Summary
Detta protokoll är en guide för att implementera störnings reflektions mikroskopi på ett standardfluorescensmikroskop för etiketfri, hög kontrast, höghastighets bild ande av mikrotubuli med in vitro-ytor analyser.
Abstract
Det finns flera metoder för att visualisera renade biomolekyler nära ytor. Total-intern reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi är en vanlig metod, men har nackdelen att det kräver fluorescerande märkning, som kan störa aktiviteten av molekylerna. Också, Foto blekning och photodamage är bekymmer. När det gäller mikrotubuli, vi har funnit att bilder av liknande kvalitet till TIRF kan erhållas med hjälp av störningar reflektion mikroskopi (IRM). Detta tyder på att IRM kan vara en generell teknik för visualisering av dynamiken i stora biomolekyler och oligomerer in vitro. I det här dokumentet visar vi hur ett fluorescensmikroskop kan modifieras helt enkelt för att erhålla IRM-bilder. IRM är enklare och betydligt billigare att implementera än andra kontrast tekniker som differential interferens kontrast microcopy eller interferometrisk spridning Microscopy. Det är också mindre mottagliga för ytdefekter och lösningsföroreningar än Darkfield-mikroskopi. Med hjälp av IRM, tillsammans med bildanalys programmet som beskrivs i det här dokumentet, begränsas synfältet och bildrutefrekvensen endast av kameran. med en sCMOS kamera och Wide-fält belysning mikrotubuli längd kan mätas med precision upp till 20 nm med en bandbredd på 10 Hz.
Introduction
Label-fri avbildning av mikrotubuli är av intresse eftersom det kringgår behovet av fluorescerande märkning av tubulin att generera kontrast i bilderna. Fluorescerande märkning har flera nackdelar: det är inte möjligt om protein koncentrationen är låg1 och photoblekning och photodamage begränsa observationstiden. Flera tekniker har använts för att bild etikett-fria mikrotubuli, inklusive video-förstärkt differential interferens kontrast mikroskopi (DIC) och Darkfield mikroskopi2,3,4,5. Nyligen har också interferometrisk spridning mikroskopi (iscat)6, roterande-sammanhängande-spridning mikroskopi (Rocs)7 och rumslig ljus störning mikroskopi (Slim)8, även använts. Alla dessa tekniker kan Imaging mikrotubuli och har visat sig vara värdefulla för att studera mikrotubuli dynamik. Men alla har sina egna begränsningar. I DIC kontrasten beror på vinkeln mellan mikrotubuli och nomarski Prisma axeln. I Darkfield bryts mikrotubulen-signalen ned av spritt ljus från orenheter eller ytdefekter. Även om iSCAT uppvisar extraordinär känslighet (ner till enstaka proteiner) och ROCS kan bild mikrotubuli djupare in i provet, båda metoderna är tekniskt krävande, kräver laser skannrar.
Detta protokoll visar hur interferensreflektions mikroskopi (IRM)9,10 kan ställas in som en alternativ teknik för etikettfri avbildning av mikrotubuli. IRM är lätt att implementera eftersom det bara kräver tillsats av en billig 50/50 spegel till en standard fluorescerande Mikroskop. När det används tillsammans med programvaran som beskrivs här, producerar IRM hög kontrast mikrotubule bilder, kan bild stora fält med hög hastighet, kräver en onetime anpassning, och kan enkelt kombineras med andra tekniker som fluorescens Imaging.
Protocol
1. Mikroskop modifiering och objektiv lins
- Sätt i en 50/50-spegel i det fluorescerande mikroskopet med en lämplig filterkub (figur 1). Hantera 50/50 spegel med omsorg så ofta de har anti-reflektion beläggning.
Obs: vi använde en 50/50 spegel i en tom filterkub av mikroskopet. Den 50/50 spegel är insatt där Dichroic spegeln är placerad. - Använd en hög förstoring/hög NA olja mål.
ANMÄRKNINGAR: i detta protokoll använde vi ett mål på 100x/1.3 NA.
