Summary
Este protocolo descreve um sistema de fermentação em lote-cultura in vitro de microbiota fecal humana, utilizando inulina (um prebiótico bem conhecido e um dos moduladores de microbiota mais amplamente estudados) para demonstrar o uso deste sistema na estimativa de efeitos de intervenções sobre a composição da microbiota fecal e atividades metabólicas.
Abstract
O papel emergente do microbioma intestinal em várias doenças humanas exige um avanço de novas ferramentas, técnicas e tecnologias. Tais melhorias são necessárias para decifrar a utilização de moduladores de microbioma para benefícios de saúde humana. No entanto, a triagem de grande escala e a otimização de moduladores para validar a modulação de microbioma e prever benefícios de saúde relacionados podem ser praticamente difíceis devido à necessidade de grande número de animais e/ou indivíduos humanos. Para este fim, os modelos in vitro ou ex vivo podem facilitar a triagem preliminar de moduladores de microbioma. Nisto, é otimizado e demonstrou um sistema de cultura de microbiota fecal ex vivo que pode ser usado para examinar os efeitos de várias intervenções de moduladores de microbioma intestinal, incluindo probióticos, prebióticos e outros ingredientes alimentares, além de nutracêuticos e drogas, sobre a diversidade e composição da microbiota intestinal humana. A inulina, um dos compostos prebióticos mais estudados e moduladores de microbioma, é utilizada como exemplo aqui para examinar seu efeito sobre a composição saudável da microbiota fecal e suas atividades metabólicas, como o pH fecal e os níveis fecais de ácidos orgânicos incluindo lactato e ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs). O protocolo pode ser útil para estudos que visem estimar os efeitos de diferentes intervenções de moduladores nos perfis de microbiota fecal e prever seus impactos na saúde.
Introduction
A microbiota humana é uma comunidade complexa constituída por bactérias, archaea, vírus e micróbios eucarióticos1, que habitam o corpo humano internamente e externamente. Evidências recentes estabeleceram o papel fundamental da microbiota intestinal e do microbioma intestinal (toda a coleção de micróbios e seus genes encontrados no trato gastrointestinal humano) em várias doenças humanas, incluindo obesidade, diabetes, doenças cardiovasculares e câncer1,2,3. Além disso, os microrganismos que vivem em nosso intestino produzem um amplo espectro de metabólitos que afetam significativamente a nossa saúde e também podem contribuir para a fisiopatologia de várias doenças, bem como uma variedade de funções metabólicas4, as mudanças 5. anormais (perturbações) na composição e na função desta população microbiana do intestino são denominadas geralmente como o "dysbiosis do intestino". Dysbiosis é associado geralmente com um estado insalubre do anfitrião e daqui pode ser diferenciado da comunidade microbiana (Homeostatic) normal associada com um estado saudável do controle do anfitrião. Padrões específicos de disbiose do microbioma intestinal são freqüentemente encontrados em várias doenças diferentes1,2,3,6,7.
A fermentação de alimentos não digeridos, particularmente os carboidratos/fibras fermentáveis, pela microbiota intestinal não só produz energia, mas também produz metabólitos divergentes, incluindo ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs), lactato, formate, dióxido de carbono, metano, hidrogênio e etanol6. Além disso, a microbiota intestinal também produz uma série de outras substâncias bioativas, tais como folato, biotina, trimetilamina-N-óxido, serotonina, triptofano, ácido gama-aminobutírico, dopamina, norepinefrina, acetilcolina, histamina, ácido desoxicólico e sulfato de 4-etilfenil. Isso ocorre principalmente através da utilização de fluxos metabólicos intrínsecos dentro do nicho hospedeiro-micróbe, que contribui em vários processos corporais, funções metabólicas e alterações epigenéticas1,8,9, a 10. No entanto, os efeitos de várias intervenções em tais produtos microbianos permanecem não kown ou incerto devido à falta de protocolos fáceis, eficientes e reprodutíveis. A composição da microbiota do intestino humano é um ecossistema extremamente complexo e diversificado, e, portanto, muitas perguntas sobre seu papel na saúde humana e patologia da doença ainda permanecem sem resposta. Os efeitos de muitos moduladores comuns do microbioma do intestino (por exemplo, probióticos, prebióticos, antibióticos, transplantação fecal e infecções) na composição e nas funções metabólicas da microbiota intestinal permanecem pela maior parte indescritível. Além disso, o exame e validação desses