Summary
ここで提示される、色素希釈を用いた抗原タンパク質またはペプチドに応答して増殖CD4+T細胞を測定するためのプロトコルである。このアッセイは、特に希少な抗原特異的T細胞に対して感受性があり、抗原特異的細胞のクローニングを容易にするために改変することができる。
Abstract
記載されているのは、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)における抗原特異的CD4+T細胞増殖を測定するための簡便な、インビトロ、色素希釈ベースの方法である。カルボキシフルオレセイン・スクハニミジルエステル(CFSE)のような安定した、非毒性の蛍光色素の開発は、フローサイトメトリーによって検出されるような蛍光染色における減少によって、まれな抗原特異的T細胞を傍観者と区別することを可能にする。この方法は、代替アプローチに対して次の利点があります:(i)低周波T細胞に対して非常に敏感であり、(ii)抗原またはエピトープの知識が必要とされない、(iii)応答細胞の表現型を分析することができ、(iv)生存可能な応答セルを並べ替え、T セルのクローニングなどのさらなる分析に使用できます。
Introduction
抗原特異的T細胞を検出し、研究する能力は、細胞媒介性免疫の研究において重要である。しかし、これを行うことは、非常に弱く、検出が困難な自己抗原特異的CD4+T細胞応答のために特に困難です。抗原特異的リンパ球増殖の検出に使用される一般的な方法は[3H]-チミジンであり、これは増殖細胞のDNAに組み込まれた放射性標識ヌクレオチドである。[3H]-チミジンアッセイはDNA合成を検出できますが、この方法は細胞分裂の間接的な尺度であり、DNA合成は、遺伝子の複製およびアポトーシス1の間に独立して開始することができるので、細胞分裂の間接的な尺度である。この問題は、細胞の抗原特異的増殖がかなりのアポトーシス2をもたらす可能性があるという事実によって悪化し、抗原特異的増殖の潜在的な過大評価につながる。さらに、[3H]-チミジン法は、抗原ペプチドで刺激されたPBMCにおけるCD4+またはCD8+系統増殖などの増殖リンパ球に対する表現型情報を提供しない。
2003年には、CFSEを用いて初めての染料希釈アッセイを発表し、CFSEベースの増殖アッセイ3、4と呼ばれる。CFSEは、細胞内リジン残渣に対する共生結合を形成することにより、細胞内タンパク質に安定的に結合する蛍光色素です。CFSE標識タンパク質は娘細胞3の間で均等に分かれているので、分裂した細胞はフローサイトメトリーによって未分裂細胞と区別することができ、これはリンパ球集団の定量的表現型を可能にする。確かに、細胞がCFSE染色の時から受けた分裂の数は、ある程度5まで測定することができる。最近では、CellTraceバイオレット増殖色素(VPD)やCytoTrack色素などの多くの同様の染料が開発されており、同様の方法で動作します6。このプロトコルはCFSEに焦点を当てていますが、原理は他の関連染料にも同様に適用されます。
ペプチド-MHCテトラマー染色は、抗原特異的CD8+T細胞を検出およびクローニングするための広く使用されている方法である。これは、確立された方法7、8、9、10です。しかし、テトラマーベースのクローニングは、エピトープ/MHC制限の既存の知識を必要とし、各エピトープは、新規エピトープ特異的T細胞の発見およびクローニングの範囲を制限する独自のテトラマー11を必要とします。CFSEベースの増殖は、ペプチド、タンパク質、または細胞のライサットと使用することができます。ここに記載されるプロトコルは、シンプルかつ堅牢であり、応答CD4+T細胞は、下流の機能性および生化学的特徴付けアッセイ12、13で使用するためにソートすることができる。
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Protocol
すべての被験者は、末梢血の採取前にインフォームド・コンセントを与えた。PBMCを用いた実験の倫理的承認は、セントビンセントのホスプティアル(HREC-A 135/08、HREC-A 161/15)によって与えられた。
1. 試薬の調製
