Summary
هذا البروتوكول هو دليل لتنفيذ مجهريانعكاس التداخل على مجهر الفلورة القياسية للتصوير خالية من التسمية، عالية التباين، عالية السرعة من microtubules باستخدام الأسطح في المختبر الاختبارات.
Abstract
هناك عدة طرق لتصور الجزيئات الحيوية النقية بالقرب من الأسطح. التنظير المجهري للانعكاس الكلي الداخلي (TIRF) هو طريقة شائعة الاستخدام، ولكن لديه العيب الذي يتطلب وضع العلامات الفلورية، والتي يمكن أن تتداخل مع نشاط الجزيئات. أيضا، تبييض الصور والضرر الضوئي هي المخاوف. في حالة الأنابيب الدقيقة، وجدنا أنه يمكن الحصول على صور ذات جودة مماثلة لـ TIRF باستخدام مجهري انعكاس التداخل (IRM). وهذا يشير إلى أن IRM قد يكون تقنية عامة لتصور ديناميات الجزيئات الحيوية الكبيرة وoligomers في المختبر. في هذه الورقة، نبين كيف يمكن تعديل مجهر الفلورة ببساطة للحصول على صور IRM. والإدارة الدولية للآثار أسهل وأرخص بكثير في التنفيذ من تقنيات التباين الأخرى مثل الفحص المجهري للتداخل التفاضلي أو الفحص المجهري للتشتت التداخلي. كما أنها أقل عرضة للعيوب السطحية والشوائب الحل من المجهرية darkfield. باستخدام IRM، جنبا إلى جنب مع برنامج تحليل الصور الموصوفة في هذه الورقة، يتم تحديد مجال الرؤية ومعدل الإطار فقط بواسطة الكاميرا؛ مع كاميرا sCMOS والإضاءة واسعة المجال طول microtubule يمكن قياسها بدقة تصل إلى 20 نانومتر مع عرض النطاق الترددي من 10 هرتز.
Introduction
التصوير الخالي من الملصقات من الأنابيب الدقيقة هو موضع اهتمام لأنه يتحايل على الحاجة إلى وضع العلامات الفلورية من توبولين لتوليد التباين في الصور. وضع العلامات الفلورية له العديد من العيوب: فإنه ليس من الممكن إذا كان تركيز البروتين منخفض1 وتبييض الصور والأضرار الضوئية تحد من وقت المراقبة. وقد استخدمت عدة تقنيات لصور microtubules خالية من التسمية، بما في ذلك الفيديو تعزيز التدخلالتفاضلي ة التباين المجهري (DIC) وميكروسكوب darkfield 2،3،4،5. وفي الآونة الأخيرة، استُخدمت أيضاً مجهرية التشتت التداخلي (iSCAT)6،والفحص المجهري المبعثر المتماسك الدوار (ROCS)7، والفحص المجهري لتداخل الضوء المكاني (SLIM)8. كل هذه التقنيات قادرة على تصوير microtubules وأثبتت أنها قيمة لدراسة ديناميات microtubule. ومع ذلك، لكل منها قيودخاصة بها. في DIC التباين يعتمد على زاوية بين microtubule ومحور المنشور نومارسكي. في darkfield، يتم تدهور إشارة microtubule بواسطة الضوء المتناثر من الشوائب أو عيوب الأسطح. على الرغم من أن iSCAT يظهر حساسية غير عادية (وصولا إلى بروتينات واحدة) وROCS يمكن صورة microtubules أعمق في العينة، وكلا الأسلوبين تتطلب من الناحية الفنية، مما يتطلب الماسحات الضوئية الليزر.
يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن إعداد الفحص المجهري لانعكاس التداخل (IRM)9و10 كتقنية بديلة للتصوير الخالي من الملصقات للأنابيب الدقيقة. IRM من السهل تنفيذ لأنه يتطلب فقط إضافة مرآة غير مكلفة 50/50 إلى المجهر الفلورسنت القياسية. عند استخدامها جنبا إلى جنب مع البرنامج الموضح هنا، IRM تنتج صور microtubule عالية التباين، ويمكن صورة حقول كبيرة من الرؤية بسرعة عالية، ويتطلب محاذاة لمرة واحدة، ويمكن بسهولة أن تكون جنبا إلى جنب مع تقنيات أخرى مثل التصوير الفلوري.
