
  8. לשנות את מדיום התרבות כל יום. Y-27632 מוסר מתוך בינונית התרבות iPSC האנושית 24 h פוסט אלקטרופורציה.

4. ניתוח אירועי בעריכת גנים

  1. הקציר תאים 72 h לאחר אלקטרופורציה. לעכל את התאים מלוח התרבות באמצעות טריפסין-EDTA עבור התאים הארנבונים בתאי הפיצוץ או ניתוק התאים פתרון עבור iPSCs אנושי. לאחר צנטריפוגה, להשעות את התאים עם 350 mL של מאגר הליזה (1 מטרים Tris HCl, 5 M הנאסה, 0.5 M EDTA; pH 8.0, 10% SDS, להוסיף 20 μL של 20 מ"ג/mL פרוטטינואז K מלאי ל 1 mL של מאגר הליזה), ולאחר מכן דגירה ב 55 ° צ' לילה
  2. לחלץ את ה-DNA גנומית עם פנול-כלורופורם באמצעות נהלים סטנדרטיים.
  3. להגביר 100-200 bp שברי DNA המכיל אזור ממוקדות באמצעות דנ א באמינות גבוהה פולימראז, לאחר מכן לטהר את שברי ה-DNA מ ג באמצעות ערכת החילוץ ג'ל או ישירות ממוצרי PCR באמצעות מיני PCR SV kit.
  4. כדי לקבוע את היעילות לעריכת גנים על ידי רצפי המושבה חיידקי, ליגאז מוצרי ה-PCR מטוהרים לתוך וקטור pCR4-topo באמצעות ערכת השכפול topo TA. באופן אקראי להרים שיבוטים חיידקיים, ולאחר מכן רצף את התוספות באמצעות רצף אוניברסלי שסופקו על ידי ערכת השכפול TOPO TA.
  5. כדי לקבוע את יעילות העריכה של גנים לפי רצף עמוק, לשלוח את מוצרי ה-PCR מטוהרים (~ 100-200 bp) משלב 4.3 עבור crispr אמפליקון רצף ב רצפי DNA הליבה.

Representative Results

TE של Cas9 RNP ו-ssODNs לתאי פיברוהפיצוץ תאים

התהליך הכולל של מסירת בתיווך בCas9 RNP לתאי מיונקים מומחש באיור 1. ראשית, C231Y ו Q235X מוטציות יוצרו בגנים IL2RG, ואת מוטציה R150G הופק בגנים SPR ב הארנב פיברופיצוץ תאים. אובדן הפונקציה מוטציות ב IL2RG וגנים SPR ידועים לגרום הכשל החיסוני העיקרי11 ו-המנוע הקוגניטיבי לבין12, בהתאמה.

עיצובים sgRNA ספציפיים מומחשים באיור 2A. הצבעי היסוד ששימשו להגביר את האזורים המיועדים רשומים בטבלה 3. רצפים של ssODNs מוצגים בטבלה 1. שיעורי העריכה הגנים נקבעו על ידי שיבוט ה-TA בקטריאלי (איור 2B). ב IL2RG C231 לוקוס, מתוך 28 שיבוטים שהיו ברצף, אחד (3.57%) נשא את המוטציה C231Y מדויקת, ארבעה (14.28%) הכנסת הכניסה או מחיקה (indel) מוטציות, ואת 23 הנותרים (82%) היו מסוג פראי ב IL2RG Q235 לוקוס, מתוך 27 שיבוטים שהיו ברצף, שניים (7.41%) נשא את המוטציה Q235X מדויקת, שלושה מוטציות בindel שבוצעו (11.11%) והנותרים היו מסוג פראי. ב SPG R150 לוקוס, של 20 שיבוטים רצף, חמש (25%) נשא את המוטציה R150G מדויקת, 10 (50%) והנותרים היו מסוג פראי.