-
ヒトT細胞培養
- RPMI 1640、1x非必須アミノ酸、L-アラニル-L-グルタミンジペプチド(2mM)、ペニシリン(100U/mL)/ストレプトマイシン(0.1mg/mL)、および5%プールヒト血清(PHS)から成るPBMCを培養するためのRP-5培地を調製する。
-
CFSEストックソリューション
- DMSOの約9mLで25mgのCFSEを溶解してマスターストックを準備し、5mMの濃度で最終ストック溶液を達成します。
- PBSのマスターストックを希釈して作業ストックを準備し、10 μMの作業濃度を達成します。
2. 全血からのヒトPBMCの調製
- ヒト末梢血の0.5〜1.5 x 106 PBMC/mLの間に一般的です。したがって、必要な血液量は、PBMCの所望の数に依存し、PBSを用いてヒト末梢血を少なくとも1:2で希釈する。50 mLチューブに密度勾配媒体の15 mLを追加してPBMCを分離し、希釈された全血の35 mLをオーバーレイします。
- 室温(RT)で減速することなく15分間850 x gで遠心分離機。これは、赤血球ペレットを含む底層、その上部インターフェースを裏打ちする白血球を有する密度勾配媒体の中間層、およびトップ血漿層14の3つの明確な層をもたらす。
- 最上のプラズマ層の約20mLを取り除きます。赤血球ペレットを避けるために注意して、白血球層を収集します。PBSで3倍を洗浄し、血球計でトリパンブルーの除外を使用して生存細胞を数えます。PBS で 1 x 106 PBMC/mL に希釈します。
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非CFSE染色細胞
- これらの細胞は、無染色およびCD4+単一染色細胞を含むフローサイトメトリーの補償制御として使用される。各制御サンプルPBMCサスペンションの300 μLを10 mLチューブに追加し、PBSを搭載したトップ、およびRTで5分間550 x gの遠心分離機を追加します。
- RP-5メディアで1 x 106セル/mLを再中断します。これらの標識されていない細胞をCFSE標識細胞で37°C/5%CO2インキュベーターで7日間インキュベートします(ステップ2.6.1)。
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CFSE染色細胞
- ステップ 2.3 から 50 mL チューブにセルを移します。チューブの側面に1mLのセル懸濁液あたり1.0 μLのCFSEワーキングストックソリューション(10 μM)を追加します。チューブを数回反転して素早く混ぜます。CFSEの最終濃度は10nMです。
- 37 °C/5% CO2インキュベーターで 5 分間インキュベートします。染色を停止するには、RP-5培体の5 mLを追加し、550 x gで5分間遠心分離することにより細胞をペレットする。RP-5 メディアの 1 x 106/mL で PBMC を再中断します。
- 10 mLチューブに1.0 mLのセルサスペンションを追加します。テストする各抗原に 1 つのチューブを使用します。
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ヒトPBMCおよび細胞培養の抗原刺激
- 37°C/5%CO2インキュベーターで7日間RP-5培中の抗原を用いたヒトCFSE標識PBMCを培養した。希釈抗原を含むRP-5培地の100μL/ウェルを有する96ウェルプレート中の培養1x 105細胞/ウェル(100μL)。
注:作業濃度を含む使用される抗原は、表1に要約されています。
- 37°C/5%CO2インキュベーターで7日間RP-5培中の抗原を用いたヒトCFSE標識PBMCを培養した。希釈抗原を含むRP-5培地の100μL/ウェルを有する96ウェルプレート中の培養1x 105細胞/ウェル(100μL)。
3. FACS分析用アンチCD4染色
- 培養細胞のピペット200μLをFACSチューブに、0.1%FCSを含むPBSの1.0mLで細胞を1x洗浄し、550xgで5分間遠心分離機を洗浄する。