Protocol
1. تعديل المجهر وعدسة موضوعية
- إدراج مرآة 50/50 في عجلة تصفية المجهر الفلورسنتباستخدام مكعب فلتر المناسبة (الشكل 1). التعامل مع مرآة 50/50 مع الرعاية في كثير من الأحيان لديهم طلاء المضادة للانعكاس.
ملاحظة: استخدمنا مرآة 50/50 في مكعب فلتر فارغ من المجهر. يتم إدراج المرآة 50/50 حيث تقع المرآة ثنائية الديكروويك. - استخدام ارتفاع التكبير / ارتفاع هدف النفط NA.
ملاحظة: في هذا البروتوكول، استخدمنا هدف NA 100x/1.3.
2. إعداد الغرفة لالتمسك microtubules على السطح
- شرائح مجهر نظيفة والأغطية 22 مم × 22 مم (للمجهر المنتصب) أو 22 مم × 22 مم و 18 مم × 18 مم تغطية (للمجاهر المقلوب). تعديل السطح حسب الحاجة. على سبيل المثال، تنظيف الأغطية باستخدام المنظفات القلوية (انظر جدولالمواد) تليها الإيثانول 100٪ مع غسيل الماء المقطر في ما بين وبعد11.
- قطع 3 ملم شرائط واسعة من البلاستيك البارافين فيلم (انظر جدولالمواد) باستخدام شفرة الحلاقة وشريحة المجهر آخر كحافة.
- ضع اثنين من شرائط فيلم البارافين البلاستيكي ة بفارق 3 مم على غطاء نظيف مقاس 22 × 22 مم. ثم ضع غطاء تغطية 18 مم × 18 مم لتشكيل قناة. إذا كنت تستخدم المجهر تستقيم، ووضع شرائط على رأس شريحة المجهر نظيفة ومن ثم وضع غطاء على رأس.
- ضع غطاء الغلاف (أو الشريحة) على كتلة حرارية عند درجة حرارة 100 درجة مئوية لمدة 10-30 درجة لكل من فيلم البارافين لتشكيل قناة مختومة.
- تدفق في 50 ميكروغرام / مل من الأجسام المضادة (في برينكسالمخزن الداخلي 1980 (BRB80)) عن طريق التسريب باستخدام ماصة. حضانة لمدة 10 دقائق.
ملاحظة: نستخدم الأجسام المضادة المضادة للرودامين لربط بذور الأنابيب الدقيقة التي تحمل علامة رودامين إلى السطح. بدلا من ذلك، يمكن استخدام avidin لربط بذور microtubule التي تحمل علامة البيوتين أو لجزيئات الذهب biotinylated. ببساطة إلقاء نظرة على microtubules في غياب توبولين في الحل (أي، فحص غير ديناميكي)، يمكن استخدام الأجسام المضادة للطوبولين. - اغسل خمس مرات مع المخزن المؤقت BRB80. من المستحسن تصفية الحلول باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
- تدفق في 1٪ poloxamer 407 (بوليمر ثلاثي البلوك) في BRB80 لمنع السطح ضد ملزمة غير محددة. حضانة لمدة 10 دقائق.
- اغسل خمس مرات مع المخزن المؤقت BRB80.
- العينة جاهزة لوضعها على المجهر. لمنع جفاف العينة، أضف اثنين من قطرات المخزن المؤقت BRB80 في نهايات القناة وتجديد عند الحاجة.
3. محاذاة المجهر
- ضع العينة على مرحلة المجهر. قم بتشغيل مصدر ضوء الإضاءة الظهارية.
- التركيز على سطح العينة. سوف تلاحظ أسطح متعددة كما يتم نقل الهدف صعودا وهبوطا بسبب انعكاس الظهر للضوء من البصريات داخل المسار البصري. وهناك طريقة جيدة للعثور على سطح العينة هو التركيز على حافة فيلم البارافين. بمجرد العثور على السطح، تعيين حقل الرؤية إلى وسط الغرفة.
- مركز الحجاب الحاجز الحقل في مجال الرؤية عن طريق إغلاقه في منتصف الطريق واستخدام مسامير التكيف. بمجرد محاذاة، إعادة فتح الحجاب الحاجز.