efeitos in vivo é difícil, especialmente porque a maioria dos nutrientes e metabólitos produzidos pela microbiota intestinal são absorvidos ou eliminados simultaneamente e rapidamente no intestino; por conseguinte, a medição da produção, da quantidade e do tratamento destes metabolitos (por exemplo, SCFAs) in vivo continua a ser um desafio prático. De fato, modelos fisiológicos como animais e sujeitos humanos são críticos para determinar o papel do microbioma intestinal e sua modulação na saúde do hospedeiro, mas estes podem não ser adequados para a triagem em grande escala de diferentes tipos de moduladores de microbiomas devido à restrições éticas, monetárias ou temporais. Para este fim, os modelos in vitro e/ou ex vivo, como a cultura da microbiota intestinal in vitro e depois a intervenção com diferentes moduladores de microbiota, podem oferecer oportunidades de poupança de tempo e dinheiro e, portanto, podem permitir a triagem preliminar ou em grande escala de vários componentes (como probióticos, prebióticos e outros compostos intervencionistas) para examinar/prever seus efeitos sobre a diversidade de microbiota fecal, composição e perfis metabólicos. Estudos que utilizam tais sistemas in vitro e ex vivo do microbioma intestinal podem facilitar a compreensão das interações hospedeiro-microbioma que contribuem para a saúde e doença do hospedeiro, podendo também levar a encontrar novas terapias que visam o microbioma a melhorar a saúde do hospedeiro e prevenir e tratar várias doenças1.
Embora os sistemas in vitro da cultura da microbiota do intestino não possam verdadeiramente replicar as condições intestinais reais, diversos laboratórios esforçou-se para desenvolver tais modelos, alguns de que foram encontrados praticáveis até certo ponto e foram usados com sucesso para diferentes finalidades. Um dos modelos recentes do intestino é o simulador do ecossistema microbiano intestinal humano, que imita todo o trato gastrointestinal humano, incluindo o estômago, intestino delgado, e diferentes regiões do cólon. No entanto, tais modelos tecnicamente complexos podem não ser acessíveis a outras instalações de pesquisa em todo o mundo. Portanto, ainda há uma necessidade crítica para o desenvolvimento de novos modelos alternativos que são relativamente simples, acessíveis e práticos para laboratórios que estudam os moduladores de microbioma e seus efeitos na microbiota intestinal e na saúde do hospedeiro. Assim, o uso de um sistema de cultura da microbiota fecal in vitro (ou ex vivo) seria útil para o estudo dos efeitos de tais intervenções11,12. Especificamente, o efeito de diferentes prebióticos sobre a capacidade de fermentação da microbiota em termos de mudanças periódicas na diversidade e composição da microbiota intestinal, o pH fecal e os níveis de metabólitos microbianos, incluindo SCFAs e lactato, podem ser estudados 13. nisto, usando inulina (um dos componentes prebióticos mais estudados) como exemplo do modulador de microbioma, é descrito um protocolo passo a passo deste sistema simples de cultura de lotes ex vivo de microbiota para demonstrar seu uso para estimar a alterações na microbiota fecal e metabólitos microbianos após a intervenção com os moduladores de microbioma.
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Protocol
Cuidado: consulte as fichas de dados de segurança do material apropriadas e siga as instruções e diretrizes para o treinamento adequado de nível 2 de biosseguridade (BSL-2). Siga todas as etapas de cultivo de acordo com as regras padrão de biossegurança e use um gabinete BSL-2 usando condições assépticas. Além disso, amostras fecais de diferentes modelos e indivíduos humanos podem apresentar risco potencial de disseminação de doenças transmitidas por microrganismos. Procure imediatamente ajuda médica na ocorrência de qualquer lesão e infecção. Além disso, o uso de amostras de fezes humanas e animais deve ser aprovado através de comitês éticos institucionais e deve ser compatível com protocolos de uso de amostras e informações sobre o assunto.
1. preparação dos meios de cultura
-
Preparação dos meios de cultura, preparar nove tipos de soluções de ações
- Solução A (1.000 mL): dissolver 5,4 g de cloreto de sódio (NaCl), 2,7 g de dihidrogênio fosfato de potássio (KH2po4), 0,16 g de cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2· 2h2O), 0,12 g de cloreto de magnésio hexahidratado (MgCl2 · 6h2o), 0, 6 g de cloreto de manganês tetrahydrate (MNCL2· 4h2O), 0, 6 g de cloreto de sulfatodecobalto hexahidratado (cocl2· 6h2o) e 5,4 g de sulfato de amônio (NH4)2so4, em água desionizada para fazer volume total de 1.000 mL.