TE של Cas9 RNP ו ssODNs לאדם iPSCs

TE היה להשתמש לאחר מכן כדי לספק Cas9 RNP ו ssODNs לiPSCs האדם והיעד קלינית הקשר הרלוונטי EGFR, Mybpc3, ו HBB גנים. הנקודה מוטציות ב-egfr T790 האזור האבותית מעניקה עמידות בפני egfr טירוזין קינאז מעכבי בחולים של סרטן ריאות תאים לא קטנים (nsclc) מחסה הפעלת מוטציות של egfr13. מוטציה frameshift ב אקסון 16 ב Mybpc3 מעורב יפרטרופית שריר הלב14. מוטציה של נקודת E6V בגנים HBB מוביל למחלות תאים מגל15.

עיצובים sgRNA ספציפיים מומחשים באיור 3A. הצבעי היסוד ששימשו להגביר את האזורים המיועדים רשומים בטבלה 3. רצפים של ssODNs מוצגים בטבלה 1. שיעורי העריכה של הגן נקבעו על ידי DeepSeq (איור 3B). בשנת EGFR, 15.68% מכלל האללים נשאו את מוטציות הנקודה המדויקות (6,315 קריאות), 22.75% נשאו מוטציות indel (9,162 קריאות), והשאר 61.57% היו מסוג פראי (הקריאות ב24,797). ב Mybpc3 לוקוס, 37.92% נשא מחיקה מדויקת של 4 bp TGAA (11,654 קריאות), 2.24% שנשאו מוטציות indel (410 קריאות) ואת שאר 59.84% היו מסוג פראי (הקריאות 18,692). בשנת HBB לוקוס, 11.65% נשא את מוטציה E6V מדויק (6,565 קריאות), 23.35% נשאו מוטציות indel (13,163 קריאות) ואת שאר 65% היו פראי סוג (הקריאות 36,644).

Figure 1
איור 1: תזרים תרשים של אלקטרופורציה של Cas9 rnp.

Figure 2
איור 2 : עריכת גנים של תאים פיברומהדף הארנב. (א) איור של רצפי יעד. תיבות מציינות את השם המיועד. אותיות המסומנות בקו תחתון תואמות לרצפי gRNA. אותיות אדומות מצביעות על רצפי פאם. (ב) TA שיבוט תוצאות האירועים בעריכת גנים. . קופסאות מציינות מוטציה מדויקת רצף indel המוצג מייצג מסוג אלל אחד בלבד. רצפי indel אחרים אינם מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : עריכת גנים של iPSCs אנושי. (א) איור של רצפי יעד. תיבות מציינות את השם המיועד. אותיות המסומנות בקו תחתון תואמות לרצף gRNA. אותיות אדומות מצביעות על רצפי פאם. (ב) deepseq תוצאות של האירועים לעריכת גנים. . קופסאות מציינות מוטציה מדויקת אותיות אדומות מציינות מוטציות שקטות שהוצגו בתבניות התורמים. רצף indel המוצג מייצג מסוג אלל אחד בלבד. רצפי indel אחרים אינם מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

לוקוס רצף אוליגו
 
(מוטציה ממוקדת)
ארנב IL2RG (C231Y) AGCGTGGATGGGCAGAAACTCTACACGTTCCGAGTCCGGAGCCGTTTTAACCCTTTGTATGGGAGTGCTCAGCATTGGAGT
בדיקת מלאי הגנה מפני בעלי מחלקה (ca)
ארנב IL2RG (Q235X) AGCGTGGATGGGCAGAAACTCTACACGTTCCGAGTCCGGAGCCGTTTTAACCCTTTGTGTGGGAGTGCTTAGCATTGGAGT
בדיקת מלאי הגנה מפני בעלי מחלקה (ca)
הארנב SPR gacctccatgctctgcctgacctcctgcatcctgaaggcgtttcctgccagtcctggCctcagcgggactgtggtgaacatctcgtcgctgtgtgccctgcagcccttcaagggctggg
cgctgtac
(R150G)
האדם האנושי מרכז התקני בקרת כמוסות בקרת מדיה (CGTGCTGTACACA) מאקרוקיקיקציטקציגcca
הוראות הגנה מפני בעלי מטרה (CCTGCACTAATACCA).
(מוטציות פוינט לT790)
Mybpc3 אנושי GCCCCCTGTGCTCATCACGCGCCCCTTGGAGGACCAGCTGGTGATGGTGGGGCAGCGGGTGGAGTTTGCGAGGTATCGGA
GGAGGGGGCGCAAGTCAAATGGTGAGTTCCAGAAGCACGGGGCATGGGTGTTGGGGGCAT
(מחיקה של 4-bp)
האדם HBB TCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGTGGAGAAGTCTGCAGTTACTGCC
מלון מיכאל שלמה היכל להיות מאוד מגניב
(E6V)

