Presenteras här är ett protokoll för effektiv CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-medierad gen redigering i däggdjurs celler med hjälp av rör elektroporation.
Genredigerande nukleaser, föret rädda av CRISPR-Associated protein 9 (Cas9), blir mainstream verktyg inom biomedicinsk forskning. Framgångs rik leverans av CRISPR/Cas9 element till mål cellerna genom transfektion är en förutsättning för effektiv gen redigering. Detta protokoll visar att rör elektroporation (te) maskinmedierad tillförsel av crispr/Cas9 ribonukleoprotein (RNP), tillsammans med enkelsträngade givar mallar för oligodeoxinukleotidsyntes (ssodn) till olika typer av däggdjurs celler, leder till robusta exakta gen redigerings händelser. Först, te tillämpades för att leverera crispr/Cas9 RNP och ssodns att inducera sjukdomsframkallande mutationer i interleukin 2 receptor subenhet gamma (IL2RG) genen och sepiapterin reduktas (SPR) genen i kanin fibroblast celler. Exakta mutations frekvenser på 3.57% uppnåddes som bestämdes av bakteriell TA-klonings-sekvensering. Samma strategi användes sedan i mänskliga ipscs på flera kliniskt relevanta gener inklusive Epidermal tillväxtfaktor receptor (EGFR), myosin bindande protein C, hjärt (Mybpc3), och hemoglobin subenhet beta (HBB). Konsekvent, mycket exakta mutations frekvenser uppnåddes (11.65%-37,92%) bestäms av djup sekvensering (DeepSeq). Det nuvarande arbetet visar att tubelektroporation av CRISPR/Cas9 RNP representerar ett effektivt transfektionssystem för gen editering i däggdjurs celler.
CRISPR/Cas9 är den mest använda programmerbara nukleasen för gen redigering. Det fungerar genom single guide RNA (sgRNA)-medierad erkännande av både målsekvenser och en intilliggande protospacer intilliggande motiv (PAM) sekvens i genomet. Den Cas9 nuclease genererar en dubbelsträngad DNA-paus (DSB) ligger tre nukleotider uppströms PAM sekvens1. De DSBs repare ras antingen genom fel benägna icke-homologa sammanfogning (NHEJ) eller Homology-riktad reparation (HDR) vägar. För att uppnå exakt gen editering genom HDR-vägen ges ofta givar mallar i formatet plasmid DNA (pDNA) eller enkelsträngad oligodeoxynucleotid (ssODN).
Crispr/Cas9 och sgrna kan levereras till cellerna i tre format: ribonukleoprotein (RNP) komplex av Cas9 protein och grna2,3; Cas9 mRNA och sgrna4,5; eller plasmid DNA (pdna) som innehåller nödvändiga initiativtagare, driven sgrna, och Cas9 kodning region6,7,8. Många grupper har visat att när CRISPR/Cas9 levereras som RNP, den gen redigering effektivitet överträffar ofta de som uppnås i pDNA eller mRNA format, som kan hänföras till den mycket mindre storlek RNP jämfört med nukleinsyror9. Dessutom har det tidigare visats att en ny rör elektroporation (TE)-maskin är särskilt effektiv vid gen editerings tillämpningar i flera cell typer9.
Presenteras i det nuvarande arbetet är ett steg-för-steg-protokoll för att använda TE för leverans av CRISPR/Cas9 RNP till däggdjurs celler av olika arter vid flera kliniskt relevanta loci. Denna roman TE transfektion teknik och hög HDR frekvens fenomen kan hitta breda tillämpningar inom biomedicinsk forskning.
Röret elektroporation metod var effektivt för att leverera CRISPR/Cas9 RNP och ssODNs till kanin och mänskliga celler, vilket leder till robust exakt gen redigering (PGE). Den främsta skillnaden mellan TE och andra konventionella elektroporation anordningar är användningen av ett rör, där två elektroder är på toppen och botten av röret och provet lastas i sin helhet sedan förseglade på elektroporation (figur 1). Däremot, i en konventionell kyvetten, elektroderna är på sidorna och provet är inte helt förseglade under elektroporation. Denna nya design minskar luft bubblor generation och komprimerar luft bubbla storlek, vilket därmed förbättrar även distribution av elektrisk spänning, och som ett resultat leder till minskad celldöd och hög transfektion effektivitet9. I det nuvarande arbetet har höga PGE-räntor (15%-37%) uppnåddes riktade mot EGFR-, Mybpc3-och HBB-gener i humana iPSCs. Dessa resultat överensstämmer med en tidigare rapport där höga PGE-frekvenser uppnåddes i mänskliga stamceller9.
Sjukdomsframkallande mutationer var inriktade på IL2RG och SPR gener i kanin celler. Nyligen har IL2RG-knockout kaniner producerats som modeller för mänskliga X-länkade svår kombinerad immun brist (scid-x1)16,17. Det nuvarande arbetet visar att patient IL2RG mutationer (t. ex. C231Y och Q235X) effektivt kan genereras i kanin celler, vilket visar möjligheten att skapa SCID-x1 kanin modeller redovisade patient mutationer. Det visades också att SPR R150G-mutationer effektivt kan skapas i kanin celler. Denna mutation orsakar motoriska och kognitiva underskott hos barn12. Dessa IL2RG och SPR mutation kanin modeller, en gång genererade, kan tjäna som värdefulla prekliniska modeller för translationella studier. De kan också användas för att etablera genredigeringsbaserade terapier för dessa monogena sjukdomar.
