Summary
Denne protokollen beskriver en in vitro batch-kultur gjæring system av menneskelig avføring bakterieflora, ved hjelp inulin (en velkjent prebiotiske og en av de mest studerte bakterieflora modulatorer) for å demonstrere bruken av dette systemet i estimering effekter av spesifikke av avførings bakterieflora sammensetning og metabolske aktiviteter.
Abstract
Den nye rollen til tarmen mikrobiomet i flere menneskelige sykdommer krever et gjennombrudd av nye verktøy, teknikker og teknologier. Slike forbedringer er nødvendig for å dechiffrere utnyttelsen av mikrobiomet modulatorer for menneskers helse fordeler. Imidlertid, det stor-skalaen skjermen og optimering av modulatorer å godkjenne mikrobiomet modulering og forutsi i slekt sunnhet fordeler kanskje være praktisk talt vanskelig på grunn av behovet for stor mengde av dyrene og/eller Human emner. For dette formål, in vitro eller ex vivo-modeller kan forenkle foreløpige screening av mikrobiomet modulatorer. Heri er det optimalisert og demonstrert en ex vivo avføring bakterieflora kultur system som kan brukes til å undersøke virkningene av ulike intervensjoner av gut mikrobiomet modulatorer inkludert probiotika, Prebiotics og andre mat ingredienser, bortsett fra nutraceuticals og narkotika, på mangfoldet og sammensetningen av den menneskelige tarmen bakterieflora. Inulin, en av de mest studerte prebiotiske forbindelser og mikrobiomet modulatorer, brukes som et eksempel her for å undersøke dens effekt på sunne avføring bakterieflora sammensetning og dens metabolske aktiviteter, som for eksempel avføring pH og avføring nivåer av organiske syrer inkludert melkesyre og kort kjede fettsyrer (SCFAs). Protokollen kan være nyttig for studier med sikte på å estimere virkningene av ulike intervensjoner av modulatorer på avføring bakterieflora profiler og til å forutsi deres helsemessige virkninger.
Introduction
Den menneskelige bakterieflora er et komplekst samfunn bestående av bakterier, Archaea, virus og eukaryote mikrober1, som bor i menneskekroppen internt og eksternt. Nylige bevis har etablert den grunnleggende rollen til tarmen bakterieflora og tarmen mikrobiomet (hele samlingen av mikrober og deres gener som finnes i den menneskelige mage-tarmkanalen) i ulike menneskelige sykdommer, inkludert fedme, diabetes, kardiovaskulære sykdommer, og kreft1,2,3. I tillegg mikroorganismer som lever i vår gut produsere et bredt spekter av metabolitter som i betydelig grad påvirker vår helse og kan også bidra til patofysiologi av flere sykdommer, samt en rekke metabolske funksjoner4, 5. unormale forandringer (forstyrrelser) i sammensetningen og funksjon av denne tarmen mikrobiell befolkning er generelt betegnet som "gut dysbiosis". Dysbiosis er vanligvis forbundet med en usunn tilstand av verten og dermed kan skilles fra den normale (homøostatisk) mikrobielle samfunn forbundet med en sunn kontroll tilstand verten. Spesifikke mønstre av gut mikrobiomet dysbiosis er ofte funnet i ulike sykdommer1,2,3,6,7.
