Aquí se presenta un protocolo para la edición eficiente de genes mediados por ribonucleoproteína CRISPR/Cas9 en células de mamíferos mediante electroporación de tubos.
Las nucleasas de edición de genes, representadas por la proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9), se están convirtiendo en herramientas principales en la investigación biomédica. La entrega exitosa de elementos CRISPR/Cas9 en las células objetivo por transfección es un requisito previo para una edición eficiente de genes. Este protocolo demuestra que la administración mediada por máquina de electroporación de tubos (TE) de ribonucleoproteína CRISPR/Cas9 (RNP), junto con plantillas de donantes de oligodesoxinucleótido de una sola cadena (ssODN) a diferentes tipos de células de mamíferos, conduce a plantillas robustas de donantes de oligodesoxinucleótidos (ssODN) a diferentes tipos de células de mamíferos, conduce a plantillas robustas de donantes de oligodesoxinucleótidos (ssODN) a diferentes tipos de células de mamíferos, conduce a plantillas robustas de donantes de oligodesoxinucleótidos (ssODN) a diferentes tipos de células de mamíferos, eventos precisos de edición genética. En primer lugar, se aplicó TE para suministrar CRISPR/Cas9 RNP y ssODN para inducir mutaciones causantes de enfermedades en el gen gamma de subunidad receptora interleucina 2 (IL2RG) y en el gen de la sepiapterina reductasa (SPR) en células fibroblastas de conejo. Se lograron tasas de mutación precisas de 3,57%-20% según lo determinado por la secuenciación bacteriana de la clonación TA. La misma estrategia se utilizó entonces en iPSCs humanos en varios genes clínicamente relevantes, incluyendo receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), proteína de unión a la miosina C, cardiaco (Mybpc3), y subunidad beta de hemoglobina (HBB). Consistentemente, se lograron tasas de mutación de alta precisión (11,65%-37,92%) según lo determinado por la secuenciación profunda (DeepSeq). El presente trabajo demuestra que la electroporación de tubos de CRISPR/Cas9 RNP representa un protocolo de transfección eficiente para la edición de genes en células de mamíferos.
CRISPR/Cas9 es la nucleasa programable más utilizada para la edición de genes. Funciona a través del reconocimiento mediado por ARN de guía única (sgRNA) de ambas secuencias diana y una secuencia de motivo adyacente protoespacial (PAM) adyacente en el genoma. La nucleasa Cas9 genera una rotura de ADN de doble cadena (DSB) ubicada tres nucleótidos aguas arriba de la secuencia PAM1. Los DSB se reparan a través de vías de unión final no homólogas (NHEJ) propensas a errores o de reparación dirigida por homología (HDR). Para lograr una edición génica precisa a través de la vía HDR, las plantillas de donantes a menudo se proporcionan en el formato de ADN plásmido (PDNA) o oligodesoxinucleótido de una sola cadena (ssODN).
CRISPR/Cas9 y el sgRNA se pueden suministrar a las células en tres formatos: el complejo de ribonucleoproteína (RNP) de la proteína Cas9 y el gRNA2,3; Cas9 mRNA y sgRNA4,5; o ADN plásmido (pDNA) que contiene los promotores necesarios, sgRNA accionado, y la región de codificación Cas96,7,8. Muchos grupos han demostrado que cuando CRISPR/Cas9 se administra como RNP, la eficiencia de edición de genes a menudo supera a los logrados enformatos pDNA o ARNm, atribuibles al tamaño mucho menor de RNP en comparación con los ácidos nucleicos 9. Además, se ha demostrado anteriormente que una nueva máquina de electroporación detubos (TE) es particularmente eficaz en aplicaciones de edición de genes en varios tipos de células 9.
En el presente trabajo se presenta un protocolo paso a paso en la utilización de TE para la entrega de CRISPR/Cas9 RNP a células de mamíferos de diferentes especies en varios loci clínicamente relevantes. Esta novedosa técnica de transfección TE y el fenómeno de alta tasa HDR pueden encontrar amplias aplicaciones en la investigación biomédica.