ملاحظة: يجب إجراء ضبط المسمار فقط بشكل متقطع، ربما كل 3-6 أشهر أو عند استكشاف الأخطاء وإصلاحها. - الشريحة في عدسة برتراند لعرض التلميذ الخروج (عودة مستوى التركيز) من الهدف.
- أغلق الحجاب الحاجز الفتحة (AD) خارج حواف التلميذ الخروج من الهدف.
- استخدام مسامير التكيف لمركز AD مع التلميذ الخروج. الاختيار المزدوج عن طريق فتح AD ومطابقة حوافها مع تلك التي من التلميذ الخروج.
ملاحظة: هذا التعديل يحتاج فقط إلى القيام به بشكل متقطع. - تعيين الحجاب الحاجز فتحة إلى حوالي 2/3 من NA من الهدف. راجع القسم 7 للاطلاع على الإجراءات التفصيلية لتحسين الحجاب الحاجز الفتحة.
4. التصوير استقرت microtubules أو 40 نانومتر جزيئات الذهب
ملاحظة: الأنابيب الدقيقة المثبتة والجسيمات النانوية الذهبية بمثابة عينات تحكم جيدة. من المستحسن أن سطح الصورة المرفقة microtubules أو الجسيمات النانوية الذهب كخطوة أولى لتقييم أداء IRM والمساعدة في وضع فتح الحجاب الحاجز فتحة الأمثل (القسم 7).
- قم بتعيين وقت التعرض للكاميرا إلى 10 مللي ثانية وضبط الإضاءة لتشبع النطاق الديناميكي للكاميرا تقريبًا.
- تدفق في 10 ميكرول من guanylyl-(ألفا، بيتا) - ميثيلين ديفوسفونات (GMPCCP) - أو ميكروتوبوليس استقرت تاكسول في BRB804،12،13 (أو 40 جزيئات الذهب نانومتر) عن طريق التسريب باستخدام ماصة لعينة جديدة ومراقبة ملزمة عن طريق تصوير السطح. مرة واحدة 10-20 microtubules ملزمة داخل مجال الرؤية، وغسل العينة 2X مع BRB80.
ملاحظة: مع المجهر محاذاة جيدا، يجب أن تكون microtubules مرئية دون الطرح الخلفية. - الحصول على 10 صور عن طريق تعيين فاصل زمني مع فترة تأخير ثانية واحدة لمدة 10 ثوان (عند التعرض 10 مللي ثانية).
- الحصول على صورة خلفية. للقيام بذلك، نقل المرحلة باستخدام وحدة تحكم المرحلة أو برامج الكمبيوتر على طول محور القناة الطويل مع الحصول على 100 صورة دون تأخير (أي تدفق ما يقرب من 100 إطارا في الثانية @ 10 مللي ثانية التعرض).
ملاحظة: الخلفية هي متوسط الصور 100. من خلال أخذ المتوسط، يتم الحفاظ على ملف الإضاءة والميزات الثابتة الأخرى مثل الأوساخ على البصريات في حين يتم تصفية كل شيء آخر. يجب أن يكون هناك أي إمالة على العينة لأن هذا سيؤدي إلى تغيير في الموقف المحوري كما يتم نقل المرحلة وتحلل في نهاية المطاف صورة الخلفية. إذا كان لا يمكن تجنب الميل، ثم طريقة بديلة للحصول على صور الخلفية متوسط قبل تدفق البذور. - لمعالجة الصور وتحليلها، انتقل إلى الخطوة 6.
5. التصوير ديناميات microtubule
- لديناميات microtubule باستخدام توبولين الدماغ، تعيين درجة حرارة سخان عينة إلى 37 درجة مئوية.
- تدفق في 10 ميكروتوبول GMPCCP استقرت في BRB8011 عن طريق التسريب باستخدام ماصة إلى عينة جديدة ورصدها ملزمة على السطح عن طريق تصوير السطح الحية (أي أثناء تدفق). مرة واحدة 10-20 البذور ملزمة مع مجال الرؤية، وغسل العينة باستخدام حجم قناة 2X مع BRB80 (BRB80 ينبغي أن تكون prewarmed إلى 37 درجة مئوية أو على الأقل في درجة حرارة الغرفة).