2. kammar förberedelse för att fästa mikrotubuli på ytan
- Rengör Mikroskop rutschbanor och 22 mm x 22 mm täckglas (för upprätt Mikroskop) eller 22 mm x 22 mm och 18 mm x 18 mm täckband (för inverterade Mikroskop). Ändra ytan efter behov. Till exempel, rengör täckglas med hjälp av ett alkaliskt rengöringsmedel (se tabell över material) följt av 100% etanol med destillerat vatten tvättar mellan och efter11.
- Skär 3 mm breda remsor av plast paraffin film (se tabell över material) med hjälp av ett rakblad och en annan Mikroskop glida som en kant.
- Placera två plast paraffin filmremsor 3 mm isär på en ren 22 x 22mm täckslip. Placera sedan en 18 mm x 18 mm täckslip för att bilda en kanal. Om du använder ett upprätt Mikroskop, placera remsorna ovanpå en ren Mikroskop glida och sedan placera en täckglas ovanpå.
- Placera täckglaset (eller glid) på ett värmeblock vid 100 ° c i 10-30 s för paraffin filmen för att bilda en sluten kanal.
- Flöde i 50 μg/mL antikropp (i Brinkleybuffert 1980 (BRB80)) genom perfusion med hjälp av en pipett. Inkubera i 10 minuter.
Anmärkning: vi använder anti-rhodamine antikroppar för att binda rhodamine-märkta mikrotubuli frön till ytan. Alternativt kan avidinen användas för att binda biotin-märkta mikrotubuli frön eller en guld partiklar. För att helt enkelt titta på mikrotubuli i avsaknad av tubulin i lösning (dvs, en icke-dynamisk analys), en anti-tubulin antikropp kan användas. - Tvätta fem gånger med BRB80 buffert. Vi rekommenderar att du filtrerar lösningarna med ett 0,22 μm filter.
- Flöde i 1% poloxamer 407 (en triblocksampolymer) i BRB80 för att blockera ytan mot icke-specifik bindning. Inkubera i 10 minuter.
- Tvätta fem gånger med BRB80 buffert.
- Provet är färdigt att placeras på mikroskopet. För att förhindra att provet torkar ut, tillsätt två droppar BRB80 buffert i ändarna av kanalen och fyll på vid behov.
3. Mikroskop justering
- Placera provet på Mikroskop stadiet. Slå på EPI-belysningens ljuskälla.
- Fokusera på prov ytan. Du kommer att observera flera ytor som målet flyttas upp och ner på grund av tillbaka reflektion av ljus från optik inom den optiska vägen. En bra metod för att hitta provet ytan är att fokusera på paraffin film kanten. När ytan har hittats, Ställ in synfält till mitten av kammaren.
- Centrera fältbländaren i synfältet genom att stänga den halvvägs och använda justeringsskruvarna. När den är justerad, öppna mellangärdet.
Anmärkning: skruv justering behöver bara göras sporadiskt, kanske varje 3-6 månader eller vid felsökning. - Skjut in Bertrand-linsen för att Visa Exit eleven (bakre fokalplanet) av målet.
- Stäng bländarbländaren (AD) bortom kanterna på Exit eleven i målet.
- Använd justeringsskruvarna för att centrera annonsen med exit eleven. Dubbelkolla genom att öppna annonsen och matcha dess kanter med de av Exit eleven.
Obs: denna justering behöver bara göras sporadiskt. - Ställ bländaren membran till ca 2/3 av NA av målet. Se avsnitt 7 för detaljerade procedurer för att optimera bländarbländaren.
4. Imaging stabiliserad mikrotubuli eller 40 NM guld partikel
Obs: stabiliserade mikrotubuli och Guldnanopartiklar fungerar som bra kontrollprover. Det rekommenderas att bild ytan bifogade mikrotubuli eller Guldnanopartiklar som ett första steg för att bedöma IRM-prestanda och hjälp med att ställa in den optimala öppningen bländaren (avsnitt 7).
