Summary
System dækkende analyse af flere biomolekyler er afgørende for at opnå funktionel og mekanistisk indsigt i biologiske processer. Herved beskrives en omfattende protokol for udvinding af lipider, metabolitter, proteiner og stivelse fra en enkelt prøve høstet fra synkroniseret Chlamydomonas-kultur.
Abstract
Mikroalger har været fokus for forskning for deres anvendelser i produktionen af høj værdi forbindelser, fødevarer og brændstof. Desuden er de værdifulde fotosyntetiske modeller lette forståelsen af de grundlæggende cellulære processer. System dækkende undersøgelser muliggør omfattende og dybtgående forståelse af organismers molekylære funktioner. Der kræves imidlertid flere uafhængige prøver og protokoller for proteomics, lipidomics-og metabolomics-undersøgelser, som indfører højere fejl og variabilitet. Her præsenteres en robust ekstraktionsmetode med høj gennemløb for samtidig ekstraktion af klorofyl, lipider, metabolitter, proteiner og stivelse fra en enkelt prøve af den grønne Alga chlamydomonas Calabaria . Den illustrerede eksperimentelle opsætning er for Chlamydomonas kulturer synkroniseret ved hjælp af 12 h/12 h lys/mørke forhold. Der blev indsamlet prøver over en 24-timers celle cyklus for at påvise, at metabolitter, lipider og stivelses data opnået ved hjælp af forskellige analytiske platforme er godt konforme. Desuden blev protein prøver indsamlet ved hjælp af samme ekstraktions protokol anvendt til at gennemføre detaljerede proteomics-analyser for at evaluere deres kvalitet og reproducerbarhed. Baseret på de data, kan det udledes, at den illustrerede metode giver en robust og reproducerbar tilgang til at fremme forståelsen af forskellige biokemiske veje og deres funktioner med større tillid til både grundlæggende og anvendt forskning.
Introduction
Mikroalger er en rig kilde til naturlige produkter (f. eks. brændstoffer, menneskers og dyrs ernæring, kosmetik og farmakologiske stoffer). Der gennemføres talrige forskningsbestræbelser for at øge effektiviteten af produktionen af produkter af høj værdi fra mikroalger1,2,3,4. System-niveau forståelse af metabolisme er en forudsætning for at forbedre kvaliteten og udbyttet af naturlige produkter5,6,7. Med fremkomsten af funktionelle genomteknikker og forbedrede massespektrometri metoder, tusindvis af gener, udskrifter, proteiner, og metabolitter kan overvåges samtidigt. Der kræves dog flere prøver til dybdegående proteomics, lipidomics og metabolomics undersøgelser, som ofte er svære at opnå i unicellulære organismer, især hvis der skal udføres tidskursus undersøgelser. Desuden introducerer indsamling og behandling af forskellige prøve aliquoter i kombination med forskellige protokoller til indsamling af de meget komplekse omik-data (dvs. proteomic, lipidomic og metabolomics) variabilitet, hvilket gør integrationen af data til en udfordrende opgave.
Chlamydomonas giver ikke kun et fremragende mikrobielt system til undersøgelse af cellulære processer, men også en bekvem model til at studere koordineringen af celle cyklus og metabolisme. Derfor er en stærk koordination af transskriptioner udtryk med celle cyklus blevet vist ved hjælp af høj opløsning transkriptom profilering af synkroniseret kultur af Chlamydomonas8. Omkring 80% af de analyserede udskrifter udstillet robust periodicitet over en 24 h celle cyklus8. Ligeledes, tør vægt, proteiner, chlorophyll, aminosyrer og fedtsyrer af to forskellige stammer af Chlamydomonas viste sig at korrelere med celledeling i en undersøgelse, hvor prøvetagning blev udført hver 4 h9. For nylig blev det rapporteret, at metabolitten og lipid dynamikken i celle skiftet baseret på specifikke faser af cellen cyklus10. De subtile ændringer i forskellige biomolekyler var mulige at overvåge ved hjælp af en robust methyltert-butylether (MTBE): methanol: vandbaseret ekstraktionsmetode, som giver et ideelt udgangspunkt for omfattende multi-omics-analyse10 , 11.
