Summary
Denne protokol er en vejledning til gennemførelse af interferens refleksion mikroskopi på et standard fluorescens mikroskop til etiket-fri, høj-kontrast, høj-hastighed billeddannelse af microtubuler ved hjælp af in vitro-overflader assays.
Abstract
Der er flere metoder til visualisering af rensede biomolekyler nær overflader. Total-intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi er en almindeligt anvendt metode, men har den ulempe, at det kræver fluorescerende mærkning, som kan forstyrre aktiviteten af molekylerne. Også, foto blegning og foto skader er bekymringer. I tilfælde af microtubuler, har vi konstateret, at billeder af lignende kvalitet til tirf kan opnås ved hjælp af interferens refleksion mikroskopi (IRM). Dette antyder, at IRM kan være en generel teknik til visualisering af dynamikken i store biomolekyler og oligomerer in vitro. I dette papir viser vi, hvordan et fluorescens mikroskop kan modificeres blot for at opnå IRM-billeder. IRM er nemmere og betydeligt billigere at implementere end andre kontrast teknikker, såsom mikrokopiering af differentialinterferens eller interferometrisk spredning af mikroskopi. Det er også mindre modtagelige for overfladedefekter og opløsning urenheder end Darkfield mikroskopi. Ved hjælp af IRM, sammen med den billedanalyse software, der er beskrevet i dette papir, er synsfeltet og billedhastigheden kun begrænset af kameraet. med en scmos kamera og bred-felt belysning mikrotubulus længde kan måles med præcision op til 20 Nm med en båndbredde på 10 Hz.
Introduction
Label-gratis billeddannelse af mikrotubuler er af interesse, da det omgår behovet for fluorescerende mærkning af Tubulin at generere kontrast i billederne. Fluorescerende mærkning har flere ulemper: det er ikke muligt, hvis proteinkoncentrationen er lav1 og foto blegning og foto skade begrænse observationstiden. Flere teknikker er blevet brugt til at billed label-fri microtubuler, herunder video-forstærket differential interferens kontrast mikroskopi (dic) og Darkfield mikroskopi2,3,4,5. For nylig, interferometrisk spredning mikroskopi (iSCAT)6, roterende-sammenhængende-spredning mikroskopi (Rocs)7 og rumlige lys interferens mikroskopi (slim)8, er også blevet brugt. Alle disse teknikker er i stand til at billedbehandlings mikrotubuli og har vist sig at være værdifulde for at studere mikrotubulus dynamik. Men, hver har deres egne begrænsninger. I DIC afhænger kontrasten af vinklen mellem mikrotubulen og Nomarski prisme aksen. I Darkfield nedbrydes mikrotubulus signalet af spredt lys fra urenheder eller overflader defekter. Selvom iSCAT udviser ekstraordinær følsomhed (ned til enkelte proteiner) og ROCS kan billede microtubuli dybere ind i prøven, begge metoder er teknisk krævende, der kræver laser scannere.
Denne protokol viser, hvordan interferens refleksion mikroskopi (IRM)9,10 kan oprettes som en alternativ teknik til Label-fri billeddannelse af microtubuler. IRM er let at implementere, da det kun kræver tilføjelse af et billigt 50/50-spejl til et standard fluorescerende mikroskop. Når den bruges sammen med den software, der er beskrevet her, frembringer IRM højkontrast-mikrotubulære billeder, kan afbilde store synsfelter ved høj hastighed, kræver en engangsjustering og kan nemt kombineres med andre teknikker såsom fluorescens Imaging.
Protocol
1. mikroskop modifikation og objektiv linse
- Indsæt et 50/50-spejl i filter hjulet på det fluorescerende mikroskop ved hjælp af en passende filter kube (figur 1). Håndtér 50/50-spejlet med omhu, da de ofte har antirefleksbelægning.
Bemærk: vi brugte en 50/50 spejl i en tom filter kube af mikroskopet. 50/50-spejlet indsættes, hvor koldtlysreflektorlamper-spejlet er placeret. - Brug en høj forstørrelse/høj NA olie mål.
Bemærk: i denne protokol, vi brugte en 100x/1.3 NA mål.