El método de electroporación de tubos fue eficaz en la entrega de CRISPR/Cas9 RNP y ssODN a células de conejo y humanos, lo que llevó a una sólida edición de genes preciso (PGE). La principal diferencia entre TE y otros dispositivos de electroporación convencionales es el uso de un tubo, en el que dos electrodos están en la parte superior e inferior del tubo y la muestra se carga en su totalidad y luego se sella sobre la electroporación (Figura1). Por el contrario, en una cubeta convencional, los electrodos están en los lados y la muestra no está completamente sellada durante la electroporación. Este nuevo diseño reduce la generación de burbujas de aire y comprime el tamaño de la burbuja de aire,lo que por lo tanto mejora la distribución uniforme de la tensión eléctrica, y como resultado conduce a una reducción de la mortalidad celular y una alta eficiencia de transfección 9. En el presente trabajo, altas tasas de PGE (15%-37%) se lograron apuntando a los genes EGFR, Mybpc3 y HBB en iPSCs humanos. Estos resultados son consistentes con un informe previo en elque se lograron altas tasas de PGE en células madre humanas 9.
Las mutaciones causantes de enfermedades se dirigieron a los genes IL2RG y SPR en células de conejo. Recientemente, los conejos IL2RG-knockout se han producido como modelos para la inmunodeficiencia combinada grave ligada al X humano (SCID-X1)16,17. El presente trabajo muestra que las mutaciones del paciente IL2RG (por ejemplo, C231Y y Q235X) se pueden generar eficientemente en células de conejo, demostrando la viabilidad de crear modelos de conejoS-X1 portadores de mutaciones de pacientes. También se demostró que las mutaciones SPR R150G se pueden crear eficientemente en células de conejo. Esta mutación causa déficits motores y cognitivos en niños12. Estos modelos de conejodes de mutación IL2RG y SPR, una vez generados, pueden servir como valiosos modelos preclínicos para estudios traslacionales. También se pueden utilizar para establecer terapias basadas en la edición de genes para estas enfermedades monogénicas.
Una preocupación para las aplicaciones de edición de genes mediadas por CRISPR/Cas9 son los eventos de edición fuera de destino. Las tasas de indel se analizaron en los sitios de destino superior previstos para los sgRNA utilizados en este estudio (TablaS1), utilizando métodos descritos anteriormente9. En total, se analizaron siete loci potenciales de la parte superior fuera de la diana para sg-rb-IL2RG-01, cinco para sg-rb-SPR, siete para sg-hEGFR, cinco para sg-hMybpc3 y siete para sg-hHBB), utilizando los imprimadores enumerados en la Tabla S2. Los ensayos T7E1 (FiguraS1)no revelaron indels fuera del objetivo, lo que indica los riesgos mínimos fuera del objetivo para la edición genética mediada por CRISPR/Cas9 utilizando estos sgRNAs. También indica que el método de electroporación de tubo en sí no causa o aumenta las ediciones fuera del objetivo. Sin embargo, los esfuerzos deben dedicarse a reducir o eliminar las ediciones indeseables fuera del objetivo. La secuenciación del genoma completo puede ser necesaria para excluir tales eventos para las células que están destinadas a ser utilizadas en aplicaciones clínicas.
A nivel técnico, los siguientes son factores clave para lograr una edición eficiente y precisa del genoma mediante la electroporación del tubo CRISPR/Cas9 RNP. En primer lugar, se recomienda seleccionar un sgRNA eficiente con un potencial predicho bajo fuera de objetivo. Es importante validar la eficiencia indel del sgRNA seleccionado antes de usarlo para aplicaciones PEG. No es raro que un software predijo un buen sgRNA falla en el paso de validación.
En segundo lugar, para lograr un ALTO PGE, se recomienda inducir una mutación PAM al donante ssODN siempre que sea posible. La razón es que al hacerlo, se evita el recorte CRISPR/Cas9 después de que se prevenga la integración de la plantilla de donante. En algunos casos, el propio PGE introduce mutaciones PAM. En otros casos, es posible introducir mutaciones silenciosas en la secuencia de PAM. En caso de que una mutación PAM no sea posible, se aconseja tratar de incluir varias mutaciones silenciosas en el donante que corresponde a la secuencia de sgRNA.
En tercer lugar, particularmente relevante para TE, es importante evitar la formación de burbujas de aire al transferir células y mezcla RNP al tubo de electroporación. Mientras que el diseño de un tubo TE ya minimiza la formación de burbujas de aire, un manejo cuidadoso reducirá aún más e incluso puede completar evitar la formación de burbujas de aire. En la Tabla 2se proporciona una guía de resolución de problemas para problemas frecuentes que se pueden encontrar en la aplicación de electroporación de tubos para la edición precisa de genes mediada por ribonucleoproteína CRISPR/Cas9.
En conclusión, aquí se demuestra que la electroporación de tubos es un medio eficaz para la administración de CRISPR/Cas9 RNP y ssODN a células de mamíferos para lograr altas tasas de PGE. Esta nueva técnica de transfección TE y su robusta y precisa tasa de edición genética pueden facilitar el desarrollo de aplicaciones de edición de genes.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R21OD023194 a JX). Este trabajo utilizó Core Services apoyado por Center for Advanced Models for Translational Sciences and Therapeutics (CAMTraST) en el Centro Médico de la Universidad de Michigan.
Accutase | STEMCELL Technologies | 792 | Cell detachment solution for human iPSCs, first used in Step 1.1.2. |
Cas9 Nuclease 3NLS | IDT | 1074182 | Cas9 protein, first used in Step 3.3. |
DMEM | Thermo Fisher | 11965092 | For cell culture, first used in Step 1.2.3. |
DPBS | Thermo Fisher | 1708075 | For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. |
EDTA | Lonza | 51201 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
Electroporation buffer | Celetrix | 13–0104 | The electroporation buffer, first used in Step 3.2. |
Electroporation tubes | Celetrix | 20 μL: 12–0107; 120 μL: 12–0104 | The electroporation tube, first used in Step 3.4. |
Electroporator | Celetrix | CTX-1500A LE | The tube electroporation machine, first used in Step 3.5 |
Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | For cell culture, first used in Step 1.2.2. |
Forma CO2 Incubators | Thermo Fisher | Model 370 | For cell culture, first used in Step 1.1. |
Gel Extraction Kit | Qiagen | 28115 | For gel purification, first used in Step 4.3. |
Human induced pluripotent stem cells | American Type Culture Collection | ACS-1030 | Human iPSCs, first used in Step 1.1. |
Matrigel | Corning | 354277 | Artificial extracellular matrix; for precoating cell culture plate, first used in Step 1.1. |
mTeSR 1 medium | STEMCELL Technologies | 85850 | Feeder-free cell culture medium for human iPSCs, first used in Step 1.1. |
PCR SV mini | GeneAll | 103-102 | For PCR product purification, first used in Step 4.3. |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. |
Phenol-chloroform | Thermo Fisher | 15593031 | For DNA extraction, first used in Step 4.2. |
Precision gRNA Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For the generation of full length gRNA (guide RNA), first used in Step 2.4. |
Proteinase K Solution | Thermo Fisher | AM2548 | For DNA extraction, first used in Step 4.1. |
Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491 | For PCR amplification, first used in Step 4.3. |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
TA Cloning Kit | Thermo Fisher | K457502 | For TA clone sequencing, first used in Step 4.4. |
Tissue Culture Dish (10 cm) | FALCON | 353003 | For cell culture, first used in Step 1.2.3. |
Tissue Culture Dish (12 well) | FALCON | 353043 | For cell culture, first used in Step 3.7. |
Tissue Culture Dish (6 cm) | FALCON | 353004 | For cell culture, first used in Step 1.2.2. |
Tris HCl | Thermo Fisher | BP1757-500 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200056 | For cell digestion, first used in Step 1.2. 4. |
Universal Fit Pipette Tips | Celetrix | 14-0101 | For electroporation, first used in Step 3.4. |
Y27632 | LC Labs | Y-5301 | The apoptosis inhibotor, first used in Step 1.1.1. |