שולחן 1: רצפים של ssODNs.

צעד עיה סיבות אפשריות פתרונות
2.1 קצב אינדקסים נמוך מדריך עני RNA עיצוב, מדריך RNA מניות > 6 חודשים, מדריך נמוך הריכוז RNA עיצוב מדריך RNA, לייצר/להזמין מדריך חדש RNA.
2.3 נצילות PGE נמוכה עיצוב העניים DNA התורמים, מדריך יעיל ביותר RNA, כמות שגויה של ה-dna התורם או באיכות נמוכה DNA להגדיל את אורך הזרוע הומולוגיה, להציג מוטציה פם, להציג מוטציות שתיקה ל-DNA התורם, להשתמש מדריך יעיל יותר RNA, למטב את היחס של חלבון Cas9 על מדריך RNA.
3.4 העברה נכשלה בועות אוויר שנוצרו במהלך העברת תאים-מאגר תערובת לצינור אלקטרופורציה, הגדרת מתח/משך שגוי נסה להימנע מיצירת בועות אוויר, להתאים את הגדרת מתח/משך.
3.6 הכדאיות הנמוכה של תאים לאחר האלקטרופורציה הישרדות נמוכה של האדם היחיד הוסף מעכבי רוק לאחר אלקטרופורציה, להגדיל את מספר התאים.
4.1 כישלון ה-PCR תוכן GC גבוה או רצף חוזר מיטוב המצב PCR, להוסיף מערכת DMSO ל-PCR.

טבלה 2: פתרון בעיות מדריכים לבעיות תכופות.

שם תחל רצף הערה
Rb-IL2RG-F כמוסות מגנט להגברה על הארנב IL2RG מרסיס DNA
Rb-IL2RG-R כמוסות מגנט
שוהם מיכל שגיא בשביל הגברה על הארנב
רב-שיינר CTCAGCACCCTGACACTGGG
H-EGFR-F מוזיאון התיירות לחיזוק משבר דנ א אנושי
H-EGFR-R מיכל ברקת
H-Mybpc3-F לינה והדר לחיזוק הMybpc3 של האדם מרסיס DNA
H-Mybpc3-R מיכל ברקת
H-HBB-F היכל הגנה על הגברה של משבר הדנ א של האדם
H-HBB-R הגנה מפני החתול

שולחן 3: התחל בשימוש בשלב 4.3.

Discussion

שיטת האלקטרופורציה החשמלית הייתה יעילה באספקת CRISPR/Cas9 RNP ו ssODNs לארנבים ולתאי אדם, המוביל לעריכת גנים מדויקת ואיתנה (PGE). ההבדל העיקרי בין TE לבין התקני אלקטרופורציה קונבנציונליים אחרים הוא השימוש בצינור, שבו שתי אלקטרודות הן על החלק העליון והתחתון של הצינור והמדגם נטען במלואו לאחר מכן חתום על אלקטרופורציה (איור 1). לעומת זאת, בקובט קונבנציונאלי, האלקטרודות נמצאות בצדדים והמדגם אינו אטום במלואו במהלך האלקטרופורציה. העיצוב החדש מפחית את הפקת בועת האוויר ודוחס את גודל בועת האוויר, וכתוצאה מכך משפרת גם את התפלגות המתח החשמלי, ומשום כך מביאה להפחתת מוות התאים ויעילות הזיהום הגבוה9. בעבודה הנוכחית, שיעורי PGE גבוה (15%-37%) הושגו מיקוד EGFR, Mybpc3 ו HBB גנים ב אדם iPSCs. תוצאות אלה מתאימות עם דו ח מוקדם שבו שיעורי PGE גבוה הושגו בתאי גזע האדם9.