Ett bekymmer för CRISPR/Cas9-medierade gen redigerings program är off-Target redigering händelser. Indel-kurserna analyserades vid förutsedda topp-off-Target-platser för sgRNAs som användes i denna studie (tabell S1), med metoder som tidigare beskrivits9. Sammanlagt analyserades sju potentiella topp-Target loci för SG-RB-IL2RG-01, fem för SG-RB-SPR, sju för SG-hEGFR, fem för SG-hMybpc3 och sju för SG-hHBB), med primers listade i tabell S2. Ingen off-Target indels avslöjades av T7E1 analyser (figur S1), vilket tyder på minimala off-Target risker för crispr/Cas9-medierad gen redigering med hjälp av dessa sgRNAs. Det visar också att röret elektroporation metoden i sig inte orsakar eller öka off-Target redigeringar. Insatserna bör dock inriktas på att minska eller eliminera oönskade redigeringar utanför mål. Hel-genom-sekvensering kan behövas för att utesluta sådana händelser för celler som är avsedda att användas i kliniska tillämpningar.
På teknisk nivå anses följande vara viktiga faktorer för att uppnå effektiv exakt genom redigering av CRISPR/Cas9 RNP Tube electroporation. Först är det klokt att välja en effektiv sgRNA med förväntad låg off-Target potential. Det är viktigt att validera indel effektiviteten i den valda sgRNA innan du använder den för PEG applikationer. Det är inte ovanligt att en program vara förutspådde bra sgRNA Miss lyckas vid validerings steget.
För det andra, för att uppnå hög PGE, rekommenderas att inducera en PAM mutation till ssODN givaren när det är möjligt. Logiken är att genom att göra så, CRISPR/Cas9 re-Cutting efter givar mal len integration förhindras. I vissa fall introducerar PGE själv PAM-mutationer. I andra fall är det möjligt att introducera tysta mutationer i PAM-sekvensen. I händelse av att en PAM-mutation inte är möjlig, är det tillrådligt att försöka inkludera flera tysta mutationer i givaren som motsvarar sgRNA sekvens.
För det tredje, särskilt relevant för TE, är det viktigt att undvika bildandet av luft bubblor vid överföring av celler och RNP blandning till elektroporation röret. Medan utformningen av en TE-röret minimerar redan luft bubbla bildas, noggrann hantering kommer att ytterligare minska och kan även slutföra undvika luft bubbla formation. En fel sökning guide för frekventa problem som kan uppstå vid applicering av rör elektroporation för CRISPR/Cas9 ribonukleoprotein medierad exakt gen redigering finns i tabell 2.
Sammanfattnings vis är det visat här att röret elektroporation är ett effektivt sätt för leverans av CRISPR/Cas9 RNP och ssODNs till däggdjurs celler för att uppnå höga PGE priser. Denna nya TE-transfektion teknik och dess robusta exakta gen redigering hastighet kan under lätta utvecklingen av gen redigerings program.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av de nationella hälso instituten (R21OD023194 till JX). Detta arbete utnyttjas Core Services stöds av centrum för avancerade modeller för translationell vetenskap och Therapeutics (CAMTraST) vid University of Michigan Medical Center.
Accutase | STEMCELL Technologies | 792 | Cell detachment solution for human iPSCs, first used in Step 1.1.2. |
Cas9 Nuclease 3NLS | IDT | 1074182 | Cas9 protein, first used in Step 3.3. |
DMEM | Thermo Fisher | 11965092 | For cell culture, first used in Step 1.2.3. |
DPBS | Thermo Fisher | 1708075 | For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. |
EDTA | Lonza | 51201 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
Electroporation buffer | Celetrix | 13–0104 | The electroporation buffer, first used in Step 3.2. |
Electroporation tubes | Celetrix | 20 μL: 12–0107; 120 μL: 12–0104 | The electroporation tube, first used in Step 3.4. |
Electroporator | Celetrix | CTX-1500A LE | The tube electroporation machine, first used in Step 3.5 |
Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | For cell culture, first used in Step 1.2.2. |
Forma CO2 Incubators | Thermo Fisher | Model 370 | For cell culture, first used in Step 1.1. |
Gel Extraction Kit | Qiagen | 28115 | For gel purification, first used in Step 4.3. |
Human induced pluripotent stem cells | American Type Culture Collection | ACS-1030 | Human iPSCs, first used in Step 1.1. |
Matrigel | Corning | 354277 | Artificial extracellular matrix; for precoating cell culture plate, first used in Step 1.1. |
mTeSR 1 medium | STEMCELL Technologies | 85850 | Feeder-free cell culture medium for human iPSCs, first used in Step 1.1. |
PCR SV mini | GeneAll | 103-102 | For PCR product purification, first used in Step 4.3. |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. |
Phenol-chloroform | Thermo Fisher | 15593031 | For DNA extraction, first used in Step 4.2. |
Precision gRNA Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For the generation of full length gRNA (guide RNA), first used in Step 2.4. |
Proteinase K Solution | Thermo Fisher | AM2548 | For DNA extraction, first used in Step 4.1. |
Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491 | For PCR amplification, first used in Step 4.3. |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
TA Cloning Kit | Thermo Fisher | K457502 | For TA clone sequencing, first used in Step 4.4. |
Tissue Culture Dish (10 cm) | FALCON | 353003 | For cell culture, first used in Step 1.2.3. |
Tissue Culture Dish (12 well) | FALCON | 353043 | For cell culture, first used in Step 3.7. |
Tissue Culture Dish (6 cm) | FALCON | 353004 | For cell culture, first used in Step 1.2.2. |
Tris HCl | Thermo Fisher | BP1757-500 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200056 | For cell digestion, first used in Step 1.2. 4. |
Universal Fit Pipette Tips | Celetrix | 14-0101 | For electroporation, first used in Step 3.4. |
Y27632 | LC Labs | Y-5301 | The apoptosis inhibotor, first used in Step 1.1.1. |