ملاحظة: مع المجهر محاذاة بشكل جيد، يجب أن تكون البذور مرئية دون الطرح الخلفية. - تدفق في مزيج البلمرة (7.5 درجة مئوية tubulin غير المسمى + 1 m guanosine ثلاثي الفوسفات (GTP) + 1 m Dithiothreitol (DTT) في BRB80 العازلة). لقياس نمو الأنابيب الدقيقة، قم بتعيين فاصل زمني باستخدام برنامج الاكتساب للحصول على صورة كل 5 ثوان (0.2 إطار في الثانية (إطارا في الثانية)) لمدة 15 دقيقة.
- لتحسين التباين، يمكنك الحصول على 10 صور (بدلاً من صورة واحدة) في كل نقطة زمنية ومتوسطها. لانكماش microtubule، الحصول على الصور في 100 إطارا في الثانية عن طريق تعيين تأخير الوقت إلى 0 ووقت التعرض من 10ms (أعلى إطارا في الثانية هو ممكن مع مناطق أصغر من الاهتمام اعتمادا على الكاميرا المستخدمة).
- الحصول على صورة خلفية كما هو الحال في الخطوة 4.4.
6 - معالجة الصور وتحليلها
ملاحظة: للتحليل، يستخدم هذا البروتوكول فيجي14 ولكن القارئ حر في استخدام أي برنامج يجده مناسباً.
- افتح صور الخلفية المحفوظة.
- حساب الصورة الوسيطة (أي الخلفية) باستخدام الصورة > المكدس > مشروع Z > متوسط.
- فتح ميكروتوبول ديناميات الفيلم ككومة (نفس لmicrotubules غير ديناميكية) باستخدام ملف > فتح.
- طرح صورة الخلفية من المكدس باستخدام عملية > آلة حاسبة الصورة. تأكد من التحقق من الخيار "32بت (تعويم) النتيجة".
- بالنسبة للميكروتوبوليس الديناميكية، باستخدام أداة الخط رسم خط على طول الأنابيب الدقيقة من الفائدة وإضافته إلى المنطقة من مدير الفائدة عن طريق الضغط على "ر". كرر لجميع الأنابيب الدقيقة ذات الفائدة.
- للحصول على microtubules الحيوية، قم بتشغيل الماكرو متعدد Kymo (ملفتكميلي1). سيقوم الماكرو بإنشاء فيديو وkymograph لكل ميكروتوبول في مدير ROI. كل ميكروتوبول سوف تحصل على معرف فريد من نوعه.
- بالنسبة للميكروتوبوليس الديناميكية، قم بتشغيل ماكرو Kymo-Analysis (ملفتكميلي2) واتبع خطواته لقياس معدلات النمو ومعدلات انكماش الأنابيب الدقيقة.
7. فتحة حجم الحجاب الحاجز
ملاحظة: عامل مهم للحصول على صور عالية التباين من microtubules باستخدام IRM هو وضع فتحة الإضاءة الرقمية(INA)بشكل صحيح10،15. يمكن تغيير INA عن طريق تغيير حجم شعاع الإضاءة الواردة في التلميذ الخروج الهدف الذي يتم التحكم فيه من قبل حجم AD (يقع AD في طائرة مترافقة مع التلميذ الخروج (الطائرة البؤرية الخلفية) من الهدف الشكل1:
حيث DAD هو قطر الحجاب الحاجز الفتحة، والهدف هو البعد البؤري للهدف وD ep هو قطر التلميذ الخروج الهدف. عادة، يتم ترك AD مفتوحة تماما للتصوير الفلورية، وبالتالي فإن INA يساوي NAالهدف . في مجهر الفلورة، لا يشير مقياس AD إلى قطره، وبالتالي لا يمكن حساب INA. من الممكن معايرة حجم AD بمساعدة هدف. ومع ذلك، فإنه ليس من الضروري لأن حجم AD سيتم إصلاح إلى الحجم الذي ينتج أعلى تباين.
- إعداد عينة من الأنابيب الدقيقة المثبتة الفلورية عالقة على السطح (الخطوات 4.1-4.2).
