Представлен протокол для эффективного РЕДАКТИРОВАНИя биогенов CRISPR/Cas9 рибонуклеопротеинов в клетках млекопитающих с помощью трубной электропорации.
Nucleases редактирования генов, представленный CRISPR-ассоциированных белков 9 (Cas9), становятся основными инструментами в биомедицинских исследованиях. Успешная доставка элементов CRISPR/Cas9 в целевые клетки путем трансфекции является необходимым условием для эффективного редактирования генов. Этот протокол демонстрирует, что трубная электропорация (Т) машинно-опосредованные поставки CRISPR/Cas9 рибонуклеопротеин (RNP), наряду с одноцепочечной олигодеоксинуклид (ssODN) донорские шаблоны для различных типов млекопитающих клеток, приводит к надежной точные события редактирования генов. Во-первых, TE был применен для доставки CRISPR/Cas9 RNP и ssODNs, чтобы вызвать болезнетворные мутации в интерлейкине 2 рецепторов субъединицы гамма (IL2RG) гена и сепиаптерина редуктазы (SPR) ген в клетках кролика фибробластов. Точные показатели мутации 3,57%-20% были достигнуты в результате секвенирования клонирования т.д. Та же стратегия была затем использована в человеческих iPSCs на нескольких клинически значимых генов, включая рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), миозин связывающий белок C, сердечный (Mybpc3), и гемоглобин субъединик бета (HBB). Последовательно были достигнуты высокоточные показатели мутаций (11,65%-37,92%) как определяется глубоким секвенированием (DeepSeq). Нынешняя работа показывает, что трубная электропорация CRISPR/Cas9 RNP представляет собой эффективный протокол трансфекции для редактирования генов в клетках млекопитающих.
CRISPR/Cas9 является наиболее часто используемым программируемым нуклеазадляи для редактирования генов. Он работает через одно руководство РНК (sgRNA)-опосредованное распознавание как целевых последовательностей, так и смежных протосказеров, прилегающих мотив (PAM) последовательности в геноме. Nuclease Cas9 генерирует двухцепочечный разрыв ДНК (DSB), расположенный три нуклеотидов вверх по течению последовательности PAM1. DSBs восстанавливаются либо через подверженные ошибкам не-гомомогагный конец присоединения (NHEJ) или гомологии направлены ремонт (HDR) пути. Для достижения точного редактирования генов через hDR путь, донорские шаблоны часто предоставляются в формате плазмид ДНК (pDNA) или одноцепочечной олигодеоксинуклеотида (ssODN).
CRISPR/Cas9 и sgRNA могут быть доставлены в клетки в трех форматах: рибонуклеопротеин (РНП) комплекс белка Cas9 и gRNA2,3; Cas9 мРНК и sgRNA4,5; или плазмидднкой ДНК (pDNA), которая содержит необходимые промоутеры, приводомsgRNA, и Cas9 кодирования области 6,7,8. Многие группы продемонстрировали, что, когда CRISPR/Cas9 поставляется как RNP, эффективность редактирования генов часто превосходит те, которые достигнуты в форматах pDNA или mRNA, что объясняется гораздо меньшим размером RNP по сравнению с нуклеидными кислотами9. Кроме того, ранее было показано, что новая трубка электропорации (TE) машина особенно эффективна в применении редактирования генов в нескольких типах клеток9.
Представленный в настоящей работе пошаговой протокол в использовании TE для доставки CRISPR/Cas9 RNP к клеткам млекопитающих различных видов в нескольких клинически значимых локусов. Этот новый метод трансфекции TE и высокое явление скорости HDR могут найти широкое применение в биомедицинских исследованиях.
Метод электропорации трубки был эффективен в доставке CRISPR/Cas9 RNP и ssODNs к клеткам кролика и человека, что привело к надежному точному редактированию генов (PGE). Основное различие между TE и другими обычными устройствами электропорации является использование трубки, в которой два электрода находятся на верхней и нижней части трубки и образец загружается в полном объеме, а затем запечатывается на электропорации (Рисунок 1). В отличие от этого, в обычном кювете, электроды находятся по бокам и образец не полностью герметичен во время электропорации. Эта новая конструкция уменьшает генерацию воздушного пузыря и сжимает размер воздушного пузыря, что, следовательно, улучшает равномерноераспределение электрического напряжения, и в результате приводит к снижению клеточной смертности и высокой эффективности трансфекции 9. В настоящее время высокие показатели ПГЭ (15%-37%) были достигнуты ориентации EGFR, Mybpc3 и HBB генов в человеческих iPSCs. Эти результаты согласуются с предыдущим докладом, в котором высокие показатели PGE были достигнуты в стволовых клетках человека9.
Болезнетворные мутации были нацелены на гены IL2RG и SPR в клетках кролика. Недавно, IL2RG-нокаут кроликов были произведены в качестве моделей для человека X-связанных тяжелой комбинированной иммунодефицита (SCID-X1)16,17. Настоящая работа показывает, что мутации пациента IL2RG (например, C231Y и No235X) могут эффективно генерироваться в клетках кроликов, демонстрируя возможность создания моделей кроликов SCID-X1, несущих мутации пациентов. Было также продемонстрировано, что sPR R150G мутации могут быть эффективно созданы в клетках кролика. Эта мутация вызывает двигательные и когнитивные дефициты у детей12. Эти модели IL2RG и SPR мутации кролика, как только генерируется, может служить ценными доклинических моделей для трансляционных исследований. Они также могут быть использованы для создания генного редактирования на основе терапии для этих моногенных заболеваний.
Одной из проблем для CRISPR/Cas9-опосредованного редактирования генов приложений является вне цели редактирования событий. Indel ставки были проанализированы на прогнозируемых верхней вне целевых сайтов для sgRNAs, используемых в этом исследовании (Таблица S1), используя методы, ранее описанные9. В общей сложности, семь потенциальных верхней вне цели локусов были проанализированы для sg-rb-IL2RG-01, пять для sg-rb-SPR, семь для sg-hEGFR, пять для sg-hMybpc3, и семь для sg-hHBB), используя праймеры, перечисленные в таблице S2. Нет вне цели indels были выявлены T7E1 анализы (Рисунок S1), что свидетельствует о минимальных вне целевых рисков для CRISPR / Cas9-опосредованного редактирования генов с помощью этих sgRNAs. Это также указывает на то, что метод электропорации трубки сам по себе не вызывает и не увеличивает внецелевое количество внетарных ввода. Тем не менее усилия должны быть направлены на сокращение или ликвидацию нежелательных внецелевых внеадресных внештатных внештатных внештатных внештатных внештатных внештатных внештатных внештатных в Секвенирование всего генома может быть необходимо, чтобы исключить такие события для клеток, которые предназначены для использования в клинических приложениях.
На техническом уровне, следующие считаются ключевыми факторами для достижения эффективного точного редактирования генома crispR/Cas9 RNP трубки электропорации. Во-первых, рекомендуется выбрать эффективную sgRNA с прогнозируемым низким внецелевого потенциала. Важно проверить эффективность indel выбранного sgRNA перед использованием его для приложений PEG. Это не редкость, что программное обеспечение предсказал хороший sgRNA не удается на этапе проверки.
Во-вторых, для достижения высокого PGE, рекомендуется, чтобы вызвать мутации PAM к донору ssODN, когда это возможно. Обоснование заключается в том, что таким образом, CRISPR/Cas9 повторно сокращается после интеграции шаблонов донора. В некоторых случаях, PGE сам вводит PAM мутации. В других случаях можно ввести молчаливые мутации в последовательность PAM. В случае, если мутация PAM невозможна, рекомендуется попытаться включить в донора несколько молчаливых мутаций, что соответствует последовательности sgRNA.
В-третьих, особенно актуально для Т., важно избегать образования пузырьков воздуха при передаче клеток и смеси РНП в электропорацию трубки. В то время как конструкция трубки TE уже сводит к минимуму образование пузырьков воздуха, тщательная обработка еще больше уменьшит и может даже полностью избежать образования пузырьков воздуха. Неполадка съемки руководство для частых проблем, которые могут возникнуть в применении трубки электропорации для CRISPR/Cas9 рибонуклеопротеин опосредоненный точное редактирование генов предоставляется в таблице 2.
В заключение здесь показано, что электропорация труб является эффективным средством доставки CRISPR/Cas9 RNP и ssODNs к клеткам млекопитающих для достижения высоких показателей ПГЭ. Этот новый метод трансфекции TE и его надежная точная скорость редактирования генов могут способствовать разработке приложений для редактирования генов.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (R21OD023194 jX). В этой работе использовались основные услуги, поддерживаемые Центром перспективных моделей трансляционных наук и терапии (CAMTraST) при Медицинском центре Мичиганского университета.
Accutase | STEMCELL Technologies | 792 | Cell detachment solution for human iPSCs, first used in Step 1.1.2. |
Cas9 Nuclease 3NLS | IDT | 1074182 | Cas9 protein, first used in Step 3.3. |
DMEM | Thermo Fisher | 11965092 | For cell culture, first used in Step 1.2.3. |
DPBS | Thermo Fisher | 1708075 | For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. |
EDTA | Lonza | 51201 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
Electroporation buffer | Celetrix | 13–0104 | The electroporation buffer, first used in Step 3.2. |
Electroporation tubes | Celetrix | 20 μL: 12–0107; 120 μL: 12–0104 | The electroporation tube, first used in Step 3.4. |
Electroporator | Celetrix | CTX-1500A LE | The tube electroporation machine, first used in Step 3.5 |
Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | For cell culture, first used in Step 1.2.2. |
Forma CO2 Incubators | Thermo Fisher | Model 370 | For cell culture, first used in Step 1.1. |
Gel Extraction Kit | Qiagen | 28115 | For gel purification, first used in Step 4.3. |
Human induced pluripotent stem cells | American Type Culture Collection | ACS-1030 | Human iPSCs, first used in Step 1.1. |
Matrigel | Corning | 354277 | Artificial extracellular matrix; for precoating cell culture plate, first used in Step 1.1. |
mTeSR 1 medium | STEMCELL Technologies | 85850 | Feeder-free cell culture medium for human iPSCs, first used in Step 1.1. |
PCR SV mini | GeneAll | 103-102 | For PCR product purification, first used in Step 4.3. |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. |
Phenol-chloroform | Thermo Fisher | 15593031 | For DNA extraction, first used in Step 4.2. |
Precision gRNA Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For the generation of full length gRNA (guide RNA), first used in Step 2.4. |
Proteinase K Solution | Thermo Fisher | AM2548 | For DNA extraction, first used in Step 4.1. |
Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491 | For PCR amplification, first used in Step 4.3. |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
TA Cloning Kit | Thermo Fisher | K457502 | For TA clone sequencing, first used in Step 4.4. |
Tissue Culture Dish (10 cm) | FALCON | 353003 | For cell culture, first used in Step 1.2.3. |
Tissue Culture Dish (12 well) | FALCON | 353043 | For cell culture, first used in Step 3.7. |
Tissue Culture Dish (6 cm) | FALCON | 353004 | For cell culture, first used in Step 1.2.2. |
Tris HCl | Thermo Fisher | BP1757-500 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200056 | For cell digestion, first used in Step 1.2. 4. |
Universal Fit Pipette Tips | Celetrix | 14-0101 | For electroporation, first used in Step 3.4. |
Y27632 | LC Labs | Y-5301 | The apoptosis inhibotor, first used in Step 1.1.1. |