Dit protocol is een leidraad voor het implementeren van interferentie reflectie microscopie op een standaard fluorescentiemicroscoop voor etiket-vrije, hoog-contrast, High-Speed beeldvorming van microtubuli met behulp van in vitro oppervlakken assays.
Er zijn verschillende methoden voor het visualiseren van gezuiverde biomoleules in de buurt van oppervlakken. Total-inwendige reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie is een veelgebruikte methode, maar heeft het nadeel dat het fluorescerende labeling vereist, die kan interfereren met de activiteit van de moleculen. Ook, fotobleaching en foto schade zijn zorgen. In het geval van microtubuli hebben we geconstateerd dat beelden van vergelijkbare kwaliteit als TIRF kunnen worden verkregen met behulp van interferentie reflectie microscopie (IRM). Dit suggereert dat IRM een algemene techniek kan zijn voor het visualiseren van de dynamiek van grote biomoleules en oligomeren in vitro. In dit artikel laten we zien hoe een fluorescentiemicroscoop eenvoudig kan worden aangepast om IRM-afbeeldingen te verkrijgen. IRM is gemakkelijker en aanzienlijk goedkoper om te implementeren dan andere contrast technieken zoals differentiële interferentie contrast micro copy of interferometrische verstrooiing microscopie. Het is ook minder vatbaar voor oppervlakte defecten en oplossing onzuiverheden dan Darkfield microscopie. Met behulp van IRM, samen met de software voorbeeld analyse die in dit document wordt beschreven, wordt het gezichtsveld en de framesnelheid alleen beperkt door de camera; met een sCMOS-camera en breedveld verlichting kan de lengte van de microtubuli met precisie worden gemeten tot 20 nm met een bandbreedte van 10 Hz.
Etiket-vrije beeldvorming van microtubuli is van belang als het omzeilt de behoefte aan fluorescerende labeling van tubuline voor het genereren van contrast in de beelden. Fluorescerende labeling heeft verschillende nadelen: het is niet haalbaar als de eiwitconcentratie laag is1 en fotobleaching en foto schade de observatietijd beperken. Er zijn verschillende technieken gebruikt om label vrije microtubuli te gebruiken, waaronder video-Enhanced differentiële interferentie contrast microscopie (DIC) en Darkfield microscopie2,3,4,5. Recentelijk zijn ook interferometrische verstrooiing microscopie (iSCAT)6, roterende-coherente-verstrooiing microscopie (Rocs)7 en ruimtelijke licht interferentie microscopie (slank)8gebruikt. Al deze technieken zijn geschikt voor het maken van microtubuli-images en bleken waardevol te zijn voor het bestuderen van de dynamiek in de microtube. Echter, elk hebben hun eigen beperkingen. In DIC hangt het contrast af van de hoek tussen de microtubulus en de Nomarski prisma as. In Darkfield wordt het microtubulus signaal afgebroken door verstrooid licht van onzuiverheden of oppervlakken defecten. Hoewel iscat buitengewone gevoeligheid vertoont (tot enkelvoudige eiwitten) en Rocs de microtubuli dieper in het monster kan afbeelden, zijn beide methoden technisch veeleisend, waardoor laserscanners nodig zijn.
Dit protocol demonstreert hoe interferentie reflectie microscopie (IRM)9,10 kan worden ingesteld als een alternatieve techniek voor het labelen van de microtubuli-vrije beeldvorming. IRM is eenvoudig te implementeren omdat het alleen de toevoeging van een goedkope 50/50-spiegel aan een standaard fluorescerende Microscoop vereist. Wanneer gebruikt in combinatie met de software die hier wordt beschreven, produceert IRM hoogcontrast microtubulus beelden, kan grote kijk velden op hoge snelheid beeld, vereist een eenmalige uitlijning, en kan gemakkelijk worden gecombineerd met andere technieken zoals fluorescentie Imaging.