ملاحظة: استخدمنا رباعي ميثيل رودادومين المسمى microtubules16 (السابق: 550 نانومتر، Em: 580 نانومتر). - جلب microtubules في التركيز باستخدام المجهر التركيز مقبض بينما تصوير الفلورسنت لهم (إذا لم يتم وضععلامة microtubules، صورلهم مع IRM15 أو DIC 5).
- تعيين التعرض الكاميرا إلى 10 مللي ثانية باستخدام برنامج الكاميرا.
ملاحظة: هذا التعرض هو تعسفي والتعرض من 100 مللي ثانية ستعمل أيضا. - أغلق AD إلى أصغر فتحة لها. اضبط الإضاءة لتشبع النطاق الديناميكي للكاميرا تقريبًا أو إلى أقصى حد ممكن.
ملاحظة: كدليل، استخدم جدول البحث الذي يتم توفيره عادةً من قبل برنامج الاكتساب. - الحصول على 10 صور (عن طريق تدفق أو التقاط صورة كل ثانية) من مجال الرؤية التي تحتوي على 10+ microtubules.
- الحصول على صورة خلفية كما هو الحال في الخطوة 4.4.
- تغيير حجم AD وكرر الخطوات 7.5-7.6 لمجموعة فتح AD بأكمله (من مغلقة إلى حجم التلميذ الخروج، الشكل2). في كل مرة يتم فيها تغيير حجم AD، اضبط شدة الإضاءة لتتناسب مع شدة الخطوة 7.4.
- لكل مجال من مجالات الرؤية المكتسبة، طرح الخلفية المقابلة باستخدام عملية > آلة حاسبة الصورة واختيار "طرح" من القائمة المنسدلة. تأكد من تحديد الخيار "32بت (تعويم) النتيجة". ثم متوسط الصور الناتجة باستخدام الصورة > مكدس > مشروع Z > متوسط.
- قياس نسبة الضوضاء من إشارة إلى الخلفية (SBR) من microtubules تعريف متوسط كثافة إشارة microtubule (كثافة microtubule ناقص كثافة الخلفية) مقسوما على الانحراف المعياري للخلفية ( الشكل3).
- تحديد حجم AD الأمثل (أي INA الأمثل) عن طريق حساب متوسط SBR من microtubules لكل حجم فتح وتعيين حجمAD إلى واحد إنتاج أعلى SBR (الشكل 2). فمن الممكن أن هناك مجموعة من أحجام AD التي تنتج تباين مماثل15.
Representative Results
كما ذكر أعلاه، مع المجهر محاذاة جيدا، يجب أن تكون microtubules مرئية دون الطرح الخلفية (الشكل4A). طرح الخلفية (الشكل 4B) يعزز تباين microtubule (الشكل4C). لزيادة تعزيز التباين، يمكن استخدام تصفية متوسط أو فورييه أو مزيج من كليهما (الشكل4D، F،E). يظهر مسح الخط في الشكل 4G التحسن المتزايد لجودة الصورة. لاحظ الحد من الضوضاء الخلفية مع كل خطوة معالجة.
وترد في الشكل 5أمثلة على الكيوموغرافيا لديناميات الأنابيب الدقيقة التي تم إنشاؤها من أفلام الفاصل الزمني. تم الحصول على أشرطة الفيديو بمعدلين الإطار: 0.2 إطارا في الثانية (بطيئة) و 100 إطارا في الثانية (سريع). فالأولى مناسبة لقياس معدلات النمو في حين أن المعدل الثاني أنسب لقياس معدل الانكماش الذي هو ترتيب للحجم أسرع من معدل النمو.
بالنسبة للحالة التي تستخدم فيها جسيمات الذهب النانوية لإعداد المجهر، تظهر صورة على سبيل المثال في الشكل 6. تم ربط الجسيمات النانوية الذهبية بشكل سلبي على السطح. في حين ينصح جزيئات 40 نانومتر, فمن الممكن أيضا لصورة جزيئات 20 نانومتر, ولكن في تباين أقل.