Gjæring av ufordøyd mat, spesielt fermentable karbohydrater/fibre, av tarmen bakterieflora ikke bare gir energi, men også produserer avvikende metabolitter inkludert Short-Chain fettsyrer (SCFAs), melkesyre, formiat, karbondioksid, metan, hydrogen og etanol6. I tillegg, tarmen bakterieflora produserer også en rekke andre bioaktive stoffer som folat, biotin, trimetylamin-N-oksid, serotonin, tryptofan, gamma-aminobutyric acid, dopamin, noradrenalin, acetylkolin, histamin, deoxycholic syre, og 4-ethylphenyl sulfat. Dette skjer hovedsakelig gjennom utnyttelse av indre metabolske flukser innenfor Host-mikrobe nisje, som bidrar i flere kroppens prosesser, metabolske funksjoner og epigenetic endringer1,8,9, 10i. Men virkningene av ulike intervensjoner på slike mikrobielle produkter forblir ukjent eller uklart på grunn av mangel på enkel, effektiv og reproduserbar protokoller. Den menneskelige gut bakterieflora sammensetning er en svært kompleks og mangfoldig økosystem, og dermed mange spørsmål om sin rolle i menneskers helse og sykdom patologi fortsatt forblir ubesvart. Effekten av mange vanlige gut mikrobiomet modulatorer (f. eks, probiotika, Prebiotics, antibiotika, avføring transplantasjon og infeksjoner) på sammensetningen og metabolske funksjoner av intestinal bakterieflora fortsatt i stor grad unnvikende. I tillegg er undersøkelse og validering av disse effektene i vivo vanskelig, spesielt fordi de fleste av næringsstoffene og metabolitter som produseres av tarmen bakterieflora absorberes eller kastes samtidig og raskt i tarmen; Derfor er det fortsatt en praktisk utfordring å måle produksjonen, mengden og behandlingen av disse metabolitter (f.eks. SCFAs) in vivo. Faktisk, fysiologiske modeller som dyr og mennesker er avgjørende for å bestemme hvilken rolle gut mikrobiomet og modulering på verten helse, men disse kan ikke være egnet for stor skala screening av ulike typer mikrobiomet modulatorer grunn etiske, monetære eller tidspress. For dette formål, in vitro og/eller ex vivo-modeller, slik som dyrking av gut bakterieflora in vitro og deretter intervenere med ulike bakterieflora modulatorer, kan tilby tid-og penger-sparing muligheter og dermed kan tillate for foreløpige eller stor skala screening av ulike komponenter (for eksempel probiotika, Prebiotics, og andre interventional forbindelser) for å undersøke/forutsi deres virkninger på avføring bakterieflora mangfold, sammensetning og metabolske profiler. Studier som bruker slike in vitro-og ex vivo-systemer i tarmen mikrobiomet kan legge til rette for ytterligere forståelse av mikrobiomet interaksjoner som bidrar til å være vert for helse og sykdom, og kan også føre til å finne romanen behandlinger som mål mikrobiomet til forbedre verten helse og forebygge og behandle ulike sykdommer1.
Selv om in vitro gut bakterieflora kultur systemer ikke kan virkelig gjenskape den faktiske tarm forhold, flere laboratorier har forsøkte å utvikle slike modeller, noen som har blitt funnet praktisk mulig til en viss grad og har blitt brukt til forskjellige formål. En av de siste gut modellene er Simulator av Human intestinal mikrobiell økosystem, som etterligner hele den menneskelige mage-tarmkanalen, inkludert magen, tynntarmen, og ulike regioner i tykktarmen. Imidlertid kan slike teknisk komplekse modeller ikke være tilgjengelig for andre forskningsanlegg over hele verden. Derfor er det fortsatt et kritisk behov for utvikling av nye alternative modeller som er relativt enkle, rimelige og praktiske for laboratorier studere mikrobiomet modulatorer og deres virkninger på Gut bakterieflora og Host helse. Derfor vil bruken av en in vitro (eller ex vivo) avføring bakterieflora kultur system være nyttig for å studere virkningene av slike intervensjoner11,12. Nærmere bestemt, effekten av ulike Prebiotics på bakterieflora gjæring kapasitet i form av periodiske endringer i tarmen bakterieflora mangfold og sammensetning, den avføring pH, og nivåene av mikrobielle metabolitter inkludert SCFAs og melkesyre kan bli studert 13. heri, ved hjelp av inulin (en av de mest studerte prebiotiske komponenter) som et eksempel på mikrobiomet modulator, en trinnvis protokoll for denne enkle ex vivo bakterieflora batch-kultur systemet er beskrevet for å demonstrere sin bruk for å anslå endringer i avføring bakterieflora og mikrobielle metabolitter etter intervensjon med mikrobiomet modulatorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
FORSIKTIG: ta kontakt med de nødvendige sikkerhets data arkene og følg instruksjonene og retningslinjene for passende opplæring i biosafety Level 2 (BSL-2). Følg alle dyrking trinnene i henhold til standard biosafety regler og bruk en BSL-2 kabinett ved hjelp av aseptisk forhold. Videre kan avføringsprøver fra forskjellige modeller og mennesker ha potensiell risiko for å spre mikrobielle sykdommer. Umiddelbart søke medisinsk hjelp i forekomsten av eventuelle skader og infeksjoner. I tillegg bør bruk av mennesker og dyr avføringsprøver godkjennes gjennom institusjonelle etiske komiteer og må samsvare med protokoller for å bruke prøver og faginformasjon.