- PBS/0.1%FCSの100 μLで抗ヒトCD4アレクサフルー647(0.25 mg/mL)で汚れ。他の蛍色素に染色されていないCFSE標識細胞のサンプルは脇に置き、FACS CFSE補正の設定に使用してください。光から保護された4°Cで細胞を20分間インキュベートします。
- PBS/0.1%FCSの1 mLを加え、RTで5分間550xgの遠心分離機を加え、100 μLのPBS/0.1%FCSで再懸濁して細胞を洗浄する。FACS分析の直前に、すべてのチューブにヨウ化プロピジウム(PI、0.1 mg/mL)の1 μLを加え、死んだ細胞をフローサイトメトリーで排除できるようにします。
4. フローサイトメトリック構成とゲーティング戦略
注:図 1は、報酬制御とゲーティング戦略を含む FACS 構成を示しています。
- 前方散乱(FSC)対側散乱(SSC)(図1A)集団をゲートして、すべてのリンパ球を含む。
- Pi陰性細胞のFSCとPI(図1B)の集団をゲートして、アポトーシス細胞を除外する。
- 無染色細胞を使用して、非蛍光細胞の電圧ベースラインを設定します。CD4-A647およびCFSEの電圧を設定して、蛍光信号がそれぞれ1,000以下に設定します(図1C)。単一色制御CFSE(図1D)とCD4-A647(図1E)を使用して、染色されていないセルで設定された電圧を使用して、各色の正の蛍光信号(約10,000)を確認します。
- CFSE と PI にはスペクトルの重なりがあります。CFSEのみのサンプルがPIチャネルで信号を得なくなるまで、CFSE蛍風からPI蛍を減算する補正を調整します。
注:これらのゲートは、ここで分析されたすべてのサンプルに適用した。
5. 抗原特異的CD4+T細胞増殖を列挙するための細胞分裂指数の計算
注:細胞分裂指数(CDI)は、5,000個の未分割細胞当たりの分割細胞数(CD4+/CFSE明るい)を指す。分割されていないCD4+細胞の数が正確に5,000ではない場合、分割された細胞の数は、5,000個の未分割細胞あたりの分割細胞数を表すために補正される。例えば、破傷風トキソイド特異的増殖(図2D)を用いて、4,930個の未分割細胞(CFSE明るい)と3,268個の分割細胞(CFSE dim)があった。したがって、分割されたセルの補正数は (5,000/4,930) x 3,268 = 3,304.3 です。
- 抗原を含まない細胞から分断された細胞の数/5,000の未分割細胞の数を、抗原を含まない細胞から分断された細胞の平均数(5,000非分割細胞当たり)で割って計算する(表2)。
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Representative Results
破傷風トキソイドタンパク質を用いたヒトPBMCのインビトロ刺激:PBMCをCFSEで染色し、破傷風トキソイドの存在下で7日間刺激した。ほとんどすべてのドナーは、彼らがワクチン接種されたので、破傷風トキソイドに強いT細胞応答を示した, 破傷風トキソイドは有用な陽性対照抗原になります.図2は、非刺激PBMCからのCD4+T細胞のCFSE増殖が最小限であったことを三文で示す(~12 CFSE薄暗い細胞;図 2A,B,C)破傷風トキソイド(>3,000 CFSE薄暗い細胞)に応答してCD4+T細胞の顕著な増殖があった。図 2D,E,F)
抗原ペプチドを用いたヒトPBMCのインビトロ刺激:PBMCをCFSEで染色し、ヒトプロインスリンC-ペプチドの存在下で7日間刺激した。図3は、1型糖尿病を有する個体の末梢血中のプロインスリンC-ペプチド特異的CD4+T細胞の検出を示す。健康なドナーのPBMCでは増殖は認められなかった(データは示さない)。図4では、インフルエンザA型ウイルス(H1N1 PR8)マトリックスタンパク質で刺激されたPBMCは増殖を示した。しかし、このドナーに対する破傷風特異的応答は比較的弱く、反応は一般的にドナー間で変動する。
これらの結果を組み合わせることで、アッセイは全長タンパク質および短い合成ペプチドを用いて行うことができることを示している。