Den præsenterede protokol guider gennem en reproducerbar og effektiv strategi10, for samtidig ekstraktion af lipider, metabolitter, proteiner og stivelse fra en enkelt prøve alikvot, for den tid, der er løst metabolomic og lipidomisk undersøgelse af synkrone voksende Chlamydomonas kulturer. Ud over at illustrere de robuste og reproducerbare metaboliske og lipidomiske data10, her, er kvaliteten af de proteiske prøver opnået fra samme pellet også påvist.
Protocol
1. præ-kulturer af chlamydomonas Calabaria
- Forbered præ-kulturerne af chlamydomonas Calabaria (stamme vildtype CC-1690 MT +) ved at overføre celler fra faste plader af TAP medium til Erlenmeyer kolber med 200 ml HSM medium12.
- Udvid præ-kulturerne på en rotatory shaker ved 24 °C ved 100 μmol · m-2· s-1 kontinuerligt lys, indtil celletætheden når ~ 2 x 106 celler/ml.
2. synkronisering af Chlamydomonas flydende kulturer i fermentorer
Bemærk: de parametre, der præsenteres i denne protokol, såsom temperatur, lys og CO2, er specifikke for synkronisering af stammen CC-1690 MT +. For at udvikle en synkroniseret kultur ved hjælp af en anden stamme, er det nødvendigt at teste de optimale betingelser.
- Før kulturen overføres til et Fermenter-system (Se supplerende figur 1 for det specialfremstillede Fermenter-design), der er forbundet med en recirkulerende køler for at opretholde temperaturen, med boblende filtrerede Co2 (2%, v/v) og omrørt med en magnetisk Stir i bunden af fermenteringen med konstant agitation.
- For at initiere synkroniseringen skal du indstille fermenteringen ved lys-mørk regime på 12:12 h, under 34 °C og 200 μmoles · m-2· s-1 lys og sikre, at det indeholder 500 ml kultur i HSM medium med en celletæthed på 1 x 106 celler/ml.
- Ved udgangen af 24 h cyklus, re-fortynde kulturen til 1 x 106 celler/ml med frisk HSM medium med minimal forstyrrelse ved hjælp af et rørsystem i kombination med peristaltiske pumper, som gør det muligt at først pumpe en særskilt mængde af kultur ud og bagefter pumpe i autoklave-steriliseret medium.
Bemærk: som alternativ til peristaltiske pumper kan inokulerende sprøjter bruges til at trække kulturen tilbage, mens den påkrævede mængde frisk medium kan tilsættes direkte til fermenteringen under sterile forhold. - Gentag trin 2,3 tre gange for at få de synkroniserede kulturerpå 4- dages inokulation.
- For at validere Synchrony af celler, høst prøver med et interval på hver 2 h og målecelle tæthed og celle volumen ved hjælp af en celle tæller og størrelse analysator (Se tabel over materialer). Afhængigt af celletætheden fortyndes prøverne mellem 1:10 og 1:100 og måles i et størrelsesområde på 30 – 1900 μm3.
3. høst af Chlamydomonas-celler
- Mærk 15 mL koniske centrifugeglas, og Forbered en Dewar fyldt med flydende nitrogen.
- Høst prøverne ved hjælp af en sprøjte (50 cm3) gennem den indvendige glas slange af fermenteringen. Prøven fordeles til koniske centrifugeglas, som skal indeholde 10-15 x 106 celler. Bemærk mængden overført til hvert rør og målecelle tætheden og cellestørrelsen af hvert tidspunkt ved hjælp af celle tæller og størrelse analysator (Se tabel over materialer)
- Pellet cellerne ved centrifugering i 5 min ved 4000 x g. Derefter kassere supernatanten, fryse pellets i flydende nitrogen og senere opbevares ved-80 °C.
4. klargøring af ekstraktions buffere og ekstraktion af klorofyl, lipiderne og metabolitter
Forsigtig: methanol (MeOH) og MTBE er brændbare og kan forårsage irritation af luftvejene, øjet eller huden ved længerevarende eksponering og/eller kontakt. Håndtér dem forsigtigt i en Røghætte, og brug de relevante sikkerhedsprocedurer under ekstraktionen (laboratorie frakke, sikkerhedsbriller, handsker osv.).