1. utarbeidelse av kultur Media
-
Utarbeidelse av kulturen Media, utarbeide ni typer lager løsninger
- Løsning A (1 000 mL): oppløse 5,4 g natriumklorid (NaCl), 2,7 g kalium natriumdihydrogenfosfatmonohydrat fosfat (KH2PO4), 0,16 g av kalsiumklorid dinatriumfosfatdihydrat (CaCl2· 2h2O), 0,12 g av magnesiumkloridheksahydrat (MgCl2 · 6h2o), 0,06 g av mangan klorid-tetrahydrat (MnCl2· 4h2O), 0,06 g cobaltous klorid heksa hydrat (CoCl2· 6h2O), og 5,4 g av ammonium sulfat (NH4)2så4, deionisert vann for å gjøre totalvolumet til 1 000 mL.
- Løsning B (1 000 mL): løs opp 2,7 g kalium hydrogen fosfat (K2HPO4) i deionisert vann for å gjøre totalvolumet til 1000 mL.
- Trace mineral løsning (1 000 mL): oppløse 500 mg Disodium etylendiamin-tetraacetate dinatriumfosfatdihydrat (na2EDTA), 200 mg av jernholdige sulfat Heptahydrat (FeSO4· 7H2O), 10 mg sink sulfat heptahydrat (ZnSO4 · 7H2o), 3 mg MANGAN (II) klorid-Tetrahydrat (MnCl2· 4h2O), 30 mg fosforsyre (H3PO4), 20 mg CoCl2· 6h2O, 1 mg cuprikacetat klorid dinatriumfosfatdihydrat (CuCl2 · 2H2o), 2 mg NIKKEL (II) klorid heksa hydrat (NiCl2· 6h2O) og 3 mg natrium molybdat dinatriumfosfatdihydrat (na2MoO4· 2h2o) i deionisert vann for å gjøre total volum til 1 000 ml.
Merk: Denne løsningen er lysfølsom, derfor sørge for å bli lagret i mørke/svart eller aluminium innpakket rør/flasker. - Vannløselig vitamin løsning (1 000 mL): oppløse 100 mg Tiamin hydrochloride (Thiamin-HCl), 100 mg D-Pantotensyre syre, 100 mg niacin, 100 mg pyridoksin, 5 mg P-aminobenzosyre syre og 0,25 mg vitamin B12 i deionisert vann for å gjøre total volum til 1 000 mL.
- Folat: biotin-oppløsning (1 000 mL): løs opp 10 mg folsyre, 2 mg D-biotin og 100 mg ammonium bikarbonat (NH4HCO3) i deionisert vann for å gjøre totalvolumet til 1 000 ml.
- Riboflavin løsning (1 000 mL): oppløse 10 mg av riboflavin i 5 mM HEPES (1,19 g/L) løsning for å gjøre total volum til 1 000 mL.
- Haemin løsning (10 mL): løs opp 5 000 mg Haemin i 10 mM natriumhydroksid (NaOH) (0,4 g/L) løsning for å gjøre total volum til 10 mL.
- Kort-kjede fatty acid mix (10 mL): Kombiner 2,5 mL N-valerate, 2,5 mL isovalerate, 2,5 mL isobutyrate og 2,5 mL: DL-α-methylbutyrate.
Merk: Denne løsningen anbefales å bruke i avtrekksvifte for å unngå lukt og røyk. - Resazurin (1 000 mL): løs opp 1 g Resazurin i deionisert vann og gjør total volum til 1 000 mL.
-
Medium brukt for in vitro anaerob gjæring
- For å forberede dette mediet, bland 330 mL av Solution A, 330 mL oppløsning B, 10 mL Trace mineral løsning, 20 mL vannløselig vitamin oppløsning, 5 mL folat: biotin løsning, 5 mL av riboflavin løsning; 2,5 mL Haemin oppløsning, 0,4 mL kort kjede fatty acid mix, 1 mL Resazurin, 0,5 g gjærekstrakt, 4 g natrium rør (na2co3), 0,5 g cystein HCL-H2O, og 0,5 g Trypticase, og tilsett 296,1 ml destillert vann.
- Sjekk pH og sikre at det er rundt 7,0, hvis ikke, justere pH med 1 N HCl eller 1 N NaOH. Sterilisere ved vakuum filtrering av mediet ved hjelp av en flaske Filter under aseptisk arbeidsstasjon.
- Alternativt, blande alle komponentene (bortsett fra a-vitamin og haemin løsninger) og autoklav for 121 ° c for 20 min og utleie den avkjøle ned å romtemperatur. Samtidig filtrerer-sterilisere vitamin og haemin løsninger ved hjelp av 0,22 μm membran filtre og legge disse til autoklaveres og avkjølt Media før utlevering.