図1:CD4+T細胞のCFSEベース増殖に対する補償制御およびゲーティング戦略。インビトロ細胞培養の7日後に非刺激されたPBMC。リンパ球(A)はヨウ化プロピジウムで染色し、ヨウ化プロピジウム陰性細胞をゲート化して死細胞(B)を除外した。FACS補償制御には、未染色細胞(C)、CFSE単独染色細胞(D)、CD4単独染色細胞(E)が含まれていた。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:CFSE染色破傷風特異的CD4+T細胞の増殖。PBMCは、145 ng/mL(166 LfU/mL)破傷風トキソイドの存在下でCFSE染色および培養を行った。細胞をCD4で染色した。CFSE希釈は、抗原(A-C)なしで、破傷風トキソイドタンパク質(D-F)に応答して示される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:プロインスリンCペプチドに応答してCFSE染色ヒトCD4+T細胞の増殖。CFSE染色されたPBMCを10μMプロインスリンC-ペプチドの存在下で7日間培養した。細胞をCD4で染色した。CFSE希釈は、1型糖尿病を有するドナーからのPBMCを用いて示される。非刺激型PBMC(A)におけるCFSE希釈は、破傷風トキソイドタンパク質刺激(B)、およびヒトプロインスリンC-ペプチド刺激PBMC(C)である。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:インフルエンザA型ウイルス(H1N1 PR8)マトリックスタンパク質1に応答したCFSE染色ヒトCD4+T細胞の増殖。PBMCを0.08 μg/mLインフルエンザAウイルスマトリックスタンパク質1の存在下で7日間CFSE染色し培養し培養した。細胞をCD4で染色した。CFSE希釈は、非刺激細胞(A)、破傷風トキソイド刺激細胞(B)、およびインフルエンザAウイルスマトリックスタンパク質刺激細胞(C)について示されている。 この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 抗原 | 作業集中 |
| 破傷風トキソイドタンパク質 | 145 ng/mL |
| インフルエンザ A H1N1 (PR8) マトリックスタンパク質 1 | 0.08~10 μg/mL |
| プロインスリンCペプチド PI33-63 | 10 nM |
表1:破傷風特異的CD4+増殖の列挙。未刺激および破傷風刺激ヒトPBMCからの5,000の記録されたフローサイトメトリーイベントを用いたCDI計算。
| サンプル | 分割されていないセル CD4+CFSE明るい | 分割セル CD4+CFSE薄暗い | 分割セル数 CFSE薄暗い/5,000 CFSE明るい | 平均分割セル CFSE薄暗い/5,000 CFSE明るい | |
| ニル 1 | 5,004の | 11歳 | 11歳 | 12.3年 | |
| ニル 2 | 4,995の | 14歳 | 14歳 | ||
| ニル 3 | 5,006の | 12歳 | 12歳 | ||
| サンプル | 分割されていないセル CD4+CFSE明るい | 分割セル CD4+CFSE薄暗い | 分割セル数 CFSE薄暗い/ 5000 CFSE明るい | 分割細胞のCDI数(破傷風)平均分割細胞(ニル) | 平均 CDI |
| 破傷風 1 | 4,930の | 3,258の | 3,304.3 | 268の | 263.7年 |
| 破傷風 2 | 4,928の | 3,205の | 3,251.8の | 263.7年 | |
| 破傷風 3 | 4,910の | 3,142の | 3,199.6 | 259.5年 |
表2:CD4+増殖をシミュレートするために使用される抗原。
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Discussion