-
Ekstraktions buffer 1
- I en 100 mL målekolbe tilsættes 75 mL MTBE, 25 mL MeOH (UHPLC-kvalitet) og homogeniseres (3:1, Vol/Vol).
- Tilføj følgende løsning til interne standarder: 50 μL kortikosteron (1 mg/mL i MeOH), 50 μL 1,2-diheptadecanoyl-SN-glycero-3-fosfocholin (17:0 PC) (1 mg/mL i chloroform HPLC-kvalitet), 25 μL ampicillin (1 mg/mL i vand-UHPLC-kvalitet) og 50 μL D-sorbitol-1-13C (1 mg/mL i vand UHPLC-kvalitet).
- Overføre ekstraktions bufferen til en ren glas flaske og forkøle opløsningen ved-20 °C, 1 time før brug. Brug frisklavet opløsning til ekstraktioner. Denne opløsning kan opbevares ved 4 °C i op til 2 uger.
-
Ekstraktions buffer 2
- I en 100 mL målekolbe tilsættes 75 mL vand-UHPLC-kvalitet og 25 mL MeOH UHPLC-kvalitet og homogeniseres.
- Overføre ekstraktions bufferen til en ren glas flaske. Brug frisk opløsning til ekstraktioner. Denne løsning kan opbevares ved stuetemperatur i flere uger.
5. ekstraktion af klorofyl, lipiderne og metabolitter
- Arranger rørene, med celle pellet (indeholdende 10-15 x 106 celler), i flydende nitrogen.
- Celle pellet opslæmmes i hvert rør med 1 mL forkølet (-20 °C) ekstraktions buffer 1.
Bemærk: Udfør dette trin hurtigt for at undgå fordampning af lavviskositets ekstraktions buffer. Efter tilsætning af ekstraktions buffer 1, vedligeholde rørene ved stuetemperatur. - Vortex, indtil cellerne er godt homogeniseret inden for ekstraktions blandingen og alikvot blandingen i 2 mL mikrocentrifuge glas.
- Sonicate kulturer ved hjælp af sonikering bad (Se tabel over materialer) i iskold vand i 10 min.
- Alle prøverne på en orbital shaker inkubates ved 1000 rpm i 60 min ved 4 °C.
- For at inducere faseseparationen tilsættes 650 μL ekstraktions buffer 2.
- Vortex kort efterfulgt af centrifugering ved 20000 x g i 5 min ved 4 °c.
Bemærk: efter dette trin er der en adskillelse af væskefaser og en solid pellet i bunden af røret. Håndtér rørene med omhu for at undgå blanding af de to væskefaser. Den øverste MTBE-fase indeholder lipider og klorofyl, mens den nedre fase indeholder de polære og semi-polære metabolitter. Den udfældede pellet i bunden indeholder proteiner, stivelse og andre uopløselige molekyler.
6. sådan citeres brøker
- Overfør 500 μL øvre MTBE-fase (lipider) til et mærket 1,5 mL rør. Prøverne tørres ved hjælp af en vakuum koncentrator (Se tabel over materialer) og opbevares ved-80 °c indtil måling.
- Fjern den resterende MTBE-fase ved hjælp af en 200 μL pipette.
- Overfør 650 μL af den nedre fase (polære og semi-polære metabolitter) til et nyt mærket rør. Prøverne tørres ved hjælp af en vakuum koncentrator (Se tabel over materialer) og opbevares ved-80 °c indtil måling.
- Fjern den resterende nedre fase ved at afpipettere den overskydende lydstyrke.
- Fastfryse den faste pellet i flydende nitrogen og opbevares ved-80 °C indtil yderligere ekstraktion.
7. bestemmelse af polære metabolitter (primære metabolitter)
- Resuspension af den tørrede pellet i Polar fasen (trin 6,3) i methoxyaminhydrochlorid/pyridin opløsning til methoxymization af carbonylgrupper.
- Prøverne opvarmes ved 37 °C i 90 min.
- Prøverne fremkaldes med N-methyl-N-trimethylsilyltrifloracetamid (MSTFA) i 30 min ved 37 °C som beskrevet tidligere13.