- Ställ in kamerans exponeringstid på 10 MS och justera belysningen så att kamerans dynamiska omfång nästan är mättat.
- Flöde i 10 μl av guanylyl-(alfa, beta)-metylendifosfonat (gmpccp)-eller Taxol-stabiliserade mikrotubuli i BRB804,12,13 (eller 40 NM guld partiklar) genom perfusion med hjälp av en pipett till ett nytt prov och övervaka genom att avbilda ytan. När 10-20 mikrotubuli är bunden inom synfältet, tvätta provet 2x med BRB80.
Anmärkning: med ett väl anpassat Mikroskop, bör mikrotubuli vara synlig utan bakgrund subtraktion. - Hämta 10 bilder genom att ställa in en tidsfördröjning med 1 sekunders fördröjningsperiod i 10 sekunder (vid 10 MS-exponering).
- Få en bakgrundsbild. För att göra det, flytta scenen med hjälp av Stage Controller eller datorprogramvara längs kanalen lång axel medan förvärva 100 bilder utan fördröjning (dvs. streaming nära 100 fps @ 10 MS exponering).
Obs: bakgrunden är medianen för 100 bilder. Genom att ta medianen bevaras belysnings profilen och andra stationära funktioner som smuts på optiken medan allt annat filtreras bort. Det bör inte finnas någon lutning på provet eftersom detta kommer att leda till förändring i axiellt läge som scenen flyttas och i slutändan försämra bakgrundsbilden. Om lutningen inte kan undvikas, då en alternativ metod är att förvärva genomsnittliga bakgrundsbilder innan flyter fröna. - För bearbetning och analys av bilderna, gå till steg 6.
5. Imaging mikrotubule dynamik
- För mikrotubulindynamik med hjälp av hjärntubulin, Ställ in prov värmarens temperatur till 37 ° c.
- Flöde i 10 μl av gmpccp-stabiliserad mikrotubuli frön i BRB8011 genom perfusion med hjälp av en pipett till ett nytt prov och övervaka dem bindning till ytan genom att avbilda ytan Live (dvs., medan streaming). När 10-20 frön är bundna med synfält, tvätta provet med 2x kanal volym med BRB80 (BRB80 bör förvärmas till 37 ° c eller åtminstone vid rumstemperatur).
Anmärkning: med ett väl anpassat Mikroskop, bör fröna vara synlig utan bakgrund subtraktion. - Flöde i polymerisationmixen (7,5 μM omärkt tubulin + 1 mM Guanosintrifosfat (GTP) + 1 mM Ditiothreitol (DTT) i BRB80 buffert). För att mäta mikrotubule tillväxt, ställa in en tidsfördröjning med förvärvet programvara för att förvärva en bild var 5 sekunder (0,2 bilder per sekund (FPS)) för 15 minuter.
- För att förbättra kontrasten, förvärva 10 bilder (i stället för en) vid varje tidpunkt och genomsnittet dem. För mikrotubule krympning, förvärva bilder på 100 fps genom att ställa in tidsfördröjningen till 0 och en exponeringstid på 10ms (högre FPS är möjligt med mindre regioner av intresse beroende på vilken kamera som används).
- Hämta en bakgrundsbild som i steg 4,4.
6. bildbehandling och analys
Anmärkning: för analys använder detta protokoll Fiji14 men läsaren är fri att använda någon programvara hon/han tycker är lämplig.
- Öppna sparade bakgrundsbilder.
- Beräkna median bilden (dvs. bakgrund) med hjälp av bild ≫ Stack ≫ Z-projektet ≫ median.
- Öppna mikrotubuli Dynamics film som en stapel (samma för icke-dynamiska mikrotubuli) med fil > öppen.
- Subtrahera bakgrundsbilden från stacken med hjälp av Process ≫ bild kalkylator. Se till att kontrollera "32bit (float) resultat" alternativet.
- För dynamiska mikrotubuli, med hjälp av linjeverktyget rita en linje längs mikrotubuli av intresse och lägga till den region av intresse chef genom att trycka på "t". Upprepa för alla mikrotubuli av intresse.