CFSEベースの増殖は、抗原特異的ヒトCD4+T細胞を検出および列挙するためのシンプルで堅牢な方法です。CFSEの最適な濃度を使用することは、最適な結果4のために不可欠であることを以前に実証されています。あまりにも多くのCFSEは増殖をアブローしますが、あまりにも少なすぎると、分割された細胞と分割されていない細胞を区別することはできません。対照的に、CFSEの比較的高濃度(5.0 μM)は、精製されたマウスT細胞3を標識するために使用される。バッチ間の変動性のため、最適な濃度を決定するために各バッチを計算することをお勧めします。現在のバッチは、元のパブリケーション (200 nM)4よりもはるかに低い濃度 (10 nM) で使用します。
この方法のもう一つの重要な側面は、抗原用量の最適化である。より少ない抗原で培養されたT細胞は、より敏感であり、増強された機能を示すことができることが十分に確立されている。これはもともとHIVペプチド15の文脈で実証された。このプロトコルで使用される破傷風トキソイドの量はまた、高感度で増殖性の高いCD4+T細胞を引き出すために以前に4を最適化した。興味深いことに、過剰抗原が抗原特異的増殖を減少させることが以前に示されている15。したがって、末梢血中の希少なT細胞集団を検出して列挙するためには、抗原とCFSE濃度の両方を最適化することが最も重要である。
最初のヒト染料希釈系アッセイ4を発表して以来、同様の染料が多数開発されている。親油性色素であるPKH-26をCFSE(未発表)と比較して使用した場合、CD4+T細胞増殖は効果的に検出されなかったことがわかった。我々は、系統的に市場で他の染料をテストしていないので、彼らの相対的な強さに関するコメントはありません。しかしながら、T細胞増殖を定量するためのプロトコルは、すべての色素希釈増殖アッセイにも同様に適用可能である。
細胞分裂指数(CDI)として増殖を表現することは、応答の大きさの計算に背景増殖を組み込む。私たちの手の中では、背景は通常低いです(例えば、<15イベント/5,000 CD4+ CFSE明るい)。背景の増殖は、個人と実験によって異なります。増殖の強さを表現する比率(この場合はCDI)を使用することは、結果への影響を低減するのにいくらか有効である。メディア内のタンパク質に対するバックグラウンド応答は問題となる可能性があります。牛タンパク質はアッセイの感受性を低下させる弱いバックグラウンド応答を刺激することができるので、牛血清ではなくヒト血清を含む組織培養培養培養剤を使用することをお勧めします。軽度の感染症を持つ人々には、感染に応じて生体内でプライミングされた増殖が原因と考えられている。このような場合、ドナーが感染をクリアした後、アッセイを繰り返す必要があります。
CFSEベースの増殖アッセイは、PBMC12から直接ヒト抗原特異的CD4+T細胞を効率的にクローンするために改質することができる。例えば、このアプローチは、インスリン12に特異的なCD4+T細胞のクローンを作成するために使用されている。より最近では、プロインスリンC-ペプチド特異的CD4+T細胞のクローニングおよび機能的分析は、特に最近発症したT1D13患者において、T1Dの病因に関する顕著な洞察を提供している。
結論として、CFSEベースの増殖アッセイは、敏感で堅牢です。それは速く、技術的に簡単で、新鮮なまたは凍結保存されたPBMCを使用して行うことができる。多色FACS分析にCFSEを組み込む能力は、多くの細胞タイプを含むPBMCからの増殖T細胞の免疫フェノタイプの定量的尺度を提供し、DNA組み込みを利用したアッセイでは、この程度の詳細は不可能です。[3H]-チミジンなど。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
この研究は、若年性糖尿病研究財団[JDRF 5-CDA-2014-210-A-N](S.M.)によって支援されました。国家保健医療研究評議会(NHMRC GNT123586)、糖尿病オーストラリア研究信託ミレニアム賞(Y17M1-MANS)(S.M.)、ビクトリア州政府の運用インフラ支援プログラム(S.M.、A.D.、E.T.、M.S.)、およびNHMRC大学院奨学金APP1094337とJDRF博士トップアップ奨学金(M.S.)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
References
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