2. kammer forberedelse til at klæbe mikrotubuler til overfladen
- Rengør mikroskop slidene og 22 mm x 22 mm dæksedler (til opretstående mikroskop) eller 22 mm x 22 mm og 18 mm x 18 mm dæksedler (til inverterede mikroskoper). Rediger overfladen efter behov. For eksempel rengøres dæksedlerne ved hjælp af et alkalisk rengøringsmiddel (Se tabel over materialer) efterfulgt af 100% ethanol med destilleret vand skyller ind mellem og efter11.
- Skær 3 mm brede strimler af plastik paraffin film (Se tabel over materialer) ved hjælp af en barberkniv og en anden mikroskop slide som en kant.
- Placer to plast paraffin film strimler 3 mm fra hinanden på en ren 22 x 22mm Cover seddel. Placer derefter en 18 mm x 18 mm dækseddel for at danne en kanal. Hvis du bruger et oprejst mikroskop, skal du placere strimlerne oven på et rent mikroskop slide og derefter placere en dækseddel på toppen.
- Anbring dæksedlen (eller sliden) på en varmeblok ved 100 °C for 10-30 s, så paraffin filmen danner en forseglet kanal.
- Flow i 50 μg/mL antistof (i Brinkley buffer 1980 (BRB80)) ved perfusion ved hjælp af en pipette. Inkuber i 10 min.
Bemærk: vi bruger anti-rhodamin antistoffer til at binde rhodamine-mærket mikrotubulus frø til overfladen. Alternativt kan begærlighed anvendes til at binde biotin-mærkede mikrotubulære frø eller til biotinylerede guld partikler. For blot at se på microtubuler i fravær af Tubulin i opløsning (dvs. en ikke-dynamisk analyse), kan et anti-tubulinantistof anvendes. - Vask fem gange med BRB80 buffer. Det anbefales at filtrere løsningerne ved hjælp af et 0,22 μm filter.
- Flow i 1% poloxamer 407 (en triblokcopolymer copolymer) i BRB80 for at blokere overfladen mod ikke-specifik binding. Inkuber i 10 min.
- Vask fem gange med BRB80 buffer.
- Prøven er klar til at blive anbragt på mikroskopet. For at forhindre, at prøven tørrer ud, tilsættes to dråber af BRB80 buffer i enderne af kanalen og genopfyldes når det er nødvendigt.
3. tilpasning af mikroskop
- Placer prøven på mikroskop stadiet. Tænd for EPI-belysnings lyskilden.
- Fokuser på prøveoverfladen. Du vil observere flere overflader, da målet er flyttet op og ned på grund af tilbage refleksion af lys fra optik inden for den optiske vej. En god metode til at finde prøveoverfladen er at fokusere på paraffin film Edge. Når overfladen er fundet, indstille synsfeltet til midten af kammeret.
- Centrer feltet mellem gulvet i synsfeltet ved at lukke det halvvejs og bruge justeringsskruerne. Når den er justeret, åbnes mellem gulvet igen.
Bemærk: skrue justering behøver kun at ske sporadisk, måske hver 3-6 måneder eller ved fejlfinding. - Skub i Bertrand linsen for at se exit pupil (tilbage fokal plan) af målet.
- Luk blænde membranen (AD) ud over kanterne af exit pupil af målet.
- Brug justeringsskruerne til at centrere ANNONCEN med exit eleven. Dobbelttjek ved at åbne ANNONCEN og matche dens kanter med dem af exit pupil.
Bemærk: denne justering skal kun ske sporadisk. - Indstil blænde membranen til omkring 2/3 af NA af målet. Se afsnit 7 for detaljerede procedurer for optimering af blænde membranen.
4. Imaging stabiliserede microtubuler eller 40 nm guld partikel
Bemærk: stabiliserede mikrotubuler og guld nanopartikler tjener som god kontrolprøver. Det anbefales at billed overflade vedhæftede microtubuler eller guld nanopartikler som et første skridt til at vurdere IRM ydeevne og hjælpe med at indstille den optimale blænde membran åbning (afsnit 7).