الشكل 1 التمثيل التخطيطي لـ IRM. (أ) تمر الإضاءة الظهارية من مصدر الضوء عبر الحجاب الحاجز الفتحة قبل الوصول إلى المرآة 50/50. يضع الحجاب الحاجز الفتحة عرض الحزمة وبالتالي الإضاءة NA. تعكس المرآة 50/50 جزئيًا الضوء حتى الهدف المتمثل في إلقاء الضوء على العينة. يتم جمع الضوء المنعكس من العينة ومن ثم إسقاطها على رقاقة الكاميرا (بواسطة عدسة أنبوب) حيث يتداخل لتوليد الصورة. تباين الصورة هو نتيجة التداخل بين الضوء المنعكس من واجهة الزجاج/الماء (I1) والضوء المنعكس من واجهة الماء/الأنابيب الدقيقة (I2). اعتمادا على المسافة microtubule / سطح (ح)، والفرق المسار البصري بين I1 و I2 سيؤدي إلى بناءة (إشارة مشرقة) أو المدمرة (إشارة الظلام) أو أي شيء في ما بين. على سبيل المثال، إذا تم استخدام الضوء مع الطول الموجي من 600 نانومتر للتصوير، فإن التباين التبديل بين الظلام ومشرق عندما يتغير ارتفاع microtubule بحوالي 100 نانومتر. تشير العلامة النجمية إلى الطائرات المتقارنة (المعدلة من15). (ب) مثال على تركيب المرآة 50/50. تم فتح مكعب فلتر مناسب وتم إدخال المرآة حيث يجلس عادة مرآة ثنائية اللون. تم توجيه المرآة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم تم إدراج المكعب في عجلة التصفية التي تم إدراجها مرة أخرى إلى المجهر (لم يظهر). أثناء التثبيت، تم استخدام القفازات، وكانت المرآة عقدت فقط من قبل حواف. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 إعداد الحجاب الحاجز الفتحة الأمثل. (أ) تم تصوير نفس مجال الرؤية في فتحات الحجاب الحاجز ذات الفتحة المختلفة دون طرح الخلفية. بصريا، زاد التباين مع زيادة حجم الحجاب الحاجز الفتحة حتى وصلت إلى هضبة وبدأت تتحلل بعد ذلك. وقد تأكد ذلك من خلال (B) قياسات SBR للصور الخلفية المطروحة. أشرطة الخطأ هي الانحراف المعياري. قضبان مقياس هي 500 ميكرومتر (AD) و 3 ميكروم (microtubules). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 قياس نسبة الضوضاء من الإشارة إلى الخلفية. وتم عزل الأنابيب الدقيقة في المناطق ذات الأهمية. وقد تم عتبة كل منطقة من المناطق ذات الأهمية لفصل الأنابيب الدقيقة عن الخلفية. تم الحصول على متوسط إشارة microtubule من مسح خط عبر الأنابيب الدقيقة. تم تعيين عرض خط المسح الضوئي ليساوي طول microtubule. بهذه الطريقة، كل نقطة على المسح الضوئي هو متوسط إشارات جميع بكسل على طول محور microtubule التي هي موازية لتلك النقطة. الضوضاء الخلفية هو الانحراف المعياري لجميع بكسل تحت عتبة قطع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 معالجة الصور. بعد الحصول على الصور الخام (A)،تم طرح الخلفية (B) (C) لتعزيز تباين الأنابيب الدقيقة. لزيادة تحسين التباين كانت الصور إما متوسطة (D) أو فورييه تصفيتها (E) أو كليهما (F). يتم مطابقة لون مسح الخط (G)، الذي يشير إلى موقعه بواسطة الخط الأحمر المتقطع في (A) مع الصور المختلفة في (A) إلى (F). الأرقام في الركن السفلي هي متوسط SBRs المقاسة لمجال العرض بأكمله. شريط مقياس هو 5 ميكرومتر (تعديل من15). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 أمثلة على الكيموغرافيا. (أ) أمثلة Kymograph من ديناميات microtubule ولدت من أفلام الفاصل الزمني المكتسبة في 0.2 إطارا في الثانية. (ب) Kymograph تصور مثالا على حدث انكماش ولدت من فيلم المكتسبة في 100 إطارا في الثانية. خطوط متقطعة علامة على البذور. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6 مثال على جسيمات الذهب النانوية المصورة مع IRM. تم إرفاق جسيمات نانوية ذهبية من أحجام 20 و 40 نانومتر بشكل سلبي على السطح. تم الحصول على 10 صور. بعد الطرح الخلفية، تم متوسط الصور لتعزيز التباين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7 ميكروتوبول طول تتبع الدقة في صور IRM. تم تصوير الأنابيب الدقيقة المستقرة (أي أطوال ثابتة) 200x بمعدل 100 إطار في الثانية ثم متوسطها إلى 10 إطارات في الثانية لتعزيز التباين. بعد ذلك، تم قياس أطوال microtubules باستخدام برنامج تتبع Fiesta17. لكل ميكروتوبول تم حساب متوسط الطول والانحراف المعياري كما هو مبين في الشكل (خط متقطع يمثل خطوط حمراء متوسط والصلبة يمثل الانحراف المعياري، الطول = 3971 ± 20 نانومتر. وكانت دقة التتبع الإجمالية هي متوسط الانحراف المعياري لجميع الأنابيب الدقيقة المتجنّسة (n = 6 microtubules x 20 نقطة بيانات = 120 نقطة بيانات). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الملف التكميلي 1. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الملف التكميلي 2. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
وقد أثبت هذا البروتوكول النجاح في استخدام الإدارة الداخلية للوحدات في تصوير وقياس ديناميات الأنابيب الدقيقة. وينبغي توخي الحذر لتعيين الفتحة الرقمية للإضاءة بشكل صحيح حيث أن لها أقوى تأثير على تباين الصورة. أيضا، استخدام أهداف فتحة رقمية عالية (NA) مهم للحصول على دقة عالية / صور عالية التباين، كما أعلى هدف NA لديها أعلى ضوء جمع الطاقة مقارنة مع أهداف NA منخفضة. الأنظف السطح والحلول تستخدم أقل الضوضاء كما الأوساخ ينتهي إرفاق على السطح وإضافة (على مدى التجربة) شبح مثل الضوضاء إلى الصور. الحصول على صورة خلفية مهم، فضلا عن أنه يزيل عدم تجانس الإضاءة، والضوضاء الساكنة والمخالفات السطحية.
التعديل الموصى به هو إدخال مرشح تمرير ة طويلة (>600 نانومتر) في مسار الإضاءة. الطيف من مصادر الضوء الأبيض عادة ما يحتوي على أطوال موجية في الأشعة فوق البنفسجية التي يمكن أن تضر microtubules. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام طول الموجة الطويلة لـ IRM مفيد عند الجمع بين IRM والفلورة (على سبيل المثال، عند دراسة تأثير البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة (MAPs) على ديناميات الأنابيب الدقيقة). يجب أن تدرك أنه عند التصوير لفترة من الزمن المستهلكة، والانجراف عينة (وخاصة على طول المحور البصري) يقلل من تباين الصورة بسبب انحراف مستوى الصورة من مستوى الخلفية. وغالبا ما تكون مجهزة المجاهر الحديثة مع آليات التثبيت (على سبيل المثال، التركيز المثالي (نيكون)، التركيز المحدد.2 (زايس)، IX3-ZDC2 (أوليمبوس)). حل بديل هو استقرار حراريا الإعداد إما بشكل سلبي أو نشط18 أو عن طريق تصحيح الانجراف19،20،21. وأخيرا، يمكن زيادة التباين microtubule عن طريق الحد من حجم الحجاب الحاجز المجال (فتح 70٪ هو خيار جيد كما هو توازن بين زيادة التباين وحجم مجال الرؤية)15.
في حين أن IRM مناسبة لتصوير microtubules أنها ليست حساسة بما فيه الكفاية للكشف عن بروتينات واحدة. لمثل هذا التطبيق، iSCAT هو تقنية أكثر ملاءمة. وبالمثل، الفلورة وiSCAT هي أكثر ملاءمة إذا كان هناك حاجة إلى دقة تتبع أقل من 10 نانومتر. بالنسبة لـ IRM، تبلغ دقة تتبع الطول المقاسة حوالي 20 نانومتر كما هو موضح في الشكل7.