- Solução B (1.000 mL): dissolver 2,7 g de fosfato de hidrogênio de potássio (K2HPO4) em água desionizada para fazer volume total de 1000 mL.
- Solução mineral de traço (1.000 mL): dissolver 500 mg de etilenodiamina-tetraacetato dihidratado (na2EDTA), 200 mg de sulfato ferroso heptahidrato (FeSO4· 7h2O), 10 mg de sulfato de zinco heptahidrato (znso4 • 7H2o), 3 mg de cloreto de manganês (II) tetrahidratado (MNCL2· 4h2o), 30 mg de ácido fosfórico (H3PO4), 20 mg de cocl2· 6h2o, 1 mg de cloreto de cóprico di-hidratado (CL2 • 2H2o), 2 mg de cloreto de níquel (II) hexahidrato (nicl2· 6h2o) e 3 mg de molibdato de sódio dihidratado (na2Moo4· 2h2o) em água desionizada para fazer volume total para 1.000 ml.
Nota: Esta solução é sensível à luz, portanto, garantir a ser armazenado em escuro/preto ou alumínio envolto tubos/garrafas. - Solução de vitamina solúvel em água (1.000 mL): dissolver 100 mg de cloridrato de tiamina (Thiamin-HCl), 100 mg de ácido D-pantotênico, 100 mg de niacina, 100 mg de piridoxina, 5 mg de ácido P-aminobenzoico e 0,25 mg de vitamina B12 em água desionizada para fazer volume total para 1.000 mL.
- Folato: solução de biotina (1.000 mL): dissolver 10 mg de ácido fólico, 2 mg de D-biotina e 100 mg de bicarbonato de amônio (NH4HCO3) em água desionizada para fazer volume total de 1.000 ml.
- Solução de riboflavina (1.000 mL): dissolver 10 mg de riboflavina em 5 mM HEPES (1,19 g/L) solução para fazer volume total de 1.000 mL.
- Solução de hemina (10 mL): dissolver 5.000 mg de hemina em solução de hidróxido de sódio a 10 mM (NaOH) (0,4 g/L) para tornar o volume total de 10 mL.
- Mistura de ácidos graxos de cadeia curta (10 ml): combine 2,5 ml de N-valerato, 2,5 ml de isovalerato, 2,5 ml de isobutirato e 2,5 ml: DL-α-metilbutirato.
Nota: Esta solução é recomendada usar-se na capa das emanações para evitar o cheiro e os fumos. - Resazurin (1.000 mL): dissolver 1 g de resazurina em água desionizada e fazer volume total para 1.000 mL.
-
Meio utilizado para fermentação anaeróbia in vitro
- Para preparar esta mídia, misture 330 mL de solução A, 330 mL de solução B, 10 mL de solução mineral de traço, 20 mL de solução de vitamina solúvel em água, 5 mL de folato: solução de biotina, 5 mL de solução de riboflavina; 2,5 mL de solução de Hemin, 0,4 mL de mistura de ácidos graxos de cadeia curta, 1 mL de resazurin, 0,5 g de extrato de levedura, 4 g de carbonato de sódio (na2co3), 0,5 g de cisteína HCL-H2O e 0,5 g de Trypticase, e adicionar 296,1 ml de água destilada.
- Verifique o pH e certifique-se que é em torno de 7,0, se não, ajustar o pH com 1 N HCl ou 1 N NaOH. Esterilizar por vácuo filtrando a mídia usando um filtro de garrafa a estação de trabalho asséptica.
- Alternativamente, misture todos os componentes (excepto as soluções da vitamina e do hemina) e autoclave em 121 ° c por 20 minutos e deixe-o refrigerar para baixo à temperatura ambiente. Simultaneamente, filtrar-esterilizar as soluções de vitamina e hemina usando filtros de membrana de 0,22 μm e adicioná-los à mídia autoclavada e arrefecida antes de dispensar.