- Brug gaskromatografi koblet til Time-of-Flight massespektrometri (GC-TOF-MS) til at analysere de primære metabolitter. De anvendte graduerings parametre var i overensstemmelse med den tidligere beskrevne protokol14.
8. bestemmelse af ikke-polære metabolitter (lipiderne)
- Re-suspendere den tørrede pellet af ikke-polære fase (trin 6,1) i en blanding af acetonitril: isopropanol (7:3, v:v).
- Der centrifugeres ved 20000 x g og adskilles i en omvendt fase C8-kolonne (100 mm × 2,1 mm × 1,7 μm partikler) ved hjælp af et uplc-system (Se tabel over materialer). De to mobile faser var vand med 1% 1 M ammonium acetat, 0,1% eddikesyre (buffer A) og acetonitril: isopropanol (7:3) indeholdende 1% 1 M ammonium acetat, 0,1% eddikesyre (buffer B).
- Brug graduerings parametrene i henhold til den tidligere beskrevne protokol14.
9. bestemmelse af klorofyl indhold
- Bland 100 μL af MTBE-fasen (trin 6,1) med 900 μL 90% methanol for en metode, der er tom, samt de eksperimentelle prøver.
- Absorbansen måles ved hjælp af spektrofotometeret ved en bølgelængde på 665 nm og 652 nm for at skelne mellem klorofyl a og klorofyl b.
Bemærk: absorptionen skal variere mellem 0,1 og 1 for en gyldig koncentrations beregning. Fortynd prøverne, hvis det er nødvendigt. - Beregn klorofyl a og b indhold, og også det samlede klorofyl indhold i henhold til følgende formler.
CHLa = 16.82 a665 – 9.28 a652
CHLb = 36.92 a652 – 16.54 a665
CHLa = b = 0.28 a665 + 27.64 a652
Bemærk: formlerne blev beskrevet af bar-Nun og Ohad15.
10. ekstraktion og bestemmelse af proteinindholdet, fordøjelsen og analysen
Bemærk: for at resuspendere proteinet blev pellet urea/thiourea buffer (6 M urinstof, 2 M thioureaog proteasehæmmere og fosfatasehæmmere) anvendt med ændringer i den protokol, der tidligere var beskrevet16. Men, enhver buffer valg kan anvendes til opblanding af proteiner.
- Protein bufferen forberedes ved hjælp af følgende koncentrationer: 6 M urinstof og 2 M thiourea.
- Pellet (trin 6,5) opløses i 200 μL protein buffer (10,1).
- Prøverne inkubates ved stuetemperatur i 30 minutter efterfulgt af centrifugering ved 20000 x g i 5 min.
- Overfør supernatanten, som indeholder proteinerne, til et nyt rør.
- Bestem proteinkoncentrationen ved Bradford assay17.
- Digest 50 μg protein i opløsning med en valg protokol. Her ovre, hjælp den næste protokol.
- Reducer 50 μg protein prøver ved hjælp af 5 mM DTT i 30 min efterfulgt af alkylering med 10 mM iodoacetamid i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Tilsæt trypsin/lys-C mix ved et 25:1 protein: proteaseratio (w/w), bland og Inkuber i 3 timer ved 37 °C.
- Prøverne fortyndes seks folder med 50 mM TrisHCl (pH 8) og Inkuber natten over ved 37 °C.
- Afslut fordøjelsen ved at tilsætte trifluoroeddikesyre (TFA) til en endelig koncentration på 0,5 – 1%.
- Efter fordøjelsen, udføre afsaltningen af peptider før massespektrometri ved hjælp af C18 Stage tips og elueres de fordøjet peptider18.
- Prøverne koncentreres i nærheden af tørhed, og 2-5 μL af opløsningen efterlades i en vakuum koncentrator (Se tabel over materialer) uden opvarmning.
- Prøverne opslæmmes i indlæsnings bufferen (5% acetonitril, 0,5% myresyre), og peptidblandinger analyseres med LC-MS/MS ved hjælp af et massespektrometer med høj opløsning (Se tabel over materialer), der er forbundet med et Nano-uplc-system.
- Adskil peptiderne ved hjælp af UPLC-system (Se tabel over materialer) på en 20 cm omvendt fase opladet overflade hybrid (Csh) kolonne (Se tabel over materialer) med en indvendig diameter på 75 μm og en partikelstørrelse på 1,7 μm.