2. utarbeidelse av anaerob kammer og nødvendig materiale
- Oppbevar alle materialer, løsninger og verktøy som trengs for gjæring eksperiment inne i anaerob kammeret minst 48 h før starten av eksperimentet, for å sikre at eventuelle gjenværende oksygen forbundet med verktøy og løselig oksygen i buffere/løsninger er fjernes og alle materialene er akklimatisert til de innstilte anaerobe forholdene.
Merk: Materialer som trengs inne i anaerob kammer (48 h tidligere av eksperimentet for å starte): (i) gjæring Media; (II) anaerob løsning (fremstilt i henhold til avsnitt 4,1), (III) vortexer, (IV) veie balanse, (v) musselin Oste kluter, (vi) saks, (VII) trakt, (VIII) 1,5, 2,0, 15, 50 mL rør, (IX) pipettehjelper (2, 20, 200 og 1 000 μL) og kompatible Pipet Tupper, (x) pistol Pipet og pipets (5 og 10 mL), (XI) papir vev, (XII) markører, (XIII) tube står for ulike rør, (XIV) avfalls boks, (XV) O2 indikator og (xvi) 70% etanol spray flaske (desinfiserende).
3. utarbeidelse av rør og Fibre
- Vekt 300 mg inulin og overføring til en 50 mL rør etterfulgt av aseptisk tillegg av 26 mL gjæring Media allerede forberedt og lagret i det anaerobe kammeret. Forbered en blank tube for hver avføringsprøve type og eksperimentelle rør (s) (i henhold til antall forbindelser som testes), i tre eksemplarer.
- La disse rørene inne i anaerob kammer for rundt 24 h å tillate hydrering av prøvene før du starter gjæring eksperimentet. Sørg for at rør temperaturen er 37 ° c på tidspunktet for inoculation, derfor ta med rørene i inkubator omsluttet i det anaerobe kammeret.
4. utarbeidelse av Inokulum
- Anaerob fortynning løsning (minst 48 h før gjæring eksperiment): oppløse 5 g NaCl, 2 g glukose og 0,3 g cystein-HCl i deionisert vann og gjøre total volum til 1 000 mL. Autoklav og oppbevar den inne i det anaerobe kammeret minst 48 timer før bruk.
- Avføring inokulum forberedelse (på dagen for gjæring eksperiment): veie 5 g fersk avføringsprøve i et 50 mL konisk rør, tilsett anaerob fortynning løsning for et endelig volum på 50 mL (1:10 w/v) og Vortex i 15 min eller til helt homogenisert. Filtrer homogenisert blandingen gjennom 4 lag med sterile cheesecloth (autoklaveres) og bruk den umiddelbart for inoculation i rørene som inneholder medier.
Merk: Den avføringsprøver fra en gruppe av kan samles hvis eksperimentelle mål er å sammenligne effekten av en gitt sammensatte/ingrediens på generelle sunne versus syke avføring bakterieflora generelt.
5. gjæring og prøvetaking
- Forbered rør i henhold til § 4,2 og vaksinere blank/kontroll og eksperimentelle rør med 4 mL fortynnet og filtrert avføring inokulum. Ruge de inokulert rørene ved 37 ° c inne i det anaerobe kammeret. Rist rørene en gang hver time ved invertere forsiktig for å re-suspendere fibrene og inokulum.
- Samle prøver så ofte som nødvendig, for eksempel, hver time til 0, 3, 6, 9 og 24 h under gjæring ved å ta en 2 mL alikvot prøve ut i et 2 mL rør fra respektive gjæring rør.
- Mål pH-verdien i alikvoter ved hjelp av et laboratorie pH-meter (ved å sette inn pH-elektroden direkte i prøven); sentrifuger den gjenværende prøven ved 14 000 x g i 10 min ved 4 ° c. Umiddelbart fryse supernatanten og pellet i flytende nitrogen, og etter snap frysing, Oppbevar supernatanten for SCFAs analyse og pellet for mikrobiomet analyse ved-80 ° c.
6. kort kjede fettsyrer (SCFAs) og melkesyre kvantifisering
Merk: SCFAs og melkesyre i supernatanten av mikrobiomet kulturen kan måles nøyaktig i henhold til de metoder som er beskrevet andre steder13,14,15,16.