מוטציות גרימת מחלות היו ממוקדות IL2RG ו SPR גנים בתאי ארנב. לאחרונה, הארנבונים IL2RG-הסתרה הופקו כמודלים לכשל החיסוני האנושי המשולב משולב חמור (scid-X1)16,17. העבודה הנוכחית מראה כי החולה IL2RG מוטציות (למשל, C231Y ו Q235X) ניתן לייצר ביעילות בתאי הארנב, הפגנת הכדאיות של יצירת SCID-X1 מודלים הארנב נושאת מוטציות החולה. זה הוכיח גם כי SPR R150G מוטציות ניתן ליצור ביעילות בתאי הארנב. המוטציה הזאת גורמת לחסרונות. מוטוריים וקוגניטיביים בילדים12 אלה IL2RG ו SPR מוטציה מודלים ארנב, שנוצר לאחר, עשוי לשמש מודלים רב ערך טרום קליני למחקרים טרנסלבותית. הם עשויים לשמש גם כדי ליצור therapeutics המבוסס על עריכת גנים עבור מחלות מונוגניים אלה.

דאגה אחת עבור CRISPR/Cas9 בתיווך גנים לעריכת יישומים הוא מחוץ ליעד האירועים עריכת. שיעורי indel נותחו באתרים העליונים הצפויים מחוץ ליעד עבור sgRNAs המשמשים במחקר זה (טבלה S1), באמצעות שיטות שתוארו בעבר9. בסך הכל, שבעה פוטנציאל העליון מחוץ לכוונת היעד נותחו עבור sg-rb-IL2RG-01, חמש עבור sg-rb-SPR, שבעה עבור sg-hEGFR, חמש עבור sg-hMybpc3, ושבעה עבור sg-hHBB), באמצעות התחל המפורטים בטבלה S2. לא off-היעד indels נחשפו על ידי T7E1 בחני (איור S1), המציין מינימלי מחוץ ליעד סיכונים עבור crispr/Cas9-תיווך גנים באמצעות אלה sgrnas. הוא גם מציין כי שיטת האלקטרופורציה של הצינור עצמה אינה גורמת או מגדיל את העריכה של היעד. עם זאת, יש להקדיש את המאמצים כדי להקטין או למנוע עריכות לא רצויות של היעד. רצף הגנום כולו עשוי להיות הכרחי כדי להוציא אירועים כאלה עבור תאים המיועדים לשמש יישומים קליניים.

ברמה הטכנית, הבאים נחשבים גורמי מפתח כדי להשיג יעיל הגנום מדויק העריכה על ידי CRISPR/Cas9 RNP שפופרת החשמל. ראשית, מומלץ לבחור sgRNA יעיל עם צפוי נמוך מחוץ ליעד פוטנציאל. חשוב לאמת את היעילות indel של sgRNA שנבחרו לפני שימוש בו עבור יישומים יתד. זה לא נדיר כי תוכנה ניבא sgRNA טוב נכשל בשלב האימות.

שנית, כדי להשיג PGE גבוהה, מומלץ לגרום מוטציה פם התורם ssODN כאשר הדבר אפשרי. הרציונל הוא כי על ידי כך, CRISPR/Cas9 re-גזירה לאחר שילוב תבנית התורם נמנעת. במקרים מסוימים, PGE עצמה מציגה מוטציות פאם. במקרים אחרים, ניתן להחדיר מוטציות שקטות לרצף פם. במקרה שמוטציה פם אינה אפשרית, מומלץ לנסות לכלול מספר מוטציות שקטות בתורם המתאים לרצף sgRNA.