- Læg 4 μL prøve, og Kør gennem 90 min gradient ved en strømningshastighed på 300 nL/min.
- Indstil forløbet. Brug delvise loop-offline-indstillinger med isokratisk gradient indstillet til 3% af buffer B (99,9% acetonitril + 0,1% myresyre), der holdes i 14 min før løkken skiftes til online position med kolonnen, derefter øges gradienten lineært for 50 min, indtil 20% buffer B er nået.
- Inden for de næste 15 min, øge koncentrationen af buffer B til 30%. Så i de følgende 15 min, øge buffer B til 40%, før de når 90% af buffer B efter yderligere 4 min. Udfør vaske trinnet, som er nødvendig for at rengøre søjlen, på 400 nL/min og hold i yderligere 10 min (Se tabel 1 for detaljeret gradient betingelser).
- Endelig sættes systemet tilbage til en strømningshastighed på 300 nL/min og en koncentration på 3% buffer B inden for 1 min. Ækvibrere søjlen i 15 minutter, før den næste prøve injiceres.
Bemærk: en komplet liste over identificerede proteiner efter LCMS/MS analyse er præsenteret i tabel 2.
11. udvinding og bestemmelse af stivelsesindhold
Bemærk: til bestemmelse af det totale protein-og stivelsesindhold blev den faste pellet ekstraheret i en to-trins procedure som beskrevet tidligere10.
- Tilsæt 500 μL 80% (v/v) ethanol til celle pellet (trin 6,5) og Inkuber i 10 min ved 80 °C.
- Centrifugeres ved 4000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Derefter opløses pellet i 250 μL sterilt vand efterfulgt af tilsætning af 250 μL 100 mM natriumacetat.
- Hydrolyserer stivelsen ved opvarmning i 3 timer ved 99 °C. Den opløste stivelse fordøje til glukose monomerer natten over ved tilsætning af en enzym blanding af α-amylase (4,2 enheder pr. prøve) og α-amyloglucosidase (10 enheder pr. prøve). Inkubér rørene ved 37 °C natten over.
Bemærk: efter inkubation kan prøverne fryses ved-20 °C i få dage eller ved-80 °C i flere måneder forud for glucosemålinger. - Centrifugeres det Ford øjede ekstrakt ved 20000 x g i 5 minutter og opsamles supernatanten. Supernatanten (med de stivelses afledte glucomonomerer) opløses i 100 mM HEPES-buffer (pH 7), der indeholder 5 mM MgCl2, 60 mg/ml ATP, 36 mg/ml NADP og glucose-6-fosfat-dehydrogenase (1 enhed pr. prøve).
- For at analysere stivelsesindholdet skal du først måle baseline absorbans ved 340 nm. Tilsæt derefter hexokinase (1 enhed pr. prøve) for at starte reaktionen. Endelig måles stigningen af NADPH + H+ (angiver niveauet af stivelse fordøjet til glukose) ved 340 nm med en 96-brønd plade læser.
Bemærk: forskellen mellem den maksimale værdi ved 340 nm (bør ikke overskride det lineære interval på 1), og basislinjen svarer til glucosekoncentrationen af den Ford øjede stivelse. Der skal foretages en glucosekurve for at bestemme glucosekoncentrationen i nmol for glucose pr. mL.
Representative Results
Chlamydomonas Calabaria CC-1690 kultur synkronisering
For at demonstrere de repræsentative resultater for den givne protokol, præsenterer vi eksemplet multi-omics data opnået efter høst og ekstraktion af prøver fra synkroniserede chlamydomonas Calabaria kulturer10. Synkroniserede kulturer af Chlamydomonas består af celler, der tilhører en ensartet vækstfase på et bestemt tidspunkt. Chlamydomonas-kulturerne blev synkroniseret ved 12 timer/12 timer lys/mørk cyklus, 34 °C med en lysintensitet på 200 μmol · m-2· s-1 og co2 -koncentrationen of2%, v/v, beskrevet som optimal koncentration for stammen CC-1690 MT +10 . Disse betingelser var tidligere blevet optimeret og valideret ved hjælp af forskellige celle cyklusparametre10. Figur 1 viser celle størrelsesfordeling målt med Coulter Counter på forskellige tidspunkter af synkroniserede kulturer. Et skift i celle volumen kan observeres som cellerne vokser i størrelse gennem lys fase, efterfulgt af frigivelsen af datter celler startende i slutningen af lys fase fra 10 h. Når alle datter cellerne er frigivet, kan Skift i celle volumen observeres som de nyligt frigivne datter celler er afsat til at begynde den næste cyklus 10 (figur 1).