- Kort sagt, tine snap frosne supernatanter innhentet i § 5 fra kontroll og behandling prøver på is og utføre alle videre behandling trinn på isen. Filtrer supernatanten gjennom en 0,45 μm membran filter og bruk den celle-frie prøver å måle konsentrasjonen av SCFAs og melkesyre ved hjelp av HPLC system med DAD detektor ved 210 NM, utstyrt med en HPX-87H kolonne. Bruk sprøyte volum på 10 μL for hver prøve og bruk H2så4 (0,005 N) for å eluere kolonnen med en strømningshastighet på 0,6 mL/min ved 35 ° c.
7. avføring Mikrobiomet analyse
Merk: Utfør mikrobiomet analyse følgende metoder og rørledning detaljert andre steder7,13,14,17.
- Kort, ekstrakt genomisk DNA fra ca 200 mg avføring pellets ved hjelp av en avføring DNA utvinning Kit13.
- Forsterke hypervariable regionen av bakteriell 16S rRNA genet ved hjelp av Barcoded primere i henhold til metoden beskrevet andre steder13, ved hjelp av primer sekvenser som beskrevet i jorden mikrobiomet Project protokoll18.
- Rens den resulterende amplicons med magnetisk rensing perler og kvantifisere av Picogreen eller en tilsvarende metode. Pool renset PCR produkter i lik molar konsentrasjon og sekvens på en Sequencer13.
- Behandle de resulterende sekvensene for de-multipleksing, kvalitet filtrering og Clustering, taksonomisk oppdrag og sjeldnere, og nedstrøms analyser ved hjelp av kvantitativ innsikt i mikrobiell økologi (QIIME) programvare i henhold til metodene beskrevet av Caporaso et al.19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen brukes til å demonstrere effekten av en bestemt prebiotiske (dvs. inulin på bakterieflora sammensetning og metabolske aktiviteter i form av endringer i avførings pH og konsentrasjonen av melkesyre og SCFAs i avføringen til friske menneskelige over forskjellige tids punkter etter behandling med inulin). PH i avføring, avførings nivåene av melkesyre og SCFAs (figur 1), og bakterieflora sammensetning (figur 2 og Figur 3) måles ved 0 (Baseline), 9 og 24 h av inkubasjons med eller uten inulin. Resultatene viser hvordan avføring bakterieflora sammensetning og dens metabolske aktiviteter er modulert under in vitro gjæring med eller uten inulin behandling.
Figur 1: endringer i Avførings pH (a), melkesyre (b) og korte-kjeden fettsyrer viz. acetate (c), propionate (d) og butyrate (e) i menneskelig avføring ved 0 (Baseline), 9 og 24 h av anaerob gjæring med eller uten inulin. Verdier som presenteres her er Mean ± SEM av tre eksemplarer prøver. * P < 0,05, * *P < 0,01, * * *p < 0,001, kontra Baseline. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: endringer i bakterieflora mangfold og sammensetning i menneskelig avføring ved 0 (Baseline), 9 og 24 h av anaerob gjæring med eller uten inulin. (a) vektet og (b) unweighted Unifrac tiltak for beta-mangfold i en versjon som bruker prinsipp koordinat analyse (PCoA). (c-f) Indekser av Alpha-mangfold viz. Fylogenetiske mangfold (PD hele treet (c); artsrikdom (Chao1; d); observert antall operative taksonomisk enheter (OTUs, e); og arter jevnhet (Shannon index, f)). Relativ overflod av store disse bakteriene (g) og slekter (h). Verdier som presenteres her er Mean ± SEM av tre eksemplarer prøver. * P < 0,05, * *P < 0,01, kontra Baseline. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: lineær discriminant analyse (Lda) effekt størrelse (LEfSe) analyse av gut bakterieflora endringer etter 9 h og 24 h inkubasjons med (INU) eller uten (CTL) inulin. Taksonomisk cladogram avledet fra LEfSe-analyse av 16S-sekvenser (relativ overflod ≥ 0,5%) representerer differensielt rike arter mellom ulike grupper av prøver. Lysstyrken til hvert punkt er proporsjonal med dens effekt størrelse (dvs. takson overflod). Bare dyr som passerer LDA terskelverdi på > 2.4 vises her. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