استخدام IRM في الاختبارات السطحية يمكن أن تتجاوز microtubules; على سبيل المثال، يمكن وضع علامة على المحركات الجزيئية مع جسيمات نانوية ذهبية وتتبعها أثناء تفاعلها مع الأنابيب الدقيقة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن، من حيث المبدأ، استخدام شكل أكثر تقدما ً من IRM يُعرف باسم الفحص المجهري للتداخل العاكس (RICM)22 لزيادة تعزيز تباين الأنابيب الدقيقة والحصول على دقة تتبع أعلى.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنها.
Acknowledgments
ويشكر المؤلفان آنا لوشنياك وين وي كو على قراءتهما النقدية وتعليقاتها على البروتوكول.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope used for perfoming the expriments |
| 50/50 beam splitter | Chroma | 21000 | When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope |
| NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective | Nikon | MRH02902 | Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3 |
| Mucasol universal detergent | Sigma-aAldrich | Z637181-2L | Used for cleaning coverslips and slides |
| plastic paraffin film (commerical name Parafilm M) | Sigma-aAldrich | P7793 | Used for constructing flow channels |
| Anti-TAMRA antibody | Invitrogen | A-6397 | Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196) |
| Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aAldrich | Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding | |
| 40 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753637 | Used as a control sample |
| 20 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753610 | Used as a control sample |
| Zyla 4.2 Camera | Andor | Zyla 4.2 | 2048x2048 pixles (6.5µm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range |
| Feista tracking software | https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA | ||
| Stabilized microtubles | prepared in house (see references in text) |
References
- Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Hotani, H., Horio, T. Dynamics of microtubules visualized by darkfield microscopy: Treadmilling and dynamic instability. Cell Motility and the Cytoskeleton. 10 (1-2), 229-236 (1988).
- Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. The Journal of Cell Biology. 120 (4), 923-934 (1993).
- Bormuth, V., Howard, J., Schäffer, E. LED illumination for video-enhanced DIC imaging of single microtubules. J Microsc. 226 (Pt 1), 1-5 (2007).
- Andrecka, J., Ortega Arroyo, J., Lewis, K., Cross, R. A., Kukura, P. Label-free Imaging of Microtubules with Sub-nm Precision Using Interferometric Scattering Microscopy. Biophysical Journal. 110 (1), 214-217 (2016).
- Koch, M. D., Rohrbach, A. Label-free Imaging and Bending Analysis of Microtubules by ROCS Microscopy and Optical Trapping. Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).
- Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. Label-Free Imaging of Single Microtubule Dynamics Using Spatial Light Interference Microscopy. ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).
- Curtis, A. S. G. The Mechanism of Adhesion of Cells to Glass. The Journal of Cell Biology. 20 (2), 199-215 (1964).
- Weber, I. [2] Reflection interference contrast microscopy. Methods in Enzymology. 361, 34-47 (2003).
- Gell, C., et al. Chapter 13 - Microtubule Dynamics Reconstituted In Vitro and Imaged by Single-Molecule Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).
- Nitzsche, B., et al. Chapter 14 - Studying Kinesin Motors by Optical 3D-Nanometry in Gliding Motility Assays. Methods in Cell Biology. 95, 247-271 (2010).
- Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Schäffer, E., Howard, J. Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy. Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).
- Hyman, A., et al. [39] Preparation of modified tubulins. Methods in Enzymology. 196, 478-485 (1991).
- Ruhnow, F., Zwicker, D., Diez, S. Tracking Single Particles and Elongated Filaments with Nanometer Precision. Biophysical Journal. 100 (11), 2820-2828 (2011).
- Mahamdeh, M., Schäffer, E. Optical tweezers with millikelvin precision of temperature-controlled objectives and base-pair resolution. Optics Express. 17 (19), 17190-17199 (2009).
- Kim, K., Saleh, O. A. Stabilizing method for reflection interference contrast microscopy. Applied Optics. 47 (12), 2070-2075 (2008).
- Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging. Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).
- Carter, A. R., King, G. M., Ulrich, T. A., Halsey, W., Alchenberger, D., Perkins, T. T. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl Opt. 46 (3), 421-427 (2007).
- Limozin, L., Sengupta, K. Quantitative Reflection Interference Contrast Microscopy (RICM) in Soft Matter and Cell Adhesion. ChemPhysChem. 10 (16), 2752-2768 (2009).