Dit protocol demonstreerde het succesvolle gebruik van IRM voorbeeld vorming en meting van de microtubulus dynamiek. Voorzichtigheid is geboden om het numerieke diafragma van de belichting correct in te stellen, omdat het de sterkste invloed heeft op het beeldcontrast. Ook is het gebruik van hoge numerieke diafragma (NB) doelstellingen belangrijk voor het verkrijgen van afbeeldingen met hoge resolutie/hoog contrast, omdat de hogere NA-doelstelling hogere licht verzamelkracht heeft in vergelijking met lage NA-doelstellingen. Het reinigingsmiddel het oppervlak en de oplossingen gebruikt hoe lager het lawaai als vuil uiteindelijk aan het oppervlak te hechten en toe te voegen (in de loop van het experiment) spikkel als ruis aan de beelden. Acquisitie van een achtergrondbeeld is belangrijk en het verwijdert verlichtings homogeniteiten, statische ruis en oppervlakte onregelmatigheden.
Een aanbevolen modificatie is het introduceren van een lang doorlaat filter (> 600 nm) in het verlichtings traject. Het spectrum van witte lichtbronnen bevat meestal golflengten in de UV die microtubuli kunnen beschadigen. Bovendien is het gebruik van lange golflengte voor IRM handig bij het combineren van IRM met fluorescentie (bijv. bij het bestuderen van het effect van microtubulus geassocieerde eiwitten (kaarten) op de dynamiek van de micro tubulus). Houd er rekening mee dat bij Imaging voor verbruikte periode van tijd, sample drift (vooral langs de optische as) het contrast van het beeld verlaagt vanwege de afwijking van het afbeeldings vlak van het achtergrond vlak. Moderne microscopen zijn vaak uitgerust met stabilisatiemechanismen (bijv. perfecte scherpstelling (Nikon), duidelijke focus. 2 (Zeiss), IX3-ZDC2 (Olympus)). Een alternatieve oplossing is het thermisch stabiliseren van de Setup, passief of actief18 of door het corrigeren van drift19,20,21. Ten slotte kan het contrast van de microtubulus worden vergroot door de grootte van het velddiafragma te verkleinen (een 70% opening is een goede keuze omdat het een evenwicht is tussen het vergroten van het contrast en het gezichtsveld)15.
Hoewel IRM geschikt is voor microtubuli met Imaging, is het niet gevoelig genoeg om enkelvoudige eiwitten te detecteren. Voor een dergelijke toepassing is iSCAT een geschiktere techniek. Evenzo zijn fluorescentie en iSCAT beter geschikt als het bijhouden van precisie van minder dan 10 nm nodig is. Voor IRM is de meetnauwkeurigheid gemeten lengte ~ 20 nm, zoals weergegeven in afbeelding 7.
Het gebruik van IRM in oppervlakte-assays kan verder gaan dan microtubuli; moleculaire motoren kunnen bijvoorbeeld worden geëtiketteerd met gouden nanodeeltjes en worden bijgehouden terwijl ze omgaan met microtubuli. Daarnaast is een meer geavanceerde vorm van IRM bekend als reflecterende interferentie contrast microscopie (RICM)22 kan, in principe, worden gebruikt om microtubuli contrast verder te verbeteren en hogere traceer nauwkeurigheid te verkrijgen.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedanken Anna Luchniak en Yin-Wei Kuo voor kritische lezing en opmerkingen over het protocol.
Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope used for perfoming the expriments |
50/50 beam splitter | Chroma | 21000 | When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope |
NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective | Nikon | MRH02902 | Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3 |
Mucasol universal detergent | Sigma-aAldrich | Z637181-2L | Used for cleaning coverslips and slides |
plastic paraffin film (commerical name Parafilm M) | Sigma-aAldrich | P7793 | Used for constructing flow channels |
Anti-TAMRA antibody | Invitrogen | A-6397 | Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196) |
Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aAldrich | Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding | |
40 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753637 | Used as a control sample |
20 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753610 | Used as a control sample |
Zyla 4.2 Camera | Andor | Zyla 4.2 | 2048×2048 pixles (6.5µm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range |
Feista tracking software | https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA | ||
Stabilized microtubles | prepared in house (see references in text) |