2. preparação da câmara anaeróbia e material requerido
- Manter todos os materiais, soluções e ferramentas necessárias para o experimento de fermentação dentro da câmara anaeróbia pelo menos 48 h antes do início do experimento, para garantir que qualquer oxigênio residual associado a ferramentas e oxigênio solúvel em buffers/soluções seja removido e todos os materiais são aclimatizados às condições anaeróbias ajustadas.
Nota: Materiais necessários dentro da câmara anaeróbia (48 h antes do experimento para começar): (i) meios de fermentação; II) solução anaeróbia (preparada de acordo com a secção 4,1), (III) vortexer, (IV) balança de pesagem, (v) panos de queijo de musselina, (vi) tesoura, (VII) funil, (VIII) 1,5, 2,0, 15, 50 mL tubos, (IX) pipetador (2, 20, 200 e 1.000 μL) e pontas de Pipet compatíveis, (x) pistola Pipet e pipetas (5 e 10 mL), (XI) tecidos de papel, (XII) marcadores, (XIII) tubo de stands para diferentes tubos, (XIV) caixa de resíduos, (XV) O2 indicador e (xvi) 70% spray de etanol garrafa (desinfetante).
3. preparação de tubos e fibras
- Peso 300 mg de inulina e transferência para um tubo de 50 mL seguido pela adição asséptica de 26 mL de meios de fermentação já preparados e armazenados na câmara anaeróbia. Prepare um tubo em branco para cada tipo de amostra fecal e tubo (s) experimental (de acordo com o número de compostos que estão sendo testados), em triplicado.
- Deixe estes tubos dentro da câmara anaeróbia por cerca de 24 h para permitir a hidratação das amostras antes de iniciar o experimento de fermentação. Assegure-se de que a temperatura do tubo seja 37 ° c no momento da inoculação, portanto, traga os tubos na incubadora dentro da câmara anaeróbia.
4. preparação do Ininoculto
- Solução de diluição anaeróbia (pelo menos 48 h antes do experimento de fermentação): dissolver 5 g de NaCl, 2 g de glicose e 0,3 g de cisteína-HCl em água desionizada e fazer volume total para 1.000 mL. Autoclave e armazená-lo dentro da câmara anaeróbia pelo menos 48 h antes do uso.
- Preparo do inônio fecal (no dia do experimento de fermentação): pesar 5 g de amostra fecal fresca em um tubo cônico de 50 mL, adicionar solução de diluição anaeróbia para um volume final de 50 mL (1:10 w/v) e Vortex por 15 min ou até completamente homogeneizado. Filtre a mistura homogeneizada através de 4 camadas de gaze estéril (autoclavada) e use-a imediatamente para inoculação nos tubos contendo meios de comunicação.
Nota: As amostras fecais de um grupo de indivíduos podem ser agrupadas se o objetivo experimental é comparar o efeito de um determinado composto/ingrediente em geral saudável versus microbiota fecal doente em General.
5. fermentação e amostragem
- Prepare os tubos de acordo com a seção 4,2 e inocule os tubos em branco/controle e experimentais com 4 mL de inocular fecal diluído e filtrado. Incubar os tubos inoculados a 37 ° c dentro da câmara anaeróbia. Agitar os tubos uma vez a cada hora, invertendo suavemente para re-suspender as fibras e inum.
- Colete amostras com a frequência necessária, por exemplo, por hora para 0, 3, 6, 9 e 24 h durante a fermentação, tomando uma amostra de alíquota de 2 mL para fora em um tubo de 2 mL a partir dos respectivos tubos fermentantes.
- Medir o pH das alíquotas utilizando um medidor de pH laboratorial (inserindo diretamente o eletrodo de pH na amostra); Centrifugue a amostra restante a 14.000 x g durante 10 min a 4 ° c. Congele imediatamente o sobrenadante e a pelota no nitrogênio líquido, e após a congelação da pressão, armazene o sobrenadante para a análise de scfas e a pelota para a análise do microbioma em-80 ° c.
6. ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs) e quantificação de lactato
Nota: Os scfas e o lactato no sobrenadante da cultura do microbioma podem ser medidos exatamente de acordo com os métodos detalhados em outros lugares13,14,15,16.