שלישית, הרלוונטית במיוחד ל-TE, חשוב להימנע מהיווצרות בועות אוויר בעת העברת תאים ותערובת RNP לצינור האלקטרופורציה. בעוד העיצוב של צינור TE ממזער כבר היווצרות בועת אוויר, טיפול זהיר יהיה להפחית עוד ואולי אפילו להשלים להימנע היווצרות בועה אוויר. מדריך ירי בעייתי לבעיות תכופות שניתן להיתקל בהן ביישום אלקטרופורציה של שפופרת עבור CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein בתיווך העריכה המדויקת מסופק בטבלה 2.

לסיכום, הוא מוצג כאן כי אלקטרופורציה הצינור הוא אמצעי יעיל להעברת CRISPR/Cas9 RNP ו ssODNs לתאי מדיה כדי להשיג שיעורי PGE גבוהה. טכניקת ההתפתחות החדשה של ה-TE ושיעור העריכה בגנים המדויקים שלה עשוי להקל על פיתוח יישומים לעריכת גנים.

Disclosures

ג. ג. עובד בסלטריקס LLC, יצרן של אלקטרופוראטור צינור. ל. מ., ל. י, י. ס., ד. י., ג'יי זי, י. א. ק., וג אקס, לא מצהירים על אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות (R21OD023194 כדי JX). עבודה זו מנוצל הליבה שירותים נתמך על ידי המרכז למודלים מתקדמים עבור מדעי טרנסלtional ו Therapeutics (CAMTraST) במרכז הרפואי של אוניברסיטת מישיגן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase STEMCELL Technologies 792 Cell detachment solution for human iPSCs, first used in Step 1.1.2. 
Cas9 Nuclease 3NLS IDT 1074182 Cas9 protein, first used in Step 3.3. 
DMEM Thermo Fisher 11965092 For cell culture, first used in Step 1.2.3. 
DPBS Thermo Fisher 1708075 For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. 
EDTA Lonza 51201 For making lysis buffer, first used in Step 4.1. 
Electroporation buffer Celetrix 13–0104 The electroporation buffer, first used in Step 3.2. 
Electroporation tubes Celetrix 20 μL: 12–0107; 120 μL: 12–0104 The electroporation tube, first used in Step 3.4. 
Electroporator Celetrix CTX-1500A LE The tube electroporation machine, first used in Step 3.5
Fetal bovine serum Sigma Aldrich 12003C For cell culture, first used in Step 1.2.2. 
Forma CO2 Incubators Thermo Fisher Model 370 For cell culture, first used in Step 1.1. 
Gel Extraction Kit Qiagen 28115 For gel purification, first used in Step 4.3. 
Human  induced pluripotent stem cells American Type Culture Collection ACS-1030 Human iPSCs, first used in Step 1.1. 
Matrigel                            Corning 354277 Artificial extracellular matrix; for precoating cell culture plate, first used in Step 1.1. 
mTeSR 1 medium  STEMCELL Technologies 85850 Feeder-free cell culture medium for human iPSCs, first used in Step 1.1. 
PCR SV mini GeneAll 103-102 For PCR product purification, first used in Step 4.3. 
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140163 For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. 
Phenol-chloroform Thermo Fisher 15593031 For DNA extraction, first used in Step 4.2. 
Precision gRNA Synthesis Kit Invitrogen A29377 For the generation of full length gRNA (guide RNA), first used in Step 2.4. 
Proteinase K Solution Thermo Fisher AM2548 For DNA extraction, first used in Step 4.1. 
Q5 high-fidelity DNA polymerase NEB M0491 For PCR amplification, first used in Step 4.3. 
Sodium dodecyl sulfate Sigma Aldrich L3771 For making lysis buffer, first used in Step 4.1. 
TA Cloning Kit  Thermo Fisher K457502 For TA clone sequencing, first used in Step 4.4. 
Tissue Culture Dish (10 cm) FALCON 353003 For cell culture, first used in Step 1.2.3. 
Tissue Culture Dish (12 well) FALCON 353043 For cell culture, first used in Step 3.7. 