- För dynamiska mikrotubuli, kör du multi-KYMO Macro (kompletterande fil 1). Makrot kommer att generera en video och en kymograph för varje mikrotubuli i Roi Manager. Varje mikrotubuli kommer att få en unik identifierare.
- För dynamiska mikrotubuli, kör KYMO-analys Macro (kompletterande fil 2) och följ dess steg för att mäta tillväxttakt och krympning priser mikrotubuli.
7. bländare Membranstorlek
Obs: en viktig faktor för att förvärva bilder med hög kontrast av mikrotubuli med IRM är att ställa in belysnings numerisk bländare (Ina) korrekt10,15. Ina kan ändras genom att ändra storleken på den inkommande belysnings balken vid mål ' s Exit elev som styrs av storleken på annonsen (annonsen är placerad på ett konjugerat plan med exit eleven (back Focal plan) av målet , Figur 1):
där d-annonsen är bländarbländarens diameter är f-målet brännvidden för målet och dEP är målet för utgångs pupill diametern. Normalt lämnas annonsen helt öppen för fluorescensavbildning, så Ina är lika med målet na. I ett fluorescensmikroskop indikerar inte annons skalan dess diameter, vilket gör att Ina inte kan beräknas. Det är möjligt att kalibrera annonsstorleken med hjälp av ett mål. Men det är inte nödvändigt eftersom annonsstorleken skulle fastställas till den storlek som ger den högsta kontrasten.
- Förbered ett prov av fluorescerande märkta stabiliserade mikrotubuli som fastnat på ytan (steg 4.1-4.2).
Obs: vi använde tetrametylrodamin märkta mikrotubuli16 (ex: 550 Nm, EM: 580 nm). - Ta mikrotubuli i fokus med hjälp av mikroskopet fokuseringsratten medan överföras Imaging dem (om mikrotubuli inte är märkta, bild dem med IRM15 eller DIC5).
- Ställ in kameraexponeringen på 10 MS med kamerans programvara.
Obs: denna exponering är godtycklig och en exponering av 100 MS skulle också fungera. - Stäng annonsen till dess minsta öppning. Justera belysningen så att den nästan mättat kamerans dynamiska omfång eller maximalt möjliga.
ANMÄRKNINGAR: som en guide, Använd Sök tabellen som vanligtvis tillhandahålls av anskaffningsprogram varan. - Hämta 10 bilder (genom att strömma eller ta en bild varje sekund) av ett synfält som innehåller 10 + mikrotubuli.
- Hämta en bakgrundsbild som i steg 4,4.
- Ändra ANNONSENS storlek och upprepa steg 7.5-7.6 för hela annons öppnings intervallet (från stängt till utpassens elev storlek, figur 2). Varje gång annonsstorleken ändras justerar du belysningsintensiteten så att den matchar steg 7,4.
- För varje synfält förvärvade, subtrahera motsvarande bakgrund med hjälp av process > bild kalkylator och välja "subtrahera" från rullgardinsmenyn. Kontrollera att alternativet "32bit (float) result" är markerat. Sedan genomsnitt de resulterande bilderna med hjälp av bild > stack ≫ Z-projektet > genomsnittet.
- Mätsignal-till-bakgrundsbrus förhållande (SBR) av mikrotubuli definieras som den genomsnittliga intensiteten av mikrotubuli signalen (intensiteten i mikrotubuli minus intensiteten i bakgrunden) dividerat med standardavvikelsen för bakgrunden ( Figur 3).
- Bestäm den optimala annonsstorleken (dvs optimalt INA) genom att beräkna den genomsnittliga SBR av mikrotubuli för varje öppningsstorlek och ange annonsstorleken till den som producerar den högsta SBR (figur 2). Det är möjligt att det finns en radannons storlekar som ger jämförbar kontrast15.