Prøveudtagning, håndtering og udvinding
Hurtig høst af prøver udføres ved hjælp af centrifugering og efter kassering af supernatanten kan pillerne opbevares ved-80 °C indtil ekstraktion. Som beskrevet ovenfor (trin 5) resulterer MTBE ekstraktion i tre særskilte faser: a) organisk fase blev anvendt til at måle lipider samt klorofyl niveauer (normaliseringsfaktor), b) Polar fase blev indsamlet for at måle metabolitter på GCMS, mens c) pellet blev brugt til måling af stivelsesindhold og proteiner. I figur 2illustreres en oversigt over fordelingen af de forskellige faser og deres beskæftigelse.
Polære og ikke-polære metabolitter
Baseret på GCMS-analysen af Polar fraktionen blev 65 metabolitter kommenteret, der dækkede aminosyrer, nukleinsyrer, mellemprodukter af glycolyse, glukoneogenese, tricarboxylsyrecyklus, pentose fosfat pathway og polyaminer (figur 3a). LCMS-analysen af neutral fase indeholdende lipider førte til identifikation af 204 forskellige lipidarter, som dækkede forskellige lipid-klasser, nemlig phosphatidylglyceroler, phosphatidylethanolamin, sulfoquinovosyl diacylglyceroler, monogalactosyldiacylglyceroler, digalactosyldiacylglyceroler, diacylglyceryltrimethylhomoserin, fedtsyrer, diacylglycerider og triacylglycerider. For at visualisere de globale forskydninger i metabolitterne og lipiderne på tværs af cellecyklussen blev der anvendt hovedkomponent analyse (PCA). Partnerskabs-og samarbejdsaftalen viser en adskillelse af lyse og mørke faser for både metabolomics og lipidomiske data. Desuden kan en semi-cyklisk (delvist åben cirkel) blive bemærket for begge data (figur 3c, D). Den delvise kløft i det cirkulære mønster tilskrives det faktum, at prøverne ved 24 h af cellecyklussen blev indsamlet under mørke i modsætning til de prøver, der blev indsamlet i begyndelsen af cellecyklussen efter 0,25 h udsættelse for lyset (figur 3c , D).
Analyse af protein og stivelse
For at undersøge kvaliteten af den protein pellet, der blev opnået som følge af MTBE-ekstraktion, blev 6 prøver anvendt til proteomisk analyse. Kvaliteten af proteomics data opnået ved at fordøje 50 μg protein/prøve, blev undersøgt ved hjælp af et beregningsmæssige kvalitetskontrol værktøj-proteomics Quality Control (PTXQC)19, der indikerer reproducerbar og høj kvalitet af proteomics data opnået fra alle replikater (supplerende figur 1). Den molekylære funktionelle dækning af proteiner blev undersøgt ved hjælp af REVIGO20. En oversigt over funktionel berigelse af de 2463 identificerede proteiner (Se tabel 2) er præsenteret i figur 4a. Den resterende pellet efter proteinekstraktion blev anvendt til reproducerbar kvantificering af stivelse som angivet ved lav standardafvigelse blandt forskellige replikater (figur 4b).