- Momentaneamente, descongele os sobrenadantes congelados da pressão obtidos na seção 5 das amostras do controle e do tratamento no gelo e realizam todas as etapas processando mais adicionais no gelo. Filtre o sobrenadante através de um filtro de membrana de 0,45 μm e use as amostras sem células para medir as concentrações de SCFAs e lactato usando o sistema de HPLC com detector DAD a 210 nm, equipado com uma coluna HPX-87H. Use injetar volume de 10 μL para cada amostra e use H2so4 (0, 5 N) para eluir a coluna a uma taxa de fluxo de 0,6 ml/min a 35 ° c.
7. análise de Microbiome fecal
Nota: Realizar análise de microbioma seguindo os métodos e pipeline detalhados em outro lugar7,13,14,17.
- Momentaneamente, extraia o ADN genomic de aproximadamente 200 mgs de pelotas fecais da pasta usando um jogo fecal da extração do ADN13.
- Amplificar a região hipervariável do gene de rRNA bacteriano 16S usando os primers de código de barras de acordo com o método descrito em outros13, usando as sequências de primer como descrito no protocolo de projeto de Microbiome da terra18.
- Purificar os amplicões resultantes com grânulos de purificação magnética e quantificar por picogreen ou um método equivalente. Pool os produtos purificados do PCR na concentração e na seqüência iguais do molar em um Sequencer13.
- Processe as sequências resultantes para a de-multiplexação, filtragem de qualidade e agrupamento, atribuição taxonômica e rarefação, e análises a jusante usando o software de insights quantitativos em ecologia microbiana (QIIME) de acordo com os métodos descritos por Caporaso et al.19.
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Representative Results
O protocolo é utilizado para demonstrar o efeito de um prebiótico específico (i.e., inulina sobre a composição da microbiota e atividades metabólicas em termos de alterações no pH fecal e a concentração de lactato e SCFAs nas fezes de indivíduos saudáveis humanos ao longo diferentes pontos de tempo após o tratamento com inulina). O pH fecal, os níveis fecais de lactato e SCFAs (Figura 1) e a composição da microbiota (figura2 e Figura 3) são medidos em 0 (linha de base), 9 e 24 h de incubação com ou sem inulina. Os resultados demonstram como a composição da microbiota fecal e suas atividades metabólicas são moduladas durante a fermentação in vitro com ou sem tratamento de inulina.
Figura 1: alterações no pH fecal (a), lactato (b) e ácidos graxos de cadeia curta viz. acetato (c), propionato (d) e butirato (e) em fezes humanas em 0 (basal), 9 e 24 h de fermentação anaeróbia com ou sem inulina. Os valores aqui apresentados são média ± SEM de amostras de triplicado. * P < 0, 5, * *p < 0, 1, ** * p < 0, 1, vs. linha de base. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: alterações na diversidade e composição da microbiota em fezes humanas a 0 (basal), 9 e 24 h de fermentação anaeróbia com ou sem inulina. (a) ponderada e (b) medidas unifrac não ponderadas de beta-diversidade visualizadas utilizando a análise de coordenadas de princípio (pcoa). (c-f) Índices de diversidade alfa-diversidade filogenética (PD árvore inteira (c); riqueza de espécies (Chao1; d); número observado de unidades taxonômicas operacionais (OTUs, e); e a regularidade das espécies (índice de Shannon, f)). Abundância relativa de filos principal (g) e gêneros (h). Os valores aqui apresentados são média ± SEM de amostras de triplicado. * P < 0, 5, * *p < 0, 1, vs. linha de base. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: análise discriminante linear (Lda) do tamanho do efeito (LEfSe) de alterações da microbiota intestinal após 9 h e 24 h de incubação com (Inu) ou sem inulina (CTL). Cladograma taxonômico derivado da análise de LEfSe de sequências 16S (abundância relativa ≥ 0,5%) representando os táxons diferencialmente abundantes entre diferentes grupos de amostras. O brilho de cada ponto é proporcional ao seu tamanho de efeito (ou seja, a abundância de táxon). São mostrados aqui apenas os táxons que passam o valor limiar LDA de > 2,4. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O modelo de fermentação fecal in vitro aqui apresentado é um modelo simples de lote único para aproximar os efeitos de diferentes substratos e cepas microbianas (por exemplo, prebióticos e probióticos) sobre a composição da microbiota fecal humana, bem como sua atividades metabólicas em termos de pH fecal e níveis de SCFAs. Os resultados aqui apresentados demonstram que a inoculação da inulina diminui o pH fecal e aumenta significativamente os níveis de SCFAs e lactato em espécimes fecais tratados com inulina em comparação à cultura de microbiota fecal não tratada (Figura 1). Além disso, a assinatura da microbiota intestinal também parece ser diferente entre as amostras tratadas com inulina e não tratada (Figura 2 e Figura 3). Esses dados exemplificam como esse sistema pode refletir os efeitos da inulina sobre a diversidade e composição fecal de microbioma, bem como suas atividades metabólicas. Além disso, dependendo de objetivos experimentais específicos e hipóteses, uma variedade de outros fatores também pode ser medido usando este sistema. Além disso, além do sequenciamento do gene 16S rRNA, outras análises, como sequenciamento de metagenoma microbiano inteiro (usando sequenciador do genoma inteiro) ou qPCR e métodos de cultura direcionados a gêneros, espécies e cepas específicas ou múltiplas (por exemplo, bifidobacteria, lactobacilos, Akkermansia, enterobacteriacaea, Clostridia, etc.) também pode ser executado. Além disso, diferentes procedimentos cromatográficos para a análise de SCFAs, como LC-MS, GC, GC-MS, GC-FID e HPLC, também podem ser explorados com base na exigência e disponibilidade experimentais. No entanto, deve-se notar que a preparação da amostra para esses procedimentos pode variar de acordo com os instrumentos e condições necessários para a operação20.