Representative Results
Som nämnts ovan, med ett väl anpassat Mikroskop, bör mikrotubuli vara synlig utan bakgrunds subtraktion (figur 4a). Genom att subtrahera bakgrunden (figur 4b) förstärks kontrasten mellan mikrotubulen (figur 4c). För att ytterligare öka kontrasten, medelvärdes-eller Fourierfiltreringen eller en kombination av båda kan användas (figur 4D, F, E). Linjen skannar i figur 4G visar inkrementell förbättring av bildkvaliteten. Observera minskningen av bakgrundsbrus med varje bearbetningssteg.
Exempel på kymografer av mikrotubuldynamik som genereras från tids fördröjnings filmer visas i figur 5. Videorna förvärvades vid två bildrutehastigheter: 0,2 FPS (långsam) och 100 fps (snabb). Den förstnämnda är lämplig för att mäta tillväxttakt medan den senare är mer lämpade för att mäta krymphastighet som är en storleksordning snabbare än tillväxttakten.
För fall där Guldnanopartiklar används för att installera mikroskopet visas en exempel bild i figur 6. Guldnanopartiklar var passivt knutna till ytan. Medan 40 Nm partiklar rekommenderas, är det också möjligt att bilden 20 nm partiklar, men vid en lägre kontrast.
Figur 1. Schematisk representation av IRM. (A) EPI-belysningen från ljuskällan passerar genom bländarbländaren innan den når 50/50-spegeln. Bländarbländaren ställer in strålens bredd således belysningen NA. Den 50/50 spegeln reflekterar delvis ljuset upp till målet att belysa provet. Ljus reflekteras från provet samlas in och sedan projiceras på kamerans chip (av röret linsen) där det stör för att generera bilden. Bildkontrasten är resultatet av störningen mellan ljuset reflekterat från glas/vatten-gränssnittet (I1) och ljuset reflekterat från vatten/Microtubule Interface (I2). Beroende på mikrotubulen/ytavståndet (h) kommer den optiska väg skillnaden mellan I1 och I2 att resultera i en konstruktiv (ljussignal) eller destruktiv (mörk signal) eller något däremellan. Till exempel, om ljus med en våglängd på 600 Nm används för avbildning, kommer kontrasten växla mellan mörkt och ljust när mikrotubulen höjden ändras med ca 100 nm. Asterisken indikerar konjugatflygplan (modifierade från15). (B) exempel på 50/50 spegel installation. En lämplig filterkub öppnades och spegeln sattes in där en Dichroic spegel vanligtvis sitter. Spegeln var orienterad enligt tillverkarens instruktioner. Sedan sattes kuben in i filter hjulet som sattes tillbaka till mikroskopet (visas inte). Under installationen, handskar användes, och spegeln var endast innehas av kanterna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Optimal bländare membran inställning. (A) samma synfält var avbildat vid olika bländare membran öppningar utan bakgrund subtraktion. Visuellt, kontrasten ökade när storleken på bländaren membranet ökade tills den nådde en platå och började försämras efteråt. Detta bekräftades av (B) SBR-mätningar av bakgrunds subtraberade bilder. Felstaplar är standardavvikelse. Skalstreck är 500 μm (AD) och 3 μm (mikrotubuli). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Mätning av signal-till-bakgrundsbrus förhållande. Mikrotubuli isolerades i regioner av intresse. Varje region av intresse var thresholded att separera mikrotubule från bakgrunden. Den genomsnittliga mikrotubule signalen erhölls från en linje skanning över mikrotubulen. Skannings linjens bredd var satt till lika med mikrotubulen längd. På så sätt är varje punkt på skanningen ett genomsnitt av signalerna från alla pixlar längs mikrotubulen axeln som är parallella med den punkten. Bakgrundsbrus är standardavvikelsen för alla pixlar under tröskelvärdet avskurna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Bildbehandling. Efter att ha förvärvat RAW-bilder (a), var bakgrunden (B) subtraberas (C) för att förbättra mikrotubulen kontrasten. För att ytterligare förbättra kontrasten var bilderna antingen i genomsnitt (D) eller Fourier filtrerad (E) eller båda (F). Linjen skannar (G), vars läge indikeras av streckad röd linje i (a) är färg matchas till de olika bilderna i (a) till (F). Siffrorna i nedre hörnet är genomsnittliga SBRs mätt för hela synfältet. Skalstapeln är 5 μm (ändrad från15). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Exempel på kymographs. (A) kymograph exempel på mikrotubule dynamik genereras från Time-lapse filmer som förvärvats på 0,2 FPS. (B) kymograph skildrar ett exempel på en krympning händelse som genereras från en film som förvärvats på 100 fps. Streckade linjer markerar fröna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Exempel på Guldnanopartiklar som avbildas med IRM. Guldnanopartiklar av storlekarna 20 och 40 Nm var passivt knutna till ytan. 10 bilder förvärvades. Efter bakgrunds subtraktion var bilderna i genomsnitt för att öka kontrasten. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Mikrotubule längd spårningsprecision i IRM-bilder. Stabiliserade mikrotubuli (dvs fasta längder) var avbildade 200x vid 100 fps sedan i genomsnitt till 10 fps för att förbättra kontrasten. Därefter mättes microtubules längder med hjälp av Fiesta17 spårningsprogram. För varje mikrotubule beräknades medellängden och standardavvikelsen enligt figuren (streckad linje representerar medelvärdet och de röda linjerna representerar standardavvikelsen, längd = 3971 ± 20 nm. Den totala spårnings precisionen var medelvärdet av standardavvikelsen för alla spårade mikrotubuli (n = 6 mikrotubuli x 20 datapunkter = 120 datapunkter). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 1. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande fil 2. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Discussion
Detta protokoll visade på en lyckad användning av IRM för avbildning och mätning av mikrotubuldynamiken. Försiktighet bör ges för att korrekt ställa in belysningen numerisk bländare eftersom den har starkast inverkan på bildens kontrast. Också, med hög numerisk bländare (NA) mål är viktigt för att få hög upplösning/hög kontrast bilder, eftersom högre NA mål har högre ljus samla makt jämfört med låga NA mål. Den renare ytan och lösningar som används lägre buller som smuts hamnar fästa på ytan och lägga till (under loppet av experimentet) speckle som buller till bilderna. Det är viktigt att förvärva en bakgrundsbild, samtidigt som den avlägsnar inhomogena belysning, statiskt brus och ojämnheter på ytan.
En rekommenderad modifiering är att införa ett lång pass filter (> 600 Nm) i belysnings banan. Spektrumet av vita ljuskällor innehåller typiskt våglängder i UV som kan skada mikrotubuli. Dessutom är det praktiskt att använda lång våglängd för IRM när du kombinerar IRM med fluorescens (t. ex. När du studerar effekten av mikrotubule associerade proteiner (kartor) på mikrotubuledynamik). Tänk på att när avbildning för förbrukas tidsperiod, exempel drift (särskilt längs den optiska axeln) minskar bildkontrasten på grund av avvikelsen av bilden planet från bakgrundsplanet. Moderna Mikroskop är ofta utrustade med stabiliseringsmekanismer (t. ex. perfekt fokus (Nikon), bestämd fokus. 2 (Zeiss), IX3-ZDC2 (Olympus)). En alternativ lösning är att termiskt stabilisera installationen antingen passivt eller aktivt18 eller genom att korrigera för avdrift19,20,21. Slutligen, mikrotubuli kontrast kan ökas genom att minska storleken på fält membran (en 70% öppning är bra val eftersom det är en balans mellan ökande kontrast och synfält storlek)15.
Medan IRM är lämpligt för bild mikrotubuli är det inte tillräckligt känsligt för att detektera enstaka proteiner. För en sådan tillämpning är iSCAT en mer passande teknik. På samma sätt lämpar sig fluorescens och iSCAT bättre om det behövs spårningsprecision på mindre än 10 nm. För IRM är den uppmätta längd spårnings precisionen ~ 20 nm, vilket visas i figur 7.