Figur 1: illustrativt eksempel på ændringer i celle volumen på tværs af forskellige faser af cellecyklussen i chlamydomonas Calabaria. Den x-akse, der repræsenterer celle lydstyrken, mens y-aksen repræsenterer celle nummeret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: illustreret workflow for ansættelse af forskellige faser under multi-omics udvinding celle pellets. Figuren er blevet genbrugt fra Juppner, J.et al. 10. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentativt eksempel på metabolitter og lipider identificeret ved hjælp af den beskrevne protokol. A) metabolit-klasser identificeret ved gcms-analyse. B) lipidarter, der tilhører forskellige klasser, som er identificeret ved LCMS-analyse. (C) princip komponent analyse af metabolitten niveauer i 24 h celle cyklus. D) princip komponent analyse af lipiderne i en 24-timers celle cyklus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentativt eksempel på data om protein og stivelse. A) Molekylær funktionel berigelse af proteinerne identificeret ved hjælp af LCMS-analyse, træstruktur trukket ved hjælp af REVIGO 20 B) repræsentative stivelses data, der viser protokollens reproducerbarhed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: tilpasset design af Fermenter system til temperatur og beluftning kontrolleret synkrone vækst af Chlamydomonas kulturer. Figuren er blevet genbrugt fra Juppner, J.et al. 10. Klik venligst her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: repræsentativt resultat for proteomics datakvalitet. Heatmap plottet ved hjælp af Computational PTXQC Tool19. Venligst klik her for at downloade denne fil.
| Tid (min.) | % Buffer B til buffer A | |
| 0 til 15 min | Lineær graduering fra 0 TM3% | Buffer A: 0,1% myresyre i UPLC-kvalitet vand |
| 15 til 75 min | Lineær gradient fra 3% til 30% | Buffer B: 0,1% myresyre i 60% UPLC-klasse acetonitril |
| 75 til 90 min | Lineær gradient fra 30% til 40% | Strømningshastighed 300 nL/min |
| 90 til 94 min | Lineær gradient fra 40% til 90% | Injektionsvolumen 4 μL |
| 94 to104 min | vask kolonnen med 90% | |
| 105 til 120 min | Ækvibrere søjlen i 15 min ved 3% |
Tabel 1: væskekromatografi af peptidprøver, gradient parametre.
Tabel 2: liste over proteiner, der er identificeret efter LCMS/MS-analyse. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Discussion
I denne artikel, vi illustrerede en robust og meget anvendelig udvinding protokol for omfattende lipidomics, metabolomics, stivelse og proteomics analyse fra en enkelt pellet af 10-15 x 106 celler. Metoden er blevet implementeret med succes i flere undersøgelser for en bred vifte af celler og væv10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. Her præsenterede vi en trinvis pipeline for multi-omics analyse af forskellige biomolekyler fra en enkelt prøve høstet fra chlamydomonas Calabaria (CC-1690 MT +) kultur.
Protokollen giver en robust og reproducerbar tilgang til behandling af flere prøver på én gang, til analyse af forskellige biomolekyler. Men, en række kritiske skridt bør tages hånd om for at minimere den tekniske variation. For det første bør høst af cellerne ske så hurtigt som muligt, samtidig med at de ensartede betingelser for alle høstede prøver bevares for at bevare cellernes biologiske tilstand. Selvom vi brugte centrifugering til at høste cellerne, kan alternative høst strategier anvendes til høst af prøverne. Men, det er vigtigt at bemærke, at forskellige høst strategier er kendt for at påvirke den metaboliske tilstand af cellerne37 derfor, konsekvent høst tilgang skal anvendes til alle eksperimentelle prøver. For det andet er det vigtigt at undgå tørring af den øvre ikke-polære fase, der indeholder klorofyl, da dette kan påvirke niveauerne af opløst klorofyl i opløsningsmidlet, som påvirker normaliserings faktoren for prøverne. Endelig bør man være forsigtig med at fjerne den resterende Polar fase for at opnå protein-og stivelses pellet for at undgå at forstyrre den pellet, der kan påvirke indholdet af stivelse og protein.
Derved præsenteret udvinding protokol tilbyder flere fordele for multiple-omics dataanalyse. Ud over at minimere antallet af påkrævede prøve-aliquoter reducerer det også variationen mellem de analytiske resultater, der er opnået for forskellige biomolekyler. Dette muliggør direkte sammenligning af resultaterne fra de primære metabolitter, lipiderne og de proteomiske data. På samme måde muliggør den samtidige ekstraktion af flere sammensatte klasser en ensartet og ensartet normaliserings strategi for de forskellige datasæt. Dette gælder især, hvis normalisering er svært at opnå ved hjælp af tør eller frisk vægt38 eller celle nummer.