- Indstil eksponeringstid for kameraet til 10 MS og justere belysningen til næsten mægle kameraets dynamikområde.
- Flow i 10 μl guanylyl-(Alpha, beta)-methylen-diphosphonat (gmpccp)-eller Taxol-stabiliserede mikrotubuler i BRB804,12,13 (eller 40 nm guld partikler) ved perfusion ved hjælp af en pipette til en frisk prøve og Monitor binding ved at afbilde overfladen. Når 10-20 microtubuler er bundet inden for synsfeltet, vask prøven 2x med BRB80.
Bemærk: med et godt justeret mikroskop skal mikrotubuerne være synlige uden subtraktion i baggrunden. - Få 10 billeder ved at indstille en tidsforskydning med 1 anden forsinkelsesperiode i 10 sekunder (ved 10 MS eksponering).
- Få et baggrundsbillede. For at gøre dette, skal du flytte scenen ved hjælp af Stage controller eller computer software langs kanalen lang akse, mens erhverve 100 billeder uden forsinkelse (dvs. streaming tæt på 100 fps @ 10 MS eksponering).
Bemærk: baggrunden er medianen af 100-billederne. Ved at tage medianen bevares belysnings profilen og andre stationære funktioner som snavs på optikken, mens alt andet filtreres ud. Der bør ikke være Tilt på prøven, da dette vil føre til ændring i den aksiale position som scenen er flyttet og i sidste ende forringe baggrundsbilledet. Hvis hældningen ikke kan undgås, så en alternativ metode er at erhverve gennemsnit baggrundsbilleder før flyder frøene. - Gå til trin 6 for at behandle og analysere billederne.
5. dynamik i billedbehandlings mikrotubulen
- For dynamik i mikrotubulen ved hjælp af hjernens Tubulin indstilles prøve varme temperaturen til 37 °C.
- Flow i 10 μL GMPCCP-stabiliserede mikrotubulelfrø i BRB8011 ved perfusion ved hjælp af en pipette til en frisk prøve og overvåge dem bindende til overfladen ved at afbilde overfladen levende (dvs., mens streaming). Når 10-20 frø er bundet med synsfelt, vaske prøven ved hjælp af 2x kanal volumen med BRB80 (BRB80 skal være forvarmet til 37 °C eller i det mindste ved stuetemperatur).
Bemærk: med et godt justeret mikroskop skal frøene være synlige uden baggrunds subtraktion. - Flow i polymeriserings blandingen (7,5 μM ikke-mærket Tubulin + 1 mM Guanosintrifosfat (GTP) + 1 mM dithiothreitol (DTT) i BRB80 buffer). Til måling af vækst i mikrotubulen skal du indstille en tidsforskydning ved hjælp af anskaffelsesoftwaren for at erhverve et billede hvert 5. sekund (0,2 frames per Second (fps)) i 15 minutter.
- For at øge kontrasten, erhverve 10 billeder (i stedet for en) på hvert tidspunkt og gennemsnit dem. For mikrotubulus svind, erhverve billeder på 100 fps ved at indstille tidsforsinkelsen til 0 og en eksponeringstid på 10 MS (højere fps er muligt med mindre regioner af interesse afhængigt af det anvendte kamera).
- Få et baggrundsbillede som i trin 4,4.
6. billedbehandling og analyse
Bemærk: til analyse, denne protokol bruger Fiji14 , men læseren er fri til at bruge software, hun/han finder egnet.
- Åbn gemte baggrundsbilleder.
- Beregn median billedet (dvs. baggrund) ved hjælp af billede ≫ stak ≫ Z projekt ≫ median.
- Åbn mikrotubulus Dynamics-film som en stak (samme for ikke-dynamiske mikrotubuli) ved hjælp af fil > åben.
- Fratræk baggrundsbilledet fra stakken ved hjælp af proces ≫ billede lommeregner. Sørg for at kontrollere "32Bit (float) resultat" valgmulighed.
- For dynamiske mikrotubuli, ved hjælp af linje værktøjet trække en linje langs mikrotubulen af interesse og tilføje det til regionen af interesse Manager ved at trykke på "t". Gentag for alle mikrotubuler af interesse.
- For dynamiske microtubuler skal du køre multi-Kymo-makroen (supplerende fil 1). Makroen genererer en video og en kymograph for hver mikrotubule i ROI Manager. Hver mikrotubule vil få en unik identifikator.
- For dynamiske microtubuler skal du køre Kymo-analyse makroen (supplerende fil 2) og følge dens trin for at måle vækstraterne og Krympningen af mikrotubuerne.
7. blænde-membran størrelse
Bemærk: en vigtig faktor for at erhverve højkontrast billeder af microtubuler ved hjælp af IRM er at indstille belysningen numerisk blænde (Ina) korrekt10,15. Ina kan ændres ved at ændre størrelsen af den indkommende belysnings stråle på målet exit pupil, som er kontrolleret af størrelsen af ANNONCEN (annoncen er placeret på et konjugat plan med exit pupil (tilbage fokal plan) af målet , Figur 1):
hvor dad er diameteren af blænde membranen, fmål er brændvidden af målet og DEP er målet exit elev diameter. ANNONCEN er typisk helt åben for fluorescens Imaging, så Ina er lig med målsætningen na. I et fluorescens mikroskop indikerer annonce skalaen ikke dens diameter, og derfor kan Ina ikke beregnes. Det er muligt at kalibrere annoncestørrelsen ved hjælp af en målsætning. Det er dog ikke nødvendigt, da annoncestørrelsen vil blive fastgjort til den størrelse, der giver den højeste kontrast.
- Forbered en prøve af fluorescently mærkede stabiliserede mikrotubuler fast til overfladen (trin 4.1-4.2).
Bemærk: vi brugte tetramethylrhodamin mærket mikrotubuli16 (ex: 550 nm, EM: 580 nm). - Bring mikrotubuler i fokus ved hjælp af mikroskopet fokuserings knappen mens fluorescently Imaging dem (hvis mikrotubuler ikke er mærket, billede dem med IRM15 eller dic5).
- Indstil kameraets eksponering til 10 MS ved hjælp af kameraets software.
Bemærk: denne eksponering er vilkårlig, og en eksponering på 100 MS ville også fungere. - Luk ANNONCEN til den mindste åbning. Juster belysningen til næsten mægle kameraets dynamiske område eller til det maksimalt mulige.
Bemærk: brug som vejledning den søge tabel, der typisk leveres af anskaffelses softwaren. - Erhverve 10 billeder (ved at streaming eller tage et billede hvert sekund) af et synsfelt, der indeholder 10 + microtubuler.
- Få et baggrundsbillede som i trin 4,4.
- Skift størrelsen på ANNONCEN, og Gentag trin 7.5-7.6 for hele annonce åbnings området (fra lukket til afslutnings pupilstørrelse, figur 2). Hver gang annoncestørrelsen ændres, skal du justere belysnings intensiteten, så den passer til trin 7,4.
- For hvert synsfelt erhvervet, trække den tilsvarende baggrund ved hjælp af processen > billede lommeregner og vælge "subtrahere" fra drop-down menuen. Sørg for, at indstillingen "32Bit (float) result" er markeret. Derefter gennemsnitlige de resulterende billeder ved hjælp af billede > stak ≫ Z projekt > gennemsnit.
- Mål signal-til-baggrundsstøj forholdet (SBR) for de mikrotubuli, der defineres som den gennemsnitlige intensitet af mikrotubulens signal (intensiteten af mikrotubule minus intensiteten af baggrunden) divideret med standardafvigelsen af baggrunden ( Figur 3).
- Bestem den optimale annoncestørrelse (dvs. optimal Ina) ved at beregne den gennemsnitlige SBR af mikrotubuler for hver åbningsstørrelse og indstille annoncestørrelsen til den, der producerer den højeste SBR (figur 2). Det er muligt, at der er en række annoncestørrelser, der producerer sammenlignelige kontrast15.
Representative Results
Som nævnt ovenfor, med et godt justeret mikroskop, bør mikrotubuler være synlige uden baggrunds subtraktion (figur 4a). Ved at trække i baggrunden (figur 4b) øges kontrasten i mikrotubulen (figur 4c). For yderligere at øge kontrasten, gennemsnitlig eller Fourier filtrering eller en kombination af begge kan anvendes (figur 4d, F, E). Linjen scanninger i figur 4g viser den trinvise forbedring af billedkvaliteten. Bemærk reduktionen af baggrundsstøjen med hvert behandlingstrin.
Eksempler på kymografer af dynamik i mikrotubulen genereret fra time-lapse-film er vist i figur 5. Videoerne blev erhvervet ved to billedhastigheder: 0,2 fps (langsom) og 100 fps (hurtig). Førstnævnte er egnet til at måle vækstrater, mens sidstnævnte er mere egnet til måling af svind sats, der er en størrelsesorden hurtigere end vækstraten.
I tilfælde, hvor guld nanopartikler anvendes til opsætning af mikroskopet, vises et eksempelbillede i figur 6. Guld nanopartikler var passivt fastgjort til overfladen. Mens 40 nm partikler anbefales, er det også muligt at billedet 20 Nm partikler, men med en lavere kontrast.
Figur 1. Skematisk gengivelse af IRM. (A) EPI-belysning fra lyskilden passerer gennem blænde membranen, før den når 50/50-spejlet. Blænde membranen indstiller strålebredden således belysningen NA. 50/50 spejlet afspejler delvist lyset op til målet om at belyse prøven. Lys reflekteres fra prøven indsamles og derefter projiceres på kameraets chip (ved tube linsen), hvor det forstyrrer at generere billedet. Billedets kontrast er resultatet af interferensen mellem lyset reflekteres fra glas/vand-grænsefladen (i1) og lyset reflekteres fra vand/mikrotubulus-grænsefladen (i2). Afhængigt af mikrotubulen/overflade afstanden (h) vil den optiske kurve forskel mellem i1 og i2 resultere i et konstruktivt (skarpt signal) eller destruktivt (mørkt signal) eller noget imellem. For eksempel, hvis lys med en bølgelængde på 600 nm bruges til billeddannelse, vil kontrasten skifte mellem mørke og lyse, når mikrotubulen højden ændres med omkring 100 nm. Stjernen angiver konjugat-fly (modificeret fra15). (B) eksempel på 50/50-spejl installationen. En egnet filter terning blev åbnet og spejlet blev indsat, hvor et koldtlysreflektorlamper spejl normalt sidder. Spejlet var orienteret som pr producentens anvisninger. Derefter blev kuben indsat i filter hjulet, som blev indsat tilbage til mikroskopet (ikke vist). Under installationen blev der brugt handsker, og spejlet blev kun holdt af kanterne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Optimale blændeindstilling. (A) samme synsfelt blev afbildet på forskellige blænde membran åbninger uden baggrunds subtraktion. Visuelt, kontrasten steg som størrelsen af blænden membran steg indtil det nåede et plateau og begyndte at nedbrydes bagefter. Dette blev bekræftet af (B) SBR målinger af baggrunds trukket billeder. Fejllinjer er standardafvigelse. Skala stænger er 500 μm (AD) og 3 μm (mikrotubuler). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Måling af signal-til-baggrundsstøj forhold. Mikrotubuler blev isoleret i regioner af interesse. Hver region af interesse blev thresholded at adskille mikrotubulen fra baggrunden. Den gennemsnitlige mikrotubulus signal blev opnået fra en linje scanning over mikrotubulen. Bredden på scannings linjen blev indstillet til at være lig med længden på mikrotubulen. På denne måde er hvert punkt på scanningen et gennemsnit af signalerne fra alle pixels langs mikrotubulens akse, der er parallelle med dette punkt. Baggrundsstøjen er standardafvigelsen for alle pixels under tærskelværdien afskåret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Billedbehandling. Efter at have anskaffet RAW-billeder (A)blev baggrunden (B) fratrukket (C) for at forstærke kontrasten i mikrotubulen. For yderligere at forbedre kontrasten var billederne enten gennemsnitlige (D) eller Fourier filtreret (E) eller begge (F). Linjen scanner (G), hvis placering er angivet med den stiplede røde linje i (a) , er farve matchet med de forskellige billeder i (a) til (F). Tallene i nederste hjørne er gennemsnitlige Sbr'er målt for hele synsfeltet. Skala bjælken er 5 μm (modificeret fra15). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Eksempler på kymografer. (A) kymograph eksempler på dynamik i mikrotubulen genereret fra time-lapse-film erhvervet ved 0,2 fps. (B) kymograph skildrer et eksempel på en svind begivenhed genereret fra en film erhvervet ved 100 fps. Stiplede linjer markerer frøene. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Eksempel på guld nanopartikler, som er afbildet med IRM. Guld nanopartikler af størrelserne 20 og 40 nm var passivt fastgjort til overfladen. der blev anskaffet 10 billeder. Efter baggrunds subtraktion blev billederne gennemsnitligt for at øge kontrasten. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Længde sporings præcision for mikrotubulen i IRM-billeder. Stabiliserede mikrotubuler (dvs. faste længder) blev afbildet 200x ved 100 fps derefter gennemsnit til 10 FPS for at øge kontrasten. Derefter blev mikrotubulernes længder målt ved hjælp af Fiesta17 tracking software. For hver mikrotubulus blev middellængden og standardafvigelsen beregnet som vist i figuren (stiplet linje repræsenterer middelværdien og de faste røde linjer repræsenterer standardafvigelsen, længde = 3971 ± 20 Nm. Den overordnede sporings præcision var gennemsnittet af standardafvigelsen for alle sporede mikrotubuler (n = 6 mikrotubuler x 20 datapunkter = 120 datapunkter). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil 1. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Denne protokol viste en vellykket brug af IRM til afbildning og måling af dynamikken i mikrotubulen. Der skal udvises omhu for korrekt at indstille belysningen numerisk blænde, da det har den stærkeste indvirkning på billedets kontrast. Også ved hjælp af høje numeriske blænde (NA) mål er vigtigt for at få høj opløsning/høj kontrast billeder, som højere NA mål har højere lys indsamling magt i forhold til lav NA mål. Den renere overflade og løsninger, der anvendes lavere støj som snavs ender med at binde sig til overfladen og tilføje (i løbet af eksperimentet) speckle som støj til billederne. Erhvervelse af et baggrundsbillede er vigtigt, samt det fjerner belysning inhomogeniteter, statisk støj og overflade uregelmæssigheder.
En anbefalet modifikation er at introducere et langt pass filter (> 600 nm) i belysnings vejen. Spektret af hvide lyskilder indeholder typisk bølgelængder i UV, som kan beskadige mikrotubuler. Desuden er det praktisk at bruge lang bølgelængde til IRM, når du kombinerer IRM med fluorescens (f. eks. når man studerer virkningen af mikrotubulus associerede proteiner (kort) på dynamikken i mikrotubulen). Vær opmærksom på, at ved billeddannelse i perioder med tidsforskydning formindsker eksempel afdrift (især langs den optiske akse) billedets kontrast på grund af afvigelsen af billedplanet fra baggrunds planet. Moderne mikroskoper er ofte udstyret med stabiliseringsmekanismer (f. eks. perfekt fokus (Nikon), bestemt fokus. 2 (Zeiss), IX3-ZDC2 (Olympus)). En alternativ løsning er at termisk stabilisere opsætningen enten passivt eller aktivt18 eller ved at korrigere for drift19,20,21. Endelig kan mikrotubulus kontrast øges ved at reducere størrelsen af felt membranen (en 70% åbning er godt valg, da det er en balance mellem stigende kontrast og synsfelt størrelse)15.
Mens IRM er egnet til billedbehandlings mikrotubuler, er det ikke følsomt nok til at detektere enkelte proteiner. For en sådan anvendelse, iSCAT er en mere passende teknik. Tilsvarende er fluorescens og iSCAT bedre egnet, hvis sporings præcision på mindre end 10 nm er nødvendig. For IRM er den målte længde sporings præcision ~ 20 Nm som vist i figur 7.
Brug af IRM i Surface-assays kan gå ud over mikrotubuler; for eksempel kan molekylære motorer mærkes med guld nanopartikler og spores, når de interagerer med mikrotubuler. Desuden kan en mere avanceret form for IRM, kendt som reflekterende interferens kontrast mikroskopi (RICM)22 , i princippet bruges til yderligere at forbedre microtubuler kontrast og opnå højere sporings præcision.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Anna Luchniak og Yin-Wei Kuo for kritisk læsning og kommentarer til protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope used for perfoming the expriments |
| 50/50 beam splitter | Chroma | 21000 | When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope |
| NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective | Nikon | MRH02902 | Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3 |
| Mucasol universal detergent | Sigma-aAldrich | Z637181-2L | Used for cleaning coverslips and slides |
| plastic paraffin film (commerical name Parafilm M) | Sigma-aAldrich | P7793 | Used for constructing flow channels |
| Anti-TAMRA antibody | Invitrogen | A-6397 | Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196) |
| Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aAldrich | Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding | |
| 40 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753637 | Used as a control sample |
| 20 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753610 | Used as a control sample |
| Zyla 4.2 Camera | Andor | Zyla 4.2 | 2048x2048 pixles (6.5µm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range |
| Feista tracking software | https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA | ||
| Stabilized microtubles | prepared in house (see references in text) |
References
- Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Hotani, H., Horio, T. Dynamics of microtubules visualized by darkfield microscopy: Treadmilling and dynamic instability. Cell Motility and the Cytoskeleton. 10 (1-2), 229-236 (1988).
- Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. The Journal of Cell Biology. 120 (4), 923-934 (1993).
- Bormuth, V., Howard, J., Schäffer, E. LED illumination for video-enhanced DIC imaging of single microtubules. J Microsc. 226 (Pt 1), 1-5 (2007).
- Andrecka, J., Ortega Arroyo, J., Lewis, K., Cross, R. A., Kukura, P. Label-free Imaging of Microtubules with Sub-nm Precision Using Interferometric Scattering Microscopy. Biophysical Journal. 110 (1), 214-217 (2016).
- Koch, M. D., Rohrbach, A. Label-free Imaging and Bending Analysis of Microtubules by ROCS Microscopy and Optical Trapping. Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).
- Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. Label-Free Imaging of Single Microtubule Dynamics Using Spatial Light Interference Microscopy. ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).
- Curtis, A. S. G. The Mechanism of Adhesion of Cells to Glass. The Journal of Cell Biology. 20 (2), 199-215 (1964).
- Weber, I. [2] Reflection interference contrast microscopy. Methods in Enzymology. 361, 34-47 (2003).
- Gell, C., et al. Chapter 13 - Microtubule Dynamics Reconstituted In Vitro and Imaged by Single-Molecule Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).
- Nitzsche, B., et al. Chapter 14 - Studying Kinesin Motors by Optical 3D-Nanometry in Gliding Motility Assays. Methods in Cell Biology. 95, 247-271 (2010).
- Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Schäffer, E., Howard, J. Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy. Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).
- Hyman, A., et al. [39] Preparation of modified tubulins. Methods in Enzymology. 196, 478-485 (1991).
- Ruhnow, F., Zwicker, D., Diez, S. Tracking Single Particles and Elongated Filaments with Nanometer Precision. Biophysical Journal. 100 (11), 2820-2828 (2011).
- Mahamdeh, M., Schäffer, E. Optical tweezers with millikelvin precision of temperature-controlled objectives and base-pair resolution. Optics Express. 17 (19), 17190-17199 (2009).
- Kim, K., Saleh, O. A. Stabilizing method for reflection interference contrast microscopy. Applied Optics. 47 (12), 2070-2075 (2008).
- Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging. Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).
- Carter, A. R., King, G. M., Ulrich, T. A., Halsey, W., Alchenberger, D., Perkins, T. T. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl Opt. 46 (3), 421-427 (2007).
- Limozin, L., Sengupta, K. Quantitative Reflection Interference Contrast Microscopy (RICM) in Soft Matter and Cell Adhesion. ChemPhysChem. 10 (16), 2752-2768 (2009).