Tissue Culture Dish (6 cm) FALCON 353004 For cell culture, first used in Step 1.2.2. 
Tris HCl Thermo Fisher BP1757-500 For making lysis buffer, first used in Step 4.1. 
Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25200056 For cell digestion, first used in Step 1.2. 4.
Universal Fit Pipette Tips  Celetrix 14-0101 For electroporation, first used in Step 3.4. 
Y27632 LC Labs Y-5301 The apoptosis inhibotor, first used in Step 1.1.1. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  2. Mout, R., et al. Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing. ACS Nano. 11 (3), 2452-2458 (2017).
  3. Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
  4. Miller, J. B., et al. Non-Viral CRISPR/Cas Gene Editing In Vitro and In Vivo Enabled by Synthetic Nanoparticle Co-Delivery of Cas9 mRNA and sgRNA. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (4), 1059-1063 (2017).
  5. Finn, J. D., et al. A Single Administration of CRISPR/Cas9 Lipid Nanoparticles Achieves Robust and Persistent In Vivo Genome Editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
  6. Liang, C., et al. Tumor cell-targeted delivery of CRISPR/Cas9 by aptamer-functionalized lipopolymer for therapeutic genome editing of VEGFA in osteosarcoma. Biomaterials. 147, 68-85 (2017).
  7. Luo, Y. L., et al. Macrophage-Specific in Vivo Gene Editing Using Cationic Lipid-Assisted Polymeric Nanoparticles. ACS Nano. 12 (2), 994-1005 (2018).
  8. Wang, H. X., et al. Nonviral gene editing via CRISPR/Cas9 delivery by membrane-disruptive and endosomolytic helical polypeptide. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4903-4908 (2018).
  9. Xu, X., et al. Efficient homology-directed gene editing by CRISPR/Cas9 in human stem and primary cells using tube electroporation. Scientific Reports. 8 (1), 11649 (2018).
  10. Du, F., et al. Beneficial effect of young oocytes for rabbit somatic cell nuclear transfer. Cloning Stem Cells. 11 (1), 131-140 (2009).
  11. Allenspach, E., Rawlings, D. J., Scharenberg, A. M. GeneReviews(R). Adam, M. P., et al. , (1993).
  12. Friedman, J., et al. GeneReviews(R). Adam, M. P., et al. , (1993).
  13. Hidaka, N., et al. Most T790M mutations are present on the same EGFR allele as activating mutations in patients with non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 108, 75-82 (2017).
  14. Ma, H., et al. Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos. Nature. 548 (7668), 413-419 (2017).
  15. Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
  16. Song, J., et al. Bacterial and Pneumocystis Infections in the Lungs of Gene-Knockout Rabbits with Severe Combined Immunodeficiency. Frontiers in Immunology. 9, 429 (2018).
  17. Song, J., et al. Production of immunodeficient rabbits by multiplex embryo transfer and multiplex gene targeting. Scientific Reports. 7 (1), 12202 (2017).

Tags

גנטיקה סוגיה 148 עריכה גנטית CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein אלקטרופורציה oligodeoxynucleotide תאי מיונקים
CRISPR/Cas9 ריבונואופפרוטאין-תיווך מדויק לעריכה גנטית על ידי אלקטרופורציה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, L., Jang, L., Chen, J., Song,… More

Ma, L., Jang, L., Chen, J., Song, J., Yang, D., Zhang, J., Chen, Y. E., Xu, J. CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation. J. Vis. Exp. (148), e59512, doi:10.3791/59512 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter