CRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質媒介精密遺伝子編集チューブエレクトロポレーション
Summary
ここに提示される、チューブエレクトロポレーションを用いて哺乳動物細胞における効率的なCRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質媒介遺伝子編集のためのプロトコルである。
Abstract
CRISPR関連タンパク質9(Cas9)に代表される遺伝子編集ヌクレアーゼは、生物医学研究の主流ツールになりつつあります。トランスフェクションによる標的細胞へのCRISPR/Cas9要素の正常な送達は、効率的な遺伝子編集の前提条件です。このプロトコルは、異なるタイプの哺乳動物細胞に対する一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(ssODN)ドナーテンプレートと共に、CRISPR/Cas9リボヌクレオプロテイン(RNP)のチューブエレクトロポレーション(TE)機械媒介送達が堅牢につながることを示しています。正確な遺伝子編集イベント。まず、TEを適用して、ウサギ線維芽細胞細胞におけるインターロイキン2受容体サブユニットγ(IL2RG)遺伝子およびセピアプテリン還元酵素(SPR)遺伝子における疾患を引き起こす変異を誘導するためにCRISPR/Cas9 RNPおよびsSODNを誘導した。3.57%-20%の正確な突然変異率は、細菌TAクローニングシーケンシングによって決定されたとおりに達成された。同じ戦略は、表皮成長因子受容体(EGFR)、ミオシン結合タンパク質C、心臓(Mybpc3)、ヘモグロビンサブユニットベータ(HBB)を含むいくつかの臨床的に関連する遺伝子上のヒトiPSCで使用された。一貫して、高精度の突然変異率を達成した(11.65%-37.92%)深いシーケンス(DeepSeq)によって決定されます。本研究は、CRISPR/Cas9 RNPのチューブエレクトロポレーションが哺乳動物細胞における遺伝子編集のための効率的なトランスフェクションプロトコルを表していることを示している。
Introduction
CRISPR/Cas9は遺伝子編集のために最も一般的に使用されるプログラム可能なヌクレアーゼである。これは、ゲノム内の標的配列と隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列の単一ガイドRNA(sgRNA)媒介認識を介して動作します。Cas9ヌクレアーゼは、PAM配列1の上流に3つのヌクレオチドに位置する二本鎖DNA破断(DSB)を生成する。DSB は、エラーが発生しやすい非相同エンド 結合 (NHEJ) または相同指向修復 (HDR) 経路を介して修復されます。HDR経路を介して正確な遺伝子編集を達成するために、ドナーテンプレートは、多くの場合、プラスミドDNA(pDNA)または一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(ssODN)の形式で提供される。
CRISPR/Cas9およびsgRNAは、Cas9タンパク質およびgRNA2、3のリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体の3つのフォーマットで細胞に送達することができる。Cas9 mRNA および sgRNA4,5;または必要なプロモーターを含むプラスミドDNA(pDNA)、駆動sgRNA、およびCas9コード領域6、7、8を含む。多くのグループは、CRISPR/Cas9がRNPとして送達されるとき、遺伝子編集効率が多くの場合、核酸9と比較してRNPのはるかに小さいサイズに起因するpDNAまたはmRNAフォーマットで達成されるものよりも優れていることを実証しています。さらに、新規チューブエレクトロポレーション(TE)機械が複数の細胞タイプ9における遺伝子編集用途において特に有効であることが以前に示されている。
本研究で提示されるのは、いくつかの臨床的に関連する遺伝子座で異なる種の哺乳動物細胞にCRISPR/Cas9 RNPを送達するためのTEを利用するステップバイステッププロトコルである。この新しいTEトランスフェクション技術と高いHDRレート現象は、生物医学研究における幅広い応用を見出すかもしれない。
Protocol
Representative Results
Discussion
このチューブエレクトロポレーション法は、CRISPR/Cas9 RNPおよびssODNをウサギおよびヒト細胞に送り出すのに有効であり、堅牢な精密遺伝子編集(PGE)を導いた。TE と他の従来のエレクトロポレーション デバイスとの主な違いは、2 つの電極がチューブの上部と下部にあり、サンプルが完全に装填され、エレクトロポレーション時に密封されるチューブの使用です (図1)。対照的に、従来のキュベットでは、電極は側面にあり、サンプルはエレクトロポレーション中に完全に密閉されていません。この新しい設計は気泡の発生を減らし、その結果、電気電圧の配分を改善し、その結果、細胞死の減少および高いトランスフェクション効率9につながる気泡のサイズを圧縮する。本研究では、高いPGE率(15%-37%)ヒトiPSCにおけるEGFR、Mybpc3およびHBB遺伝子を標的に達成された。これらの結果は、ヒト幹細胞9で高いPGE率が達成された以前の報告と一致している。
疾患を引き起こす変異は、ウサギ細胞のIL2RGおよびSPR遺伝子を標的とした。近年、IL2RGノックアウトウサギは、ヒトX結合重篤な複合免疫不全(SCID-X1)16、17のモデルとして製造されている。本研究は、患者IL2RG変異(例えば、C231YおよびQ235X)がウサギ細胞で効率的に生成できることを示し、患者変異を担うSCID-X1ウサギモデルを作成する可能性を実証する。また、SPR R150G変異がウサギ細胞で効率的に作成できることも実証された。この突然変異は、小児12の運動および認知障害を引き起こす。これらのIL2RGおよびSPR変異ウサギモデルは、一度生成されると、翻訳研究のための貴重な前臨床モデルとして役立つ可能性がある。これらの単原性疾患に対する遺伝子編集ベースの治療薬を確立するためにも使用できます。
CRISPR/Cas9媒介遺伝子編集アプリケーションの懸念事項の1つは、オフターゲット編集イベントです。インデル率は、前述の9を用いた方法を用いて、本研究で用いられるsgRNAの予測トップオフターゲット部位(表S1)で分析した。合計で、7つの潜在的なトップオフターゲット遺伝子座は、表S2に記載されているプライマーを使用して、sg-rb-IL2RG-01、sg-rb-SPRの5つ、sg-hEGFRの場合は7つ、sg-hBbpc3の場合は5つ、sg-hHBB用は7つ、表S2に記載されているプライマーを用いて分析した。T7E1アッセイ(図S1)では、これらのsgRNAを用いたCRISPR/Cas9媒介遺伝子編集のオフターゲットリスクを最小限に抑えるオフターゲットインデルは明らかにされませんでした。また、チューブエレクトロポレーション方法自体がオフターゲット編集を引き起こしたり増加させたりしないことを示します。それにもかかわらず、望ましくないオフターゲット編集を減らすか、または排除するための努力が必要です。全ゲノムシーケンシングは、臨床応用に使用されることを意図した細胞に対してそのような事象を除外する必要があるかもしれない。
技術レベルでは、CRISPR/Cas9 RNPチューブエレクトロポレーションによる効率的な正確なゲノム編集を達成するための重要な要素と考えられています。まず、予測された低いターゲット電位を持つ効率的なsgRNAを選択することをお勧めします。PEGアプリケーションに使用する前に、選択したsgRNAのインデル効率を検証することが重要です。ソフトウェアが検証ステップで良好な sgRNA が失敗すると予測することはまれではありません。
第二に、高いPGEを達成するために、可能な限りssODNドナーにPAM変異を誘導することが推奨される。その根拠は、そうすることで、ドナーテンプレートの統合が妨げられた後にCRISPR/Cas9を再切断するということです。場合によっては、PGE 自体が PAM 変異を導入します。他のケースでは、PAM配列にサイレント変異を導入することができる。PAM突然変異が不可能な場合は、sgRNA配列に対応するドナーにいくつかの無声変異を含めようとすることをお勧めします。
第三に、特にTEに関連し、細胞およびRNP混合物をエレクトロポレーションチューブに移す際に気泡の形成を避ける必要がある。TEチューブの設計は既に気泡の形成を最小限に抑えますが、慎重な取り扱いはさらに減少し、気泡の形成を完全に回避する可能性があります。CRISPR/Cas9リボヌクレオプロテインのチューブエレクトロポレーションの適用で発生する可能性のある頻繁な問題に関するトラブルシューティングガイドを、正確な遺伝子編集を媒介する問題を表2に示す。
結論として、チューブエレクトロポレーションは、高いPGEレートを達成するために、哺乳動物細胞にCRISPR/Cas9 RNPおよびsSODNを送達するための有効な手段であることをここで実証されています。この新しいTEトランスフェクション技術とその堅牢な精密遺伝子編集速度は、遺伝子編集アプリケーションの開発を容易にする可能性があります。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所(R21OD023194からJX)によってサポートされました。本研究は、ミシガン大学医療センターの翻訳科学・治療研究センター(CAMTraST)が支援するコアサービスを活用しました。
Materials
| Accutase | STEMCELL Technologies | 792 | Cell detachment solution for human iPSCs, first used in Step 1.1.2. |
| Cas9 Nuclease 3NLS | IDT | 1074182 | Cas9 protein, first used in Step 3.3. |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965092 | For cell culture, first used in Step 1.2.3. |
| DPBS | Thermo Fisher | 1708075 | For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. |
| EDTA | Lonza | 51201 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
| Electroporation buffer | Celetrix | 13–0104 | The electroporation buffer, first used in Step 3.2. |
| Electroporation tubes | Celetrix | 20 μL: 12–0107; 120 μL: 12–0104 | The electroporation tube, first used in Step 3.4. |
| Electroporator | Celetrix | CTX-1500A LE | The tube electroporation machine, first used in Step 3.5 |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | For cell culture, first used in Step 1.2.2. |
| Forma CO2 Incubators | Thermo Fisher | Model 370 | For cell culture, first used in Step 1.1. |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28115 | For gel purification, first used in Step 4.3. |
| Human induced pluripotent stem cells | American Type Culture Collection | ACS-1030 | Human iPSCs, first used in Step 1.1. |
| Matrigel | Corning | 354277 | Artificial extracellular matrix; for precoating cell culture plate, first used in Step 1.1. |
| mTeSR 1 medium | STEMCELL Technologies | 85850 | Feeder-free cell culture medium for human iPSCs, first used in Step 1.1. |
| PCR SV mini | GeneAll | 103-102 | For PCR product purification, first used in Step 4.3. |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. |
| Phenol-chloroform | Thermo Fisher | 15593031 | For DNA extraction, first used in Step 4.2. |
| Precision gRNA Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For the generation of full length gRNA (guide RNA), first used in Step 2.4. |
| Proteinase K Solution | Thermo Fisher | AM2548 | For DNA extraction, first used in Step 4.1. |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491 | For PCR amplification, first used in Step 4.3. |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
| TA Cloning Kit | Thermo Fisher | K457502 | For TA clone sequencing, first used in Step 4.4. |
| Tissue Culture Dish (10 cm) | FALCON | 353003 | For cell culture, first used in Step 1.2.3. |
| Tissue Culture Dish (12 well) | FALCON | 353043 | For cell culture, first used in Step 3.7. |
| Tissue Culture Dish (6 cm) | FALCON | 353004 | For cell culture, first used in Step 1.2.2. |
| Tris HCl | Thermo Fisher | BP1757-500 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200056 | For cell digestion, first used in Step 1.2. 4. |
| Universal Fit Pipette Tips | Celetrix | 14-0101 | For electroporation, first used in Step 3.4. |
| Y27632 | LC Labs | Y-5301 | The apoptosis inhibotor, first used in Step 1.1.1. |
References
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mout, R., et al. Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing. ACS Nano. 11 (3), 2452-2458 (2017).
- Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
- Miller, J. B., et al. Non-Viral CRISPR/Cas Gene Editing In Vitro and In Vivo Enabled by Synthetic Nanoparticle Co-Delivery of Cas9 mRNA and sgRNA. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (4), 1059-1063 (2017).
- Finn, J. D., et al. A Single Administration of CRISPR/Cas9 Lipid Nanoparticles Achieves Robust and Persistent In Vivo Genome Editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
- Liang, C., et al. Tumor cell-targeted delivery of CRISPR/Cas9 by aptamer-functionalized lipopolymer for therapeutic genome editing of VEGFA in osteosarcoma. Biomaterials. 147, 68-85 (2017).
- Luo, Y. L., et al. Macrophage-Specific in Vivo Gene Editing Using Cationic Lipid-Assisted Polymeric Nanoparticles. ACS Nano. 12 (2), 994-1005 (2018).
- Wang, H. X., et al. Nonviral gene editing via CRISPR/Cas9 delivery by membrane-disruptive and endosomolytic helical polypeptide. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4903-4908 (2018).
- Xu, X., et al. Efficient homology-directed gene editing by CRISPR/Cas9 in human stem and primary cells using tube electroporation. Scientific Reports. 8 (1), 11649 (2018).
- Du, F., et al. Beneficial effect of young oocytes for rabbit somatic cell nuclear transfer. Cloning Stem Cells. 11 (1), 131-140 (2009).
- Allenspach, E., Rawlings, D. J., Scharenberg, A. M., Adam, M. P., et al. . GeneReviews(R). , (1993).
- Friedman, J., et al., Adam, M. P., et al. . GeneReviews(R). , (1993).
- Hidaka, N., et al. Most T790M mutations are present on the same EGFR allele as activating mutations in patients with non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 108, 75-82 (2017).
- Ma, H., et al. Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos. Nature. 548 (7668), 413-419 (2017).
- Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
- Song, J., et al. Bacterial and Pneumocystis Infections in the Lungs of Gene-Knockout Rabbits with Severe Combined Immunodeficiency. Frontiers in Immunology. 9, 429 (2018).
- Song, J., et al. Production of immunodeficient rabbits by multiplex embryo transfer and multiplex gene targeting. Scientific Reports. 7 (1), 12202 (2017).