Embora o uso do espécime fecal fresco produziria os melhores resultados reprodutíveis; Entretanto, a amostra fecal congelada da pressão (como usada na experimentação apresentada nisto) pode igualmente ser usada eficazmente porque a maioria das bactérias pode ser revivida dele uma vez ressuscitada à temperatura de corpo e não mais decomposição acontece após o congelamento21. O uso de amostra congelada pode ser particularmente vantajoso quando é impossível obter amostras fecais frescas de doadores específicos no dia planejado do experimento, ou do mesmo doador quando um experimento precisa ser replicado. Deve-se notar, no entanto, que as amostras fecais devem ser encaixadas congeladas usando nitrogênio líquido e imediatamente armazenadas em-80 ° c até o uso posterior. Além disso, para evitar a exposição das amostras fecais congeladas ao ar (oxigênio), as amostras devem ser transferidas para a câmara anaeróbia o mais rapidamente possível/imediatamente após a saída do congelador e usadas de imediato (o descongelamento repetido deve ser evitado). Todos os experimentos subsequentes, incluindo descongelar amostras, preparo de inônio e processamento, devem ser feitos dentro da câmara anaeróbia.
O ambiente orgânico intestinal e o pH durante a fermentação nutritiva nas grandes entranhas são muito importantes particularmente tendo em vista o fato de que um pH anormalmente reduzido indica aumento da acidez devido à utilização do substrato. Assim, a redução mais rápida do pH pode corresponder à utilização de substrato mais rápida22. Embora, neste modelo, o pH não tenha sido controlado, no entanto, a inclusão de controle não-tratado idêntico é altamente recomendável para fazer comparações diretas. Os SCFAs produzidos no cólon como resultado da fermentação de polissacarídeos indigestíveis pela microbiota intestinal podem influenciar ainda mais os diversos mecanismos relacionados à manutenção da saúde do hospedeiro. Estes metabolitos contribuem para a biossíntese de gluconeogênese e lipídios, atuam como fonte de energia para os colonócitos e também podem ter benefícios para a saúde, incluindo modulação imune, funções de barreira intestinal controladas/melhoradas e neuromodulação23, 24,25,26. Além disso, os SCFAs também são conhecidos por influenciar várias vias biológicas, incluindo hormônios, sistema endocanabinoide, proliferação de células e morte, saúde óssea, absorção mineral, motilidade intestinal, pH do intestino e efeitos invernos no microbioma e função metabólica microbiana. Portanto, o conhecimento do perfil e das concentrações de SCFAs intestinais/fecais pode ser um componente importante ao avaliar a eficácia de moduladores específicos da microbiota6. Naturalmente, além de scfas, o microbioma do intestino igualmente produz muitos outros metabolitos importantes (por exemplo, amónio, vitaminas, histamina). Assim, os espécimes sobrenadantes coletados durante tais experimentos de fermentação in vitro também podem ser avaliados para análises de Metabolômica globais para descobrir novos metabólitos derivados do intestino microbioma que podem ser influenciados por moduladores específicos de microbioma.