Användning av IRM i ytanalyser kan gå bortom mikrotubuli; till exempel kan molekyl motorer märkas med Guldnanopartiklar och spåras när de interagerar med mikrotubuli. Dessutom en mer avancerad form av IRM kallas reflekterande interferens kontrast mikroskopi (RICM)22 kan i princip användas för att ytterligare förbättra mikrotubuli kontrast och få högre spårningsprecision.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Anna Luchniak och Yin-Wei Kuo för kritisk läsning och kommentarer till protokollet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope used for perfoming the expriments |
| 50/50 beam splitter | Chroma | 21000 | When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope |
| NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective | Nikon | MRH02902 | Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3 |
| Mucasol universal detergent | Sigma-aAldrich | Z637181-2L | Used for cleaning coverslips and slides |
| plastic paraffin film (commerical name Parafilm M) | Sigma-aAldrich | P7793 | Used for constructing flow channels |
| Anti-TAMRA antibody | Invitrogen | A-6397 | Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196) |
| Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aAldrich | Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding | |
| 40 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753637 | Used as a control sample |
| 20 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753610 | Used as a control sample |
| Zyla 4.2 Camera | Andor | Zyla 4.2 | 2048x2048 pixles (6.5µm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range |
| Feista tracking software | https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA | ||
| Stabilized microtubles | prepared in house (see references in text) |
References
- Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Hotani, H., Horio, T. Dynamics of microtubules visualized by darkfield microscopy: Treadmilling and dynamic instability. Cell Motility and the Cytoskeleton. 10 (1-2), 229-236 (1988).
- Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. The Journal of Cell Biology. 120 (4), 923-934 (1993).
- Bormuth, V., Howard, J., Schäffer, E. LED illumination for video-enhanced DIC imaging of single microtubules. J Microsc. 226 (Pt 1), 1-5 (2007).
- Andrecka, J., Ortega Arroyo, J., Lewis, K., Cross, R. A., Kukura, P. Label-free Imaging of Microtubules with Sub-nm Precision Using Interferometric Scattering Microscopy. Biophysical Journal. 110 (1), 214-217 (2016).
- Koch, M. D., Rohrbach, A. Label-free Imaging and Bending Analysis of Microtubules by ROCS Microscopy and Optical Trapping. Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).
- Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. Label-Free Imaging of Single Microtubule Dynamics Using Spatial Light Interference Microscopy. ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).
- Curtis, A. S. G. The Mechanism of Adhesion of Cells to Glass. The Journal of Cell Biology. 20 (2), 199-215 (1964).
- Weber, I. [2] Reflection interference contrast microscopy. Methods in Enzymology. 361, 34-47 (2003).
- Gell, C., et al. Chapter 13 - Microtubule Dynamics Reconstituted In Vitro and Imaged by Single-Molecule Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).
- Nitzsche, B., et al. Chapter 14 - Studying Kinesin Motors by Optical 3D-Nanometry in Gliding Motility Assays. Methods in Cell Biology. 95, 247-271 (2010).
- Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Schäffer, E., Howard, J. Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy. Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).
- Hyman, A., et al. [39] Preparation of modified tubulins. Methods in Enzymology. 196, 478-485 (1991).
- Ruhnow, F., Zwicker, D., Diez, S. Tracking Single Particles and Elongated Filaments with Nanometer Precision. Biophysical Journal. 100 (11), 2820-2828 (2011).
- Mahamdeh, M., Schäffer, E. Optical tweezers with millikelvin precision of temperature-controlled objectives and base-pair resolution. Optics Express. 17 (19), 17190-17199 (2009).
- Kim, K., Saleh, O. A. Stabilizing method for reflection interference contrast microscopy. Applied Optics. 47 (12), 2070-2075 (2008).
- Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging. Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).
- Carter, A. R., King, G. M., Ulrich, T. A., Halsey, W., Alchenberger, D., Perkins, T. T. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl Opt. 46 (3), 421-427 (2007).
- Limozin, L., Sengupta, K. Quantitative Reflection Interference Contrast Microscopy (RICM) in Soft Matter and Cell Adhesion. ChemPhysChem. 10 (16), 2752-2768 (2009).