The in vitro avførings slurry gjæring modell som presenteres her er en enkel single-batch-modell for å omtrentlige effekten av ulike underlag og mikrobielle stammer (f. eks, Prebiotics og probiotika) på sammensetningen av menneskelig avføring bakterieflora så vel som dens metabolske aktiviteter i form av avføring pH og SCFAs nivåer. Resultatene presentert her viser at inoculation av inulin reduserer avføring pH og signifikant øker nivåene av SCFAs og melkesyre i inulin avføring i forhold til ikke-behandlet avføring bakterieflora kultur (figur 1). I tillegg synes tarm bakterieflora underskrift også å være forskjellig mellom inulin og ubehandlede prøver (figur 2 og Figur 3). Disse dataene er eksempler på hvordan dette systemet kan reflektere virkningene av inulin på avførings mikrobiomet mangfold og sammensetning, så vel som dens metabolske aktiviteter. I tillegg, avhengig av spesifikke eksperimentelle mål og hypoteser, en rekke andre faktorer kan også måles ved hjelp av dette systemet. Videre, i tillegg til 16S rRNA gen sekvensering, andre analyser som hele mikrobiell metagenome sekvensering (ved hjelp av hele Genova Sequencer) eller qPCR og kultur metoder rettet mot bestemte én eller flere slekter, arter og stammer (f. eks Bifidobacteria, lactobacilli, Akkermansia, Enterobacteriacaea, clostridia, etc.) kan også utføres. I tillegg kan ulike kromatografiske prosedyrer for analyse av SCFAs, for eksempel LC-MS, GC, GC-MS, GC-FID, og HPLC også utnyttes basert på eksperimentell krav og tilgjengelighet. Likevel bør det bemerkes at prøve forberedelser for disse prosedyrene kan variere i henhold til instrumentene og forholdene som kreves for drift20.
Selv om bruk av fersk avføringsprøve ville gi best reproduserbar resultater; men snap frosset avføringsprøve (som brukes i eksperimentet presenteres her) kan også brukes efficaciously som de fleste av bakteriene kan bli gjenopplivet fra det en gang resuscitated til kroppstemperatur og ikke mer nedbryting skjer etter frysing21. Bruk av frossen prøve kan være spesielt fordelaktig når det er umulig å få ferske avføringsprøver fra bestemte donor (er) på planlagt dag i eksperimentet, eller fra samme donor når et eksperiment må replikeres. Det bemerkes imidlertid at avførings prøvene skal knipse frosset med flytende nitrogen og umiddelbart lagret ved-80 ° c til videre bruk. I tillegg, for å unngå eksponering av frosne avføringsprøver til luft (oksygen), bør prøvene overføres til det anaerobe kammeret så snart som mulig/umiddelbart etter inntak fra fryseren og brukt med en gang (gjentatt tine bør unngås). Alle etterfølgende eksperimenter, inkludert prøve tine, inokulum forberedelser og prosessering bør gjøres inne i det anaerobe kammeret.
Den tarm organiske miljø og pH under nærings-gjæring i stor tarm er svært viktig spesielt i lys av det faktum at en unormalt redusert pH indikerer økt Surhet på grunn av underlaget utnyttelse. Derfor kan raskere pH reduksjon tilsvare raskere substrat utnyttelse22. Selv om, i denne modellen, pH har ikke blitt kontrollert, men inkludering av identiske ikke-behandlet kontroll er sterkt anbefalt å foreta direkte sammenligninger. Den SCFAs produsert i tykktarmen som følge av gjæring av ufordøyelig polysakkarider av tarmen bakterieflora kan ytterligere påvirke ulike mekanismer knyttet til vedlikehold av verten helse. Disse metabolitter bidra i Glukoneogenesen og lipid biosyntesen, fungere som en energikilde for colonocytes, og kan også ha helsemessige fordeler inkludert immunmodulering, kontrollert/forbedret gut barriere funksjoner, og NeuroModulation23, 24,25,26. I tillegg SCFAs er også kjent for å påvirke flere biologiske trasé inkludert hormoner, endocannabinoid system, celle spredning og død, bein helse, mineral absorpsjon, gut motilitet, intestinal pH, og invertere effekter på tarmen mikrobiomet og mikrobiell metabolsk funksjon. Derfor kan kunnskap om profilen og konsentrasjoner av intestinal/avføring SCFAs være en viktig komponent mens evaluere effekten av spesifikke bakterieflora modulatorer6. Selvfølgelig, i tillegg SCFAs, tarmen mikrobiomet produserer også mange andre viktige metabolitter (f. eks, ammonium, vitaminer, histamin). Derfor kan de supernatanten prøvene som samles inn under slike eksperimenter i vitro, også evalueres for globale Plantemetabolomikk analyser for å oppdage romanen gut mikrobiomet-avledede metabolitter som kan påvirkes av spesifikke mikrobiomet modulatorer.