O sistema descrito aqui tem muitas vantagens, como a facilidade, simplicidade, rentabilidade e a adoção geral da set-up experimental. No entanto, há algumas limitações também. Por exemplo, o sistema não se refere à interação de prebióticos (ou outras intervenções utilizadas) no sistema digestivo superior (por exemplo, saliva, estômago, intestino delgado) antes de serem expostos à microbiota do intestino grosso. No entanto, tais medidas podem ser adotadas e incorporadas de acordo com os requisitos experimentais específicos. Além disso, pode ser necessário realizar um processo de hidrólise ácida e/ou enzimática antes da fermentação, se utilizar substratos específicos, incluindo alimentos inteiros ou alimentos digestíveis, porque apenas a parte indigestível de tais alimentos atinge os dois pontos a serem fermentados pelo menor microbiota intestinal. Além disso, a composição da microbiota intestinal pode deslocar-se devido a condições específicas de cultivo durante a fermentação. Por exemplo, observou-se que até 9 h de incubação, as alterações microbiota são muito mais perto do normal do que em 24 h. No entanto, após 24 h de incubação, embora os níveis de pH e SCFAs aumentem substancialmente, a composição da microbiota intestinal mostrou que as contagens de Proteobacteria aumentaram enquanto a diversidade microbiana reduziu. Entretanto, permanece desconhecido como precisamente e pròxima o acúmulo aumentado de Metabolites microbiano acompanhado com o pH fecal abaixado é associado com as assinaturas específicas da microbiota.
Em resumo, um protocolo simples para simular o ecossistema de microbiota ex vivo é descrito neste documento. O sistema permite que os pesquisadores testem diferentes intervenções para a modulação da diversidade da microbiota, composição e função metabólica que podem influenciar diversas características da saúde intestinal e geral do hospedeiro.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem com gratidão o apoio ao financiamento do centro de diabetes, obesidade e metabolismo e o centro de ciência clínica e translacional, a escola de medicina Wake Forest, o departamento de financiamento da defesa (número Grant: W81XWH-18-1-0118), a cadeira Kermit Glenn Phillips II em medicina cardiovascular; os institutos nacionais de saúde financiaram Claude D. Pepper mais velhos americanos centro (financiado por P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 e o centro de ciência clínica e translacional (unidade de pesquisa clínica, financiado por UL1TR001420), também é reconhecido felizmente. Agradecemos também aos voluntários por fornecer amostras fecais, e nossos outros membros do laboratório por suas ajudas técnicas durante este experimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 217255 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | TGI | C2388 | Toxic |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Irritating |
| Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) | Acros organics | 2063450000 | Toxic, Irritating |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C121800 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| D-Pantothenic acid | Alfa Aesar | A16609 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) | Biorad | 1610729 | |
| DL-α-methylbutyrate | Sigma-Aldrich | W271918 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | F8263 | Toxic |
| Folic acid | Alfa Aesar | J62937 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
| Hepes | Alfa Aesar | A14777 | |
| Isobutyrate | Alfa Aesar | L04038 | |
| Isovalerate | Alfa Aesar | A18642 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Niacin (Nicotinic acid) | Sigma-Aldrich | N4126 | |
| Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) | Alfa Aesar | A14366 | Toxic |
| N-valerate | Sigma-Aldrich | 240370 | |
| P-aminobenzoic acid | MP China | 102569 | Toxic, Irritating |
| Phosphoric Acid (H3PO4) | Sigma-Aldrich | P5811 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
| Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1551128 | |
| Pyridoxine | Alfa Aesar | A12041 | |
| Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Riboflavin | Alfa Aesar | A11764 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | 1613757 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher BioReagents | 7647-14-5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Chemicals | S320 | |
| Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) | Acros organics | 206375000 | |
| Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) | Acros organics | 148991000 | |
| Trypticase | BD Biosciences | 211921 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
| Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| 0.22 µm membrane filter | |||
| AMPure magnetic purification beads | Agencourt | ||
| Anaerobic chamber with incubatore | Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA | ||
| Bottle filter | Corning | ||
| Cheesecloth | |||
| Illumina MiSeq sequencer | Miseq reagent kit v3 | ||
| pH meter | |||
| Qiagen PowerFecal kit | Qiagen | ||
| Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software | |||
| Qubit-3 fluorimeter | InVitrogen | ||
| Vortex | Thermoscientific | ||
| Waters-2695 Alliance HPLC system | Waters Corporation |
References
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