Systemet er beskrevet her har mange fordeler, slik som brukervennlighet, enkelhet, kostnadseffektivitet, og den generelle adoptability av eksperimentell oppsett. Det er imidlertid få begrensninger også. For eksempel, ikke systemet ikke angår samspillet mellom Prebiotics (eller andre intervensjoner som brukes) i det øvre fordøyelsessystemet (f. eks, spytt, mage, tynntarmen) før de utsettes for bakterieflora av tykktarmen. Imidlertid kan slike tiltak vedtas og innlemmes i henhold til spesifikke eksperimentelle krav. Dessuten kan en syrlig og/eller enzymatisk hydrolyse prosessen må utføres før gjæring hvis du bruker bestemte underlag inkludert hele mat eller fordøyelig mat fordi bare den ufordøyelig delen av slike matvarer når til kolon å bli gjæret av den nedre gut bakterieflora. I tillegg kan sammensetningen av gut bakterieflora skifte på grunn av spesifikke kultur forhold under gjæring. For eksempel ble det observert at opp til 9 h av inkubasjons, bakterieflora endringer er mye nærmere normal enn ved 24 h. Men etter 24 h av inkubasjons, men pH og SCFAs nivåer økte betydelig, gut bakterieflora sammensetning viste at Proteobacteria teller økt mens mikrobiell mangfold redusert. Imidlertid er det fortsatt ukjent hvor nøyaktig og tett den økte opphopning av mikrobielle metabolitter sammen med senket avføring pH er forbundet med spesifikke bakterieflora signaturer.
Oppsummert er en enkel protokoll for å simulere ex vivo bakterieflora økosystem beskrevet her. Systemet gjør det mulig for forskere å teste ulike intervensjoner for modulering av bakterieflora mangfold, sammensetning og metabolske funksjon som kan påvirke ulike funksjoner i verten intestinal og generell helse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takknemlig erkjenner finansiering støtte fra senter for diabetes, fedme og metabolisme og klinisk og translational Science Center, den Wake Forest School of Medicine, Department of Defense finansiering (Grant nummer: W81XWH-18-1-0118), den Kermit Glenn Phillips II Chair i kardiovaskulær medisin; National Institutes of Health finansiert Claude D. pepper eldre amerikanere Center (finansiert av P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 og klinisk og translational Science Center (Clinical Research Unit, finansiert av UL1TR001420), er også Heldigvis anerkjent. Vi takker også de frivillige for å gi avføringsprøver, og våre andre Lab-medlemmer for deres tekniske hjelper under dette eksperimentet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 217255 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | TGI | C2388 | Toxic |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Irritating |
| Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) | Acros organics | 2063450000 | Toxic, Irritating |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C121800 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| D-Pantothenic acid | Alfa Aesar | A16609 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) | Biorad | 1610729 | |
| DL-α-methylbutyrate | Sigma-Aldrich | W271918 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | F8263 | Toxic |
| Folic acid | Alfa Aesar | J62937 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
| Hepes | Alfa Aesar | A14777 | |
| Isobutyrate | Alfa Aesar | L04038 | |
| Isovalerate | Alfa Aesar | A18642 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Niacin (Nicotinic acid) | Sigma-Aldrich | N4126 | |
| Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) | Alfa Aesar | A14366 | Toxic |
| N-valerate | Sigma-Aldrich | 240370 | |
| P-aminobenzoic acid | MP China | 102569 | Toxic, Irritating |
| Phosphoric Acid (H3PO4) | Sigma-Aldrich | P5811 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
| Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1551128 | |
| Pyridoxine | Alfa Aesar | A12041 | |
| Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Riboflavin | Alfa Aesar | A11764 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | 1613757 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher BioReagents | 7647-14-5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Chemicals | S320 | |
| Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) | Acros organics | 206375000 | |
| Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) | Acros organics | 148991000 | |
| Trypticase | BD Biosciences | 211921 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
| Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| 0.22 µm membrane filter | |||
| AMPure magnetic purification beads | Agencourt | ||
| Anaerobic chamber with incubatore | Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA | ||
| Bottle filter | Corning | ||
| Cheesecloth | |||
| Illumina MiSeq sequencer | Miseq reagent kit v3 | ||
| pH meter | |||
| Qiagen PowerFecal kit | Qiagen | ||
| Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software | |||
| Qubit-3 fluorimeter | InVitrogen | ||
| Vortex | Thermoscientific | ||
| Waters-2695 Alliance HPLC system | Waters Corporation |
References
- Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
- Xu, Z., Knight, R. Dietary effects on human gut microbiome diversity. British Journal of Nutrition. 113, 1-5 (2015).
- Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The gut microbiota and Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimers Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
- Clemente, J. C., Ursell, L. K., Parfrey, L. W., Knight, R. The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view. The Journal Cell. 148 (6), 1258-1270 (2012).
- Yadav, H., Jain, S., Marotta, F. Probiotics mediated modulation of gut flora might be biotherapeutical approach obesity and type 2 diabetes. Metabolomics : Open Access. 1 (3), 1-3 (2011).
- Ahmadi, S., et al. Dietary Polysaccharides in the Amelioration of Gut Microbiome Dysbiosis and Metabolic Diseases. Obesity and Control Theries: Open Access. 4 (3), (2017).
- Nagpal, R., et al. Obesity-Linked Gut Microbiome Dysbiosis Associated with Derangements in Gut Permeability and Intestinal Cellular Homeostasis Independent of Diet. Journal of Diabetes Research. , 1-9 (2018).
- Paul, B., et al. Influences of diet and the gut microbiome on epigenetic modulation in cancer and other diseases. Journal of Clinical Epigenetics. 7 (1), 112 (2015).
- O’mahony, S., Clarke, G., Borre, Y., Dinan, T., Cryan, J. Serotonin tryptophan metabolism and the brain-gut-microbiome axis. Journal of Behavioural Brain Research. 277, 32-48 (2015).
- Sharon, G., et al. Specialized metabolites from the microbiome in health and disease. Journal of Cell Metabolism. 20 (5), 719-730 (2014).
- Faber, T. A., Bauer, L. L., Price, N. P., Hopkins, A. C., Fahey, G. C. In vitro digestion and fermentation characteristics of temulose molasses, a coproduct of fiberboard production, and select temulose fractions using canine fecal inoculum. Journal of Agricultural Food Chemistry. 59 (5), 1847-1853 (2011).
- Bourquin, L. D., Titgemeyer, E. C., Fahey, G. C. Vegetable fiber fermentation by human fecal bacteria: cell wall polysaccharide disappearance and short-chain fatty acid production during in vitro fermentation and water-holding capacity of unfermented residues. Journal of Nutrition. 123 (5), 860-869 (1993).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short-chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Nagpal, R., et al. Comparative microbiome signatures and short-chain fatty acids in mouse, rat, non-human primate and human feces. Frontiers in Microbiology. 9, 2897 (2018).
- Thangamani, S., Guinan, J., Wang, S., Yadav, H. Antibiotic-induced decreases in the levels of microbial-derived short-chain fatty acids promote gastrointestinal colonization of Candida albicans. bioRxiv. , 428474 (2018).
- Ahmadi, S., et al. Prebiotics from acorn and sago prevent high-fat diet-induced insulin resistance via microbiome-gut-brain axis modulation. The Journal of Nutritional Biochemistry. , (2019).
- Nagpal, R., et al. Gut Microbiome Composition in Non-human Primates Consuming a Western or Mediterranean Diet. Frontiers in Nutrition. 5, 28 (2018).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Garcia-Villalba, R., et al. Alternative method for gas chromatography-mass spectrometry analysis of short-chain fatty acids in faecal samples. Journal of Seperation Science. 35 (15), 1906-1913 (2012).
- Lee, C. H., et al. Frozen vs Fresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With Recurrent Clostridium difficile Infection: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (2), 142-149 (2016).
- Chen, M. -H., et al. In vitro fermentation of xylooligosaccharides produced from Miscanthus× giganteus by human fecal microbiota. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64 (1), 262-267 (2015).
- Cook, S., Sellin, J. Short chain fatty acids in health and disease. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 12 (6), 499-507 (1998).
- Rastelli, M., Knauf, C., Cani, P. D. Gut microbes and health: a focus on the mechanisms linking microbes, obesity, and related disorders. Obesity. 26 (5), 792-800 (2018).
- Zou, J., et al. Fiber-mediated nourishment of gut microbiota protects against diet-induced obesity by restoring IL-22-mediated colonic health. Cell Host & Microbe. 23 (1), e44 41-53 (2018).
- Dinan, T. G., Cryan, J. F. Gut–brain axis in 2016: Brain–gut–microbiota axis—mood, metabolism and behaviour. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 69 (2017).