Protokollen kan gennemføres med henblik på rutinemæssig screening af en kompleks biologisk prøve. Disse holistiske metabolomic, lipidomiske og proteomisk datasæt kan tilbyde omfattende information om systematiske ændringer i stofskiftet. Desuden giver de data, som er indhentet fra proteomics-analysen, indsigt i de kvantitative (overflod) og kvalitative (ændringer) ændringer i proteiner i forhold til metabolitterne. Integrationen af omik-data kunne således afsløre dybtgående oplysninger om ændringer, der skyldes genetiske eller biotiske og/eller abiotiske forstyrrelser i et biologisk system. Således, belyse molekylære ændringer af specifikke metaboliske veje eller cellulære processer. På samme måde kan disse data med høj dataoverførselshastighed gøre det muligt at identificere mål for metaboliseringsteknik og raffinere eller afprøve forudsigelser fra metaboliske modeller af genomskala37,39.
Disclosures
Forfatterne har ingen oplysninger.
Acknowledgments
Vi er meget taknemmelige for Gudrun Wolter og Änne Michaelis for fremragende teknisk assistance. Vi vil gerne takke alle medlemmerne af Giavalisco Lab for deres hjælp. Vi er taknemmelige for Max Planck Society for finansiering af forskning og FAPESP for Fællesskabet af L A Giraldi
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and standards | |||
| 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
| 13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
| Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
| Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
| Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
| Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
| Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
| Equipment | |||
| 1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
| 2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
| Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
| Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
| Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
| Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
| RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
| RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
| Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
| Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
| UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
| Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
| Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
| Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |
References
- Spolaore, P., Joannis-Cassan, C., Duran, E., Isambert, A. Commercial applications of microalgae. Journal of Bioscience and Bioengineering. 101 (2), 87-96 (2006).
- Georgianna, D. R., Mayfield, S. P. Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels. Nature. 488 (7411), 329-335 (2012).
- Pulz, O., Gross, W. Valuable products from biotechnology of microalgae. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (6), 635-648 (2004).
- Perez-Garcia, O., Escalante, F. M., de-Bashan, L. E., Bashan, Y. Heterotrophic cultures of microalgae: metabolism and potential products. Water Research. 45 (1), 11-36 (2011).
- Mukhopadhyay, A., Redding, A. M., Rutherford, B. J., Keasling, J. D. Importance of systems biology in engineering microbes for biofuel production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (3), 228-234 (2008).
- Chang, R. L., et al. Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism. Molecular Systems Biology. 7, 518 (2011).
- Dal'Molin, C. G., Quek, L. E., Palfreyman, R. W., Nielsen, L. K. AlgaGEM--a genome-scale metabolic reconstruction of algae based on the Chlamydomonas reinhardtii genome. Bmc Genomics. 12 Suppl 4, S5 (2011).
- Zones, J. M., Blaby, I. K., Merchant, S. S., Umen, J. G. High-Resolution Profiling of a Synchronized Diurnal Transcriptome from Chlamydomonas reinhardtii Reveals Continuous Cell and Metabolic Differentiation. Plant Cell. 27 (10), 2743-2769 (2015).
- Willamme, R., et al. Metabolomic analysis of the green microalga Chlamydomonas reinhardtii cultivated under day/night conditions. Journal of Biotechnology. 215, 20-26 (2015).
- Juppner, J., et al. Dynamics of lipids and metabolites during the cell cycle of Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Journal. 92 (2), 331-343 (2017).
- Salem, M. A., Juppner, J., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. Protocol: a fast, comprehensive and reproducible one-step extraction method for the rapid preparation of polar and semi-polar metabolites, lipids, proteins, starch and cell wall polymers from a single sample. Plant Methods. 12, 45 (2016).
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook. Harris, E. H. 1, Elsevier. 248-249 (2009).
- Roessner, U., Wagner, C., Kopka, J., Trethewey, R. N., Willmitzer, L. Technical advance: simultaneous analysis of metabolites in potato tuber by gas chromatography-mass spectrometry. The Plant Journal. 23 (1), 131-142 (2000).
- Salem, M., Bernach, M., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
- Bar-Nun, S., Ohad, I. [34] Chloroplast membrane polypeptides. Methods in Enzymology. 69, 363-374 (1980).
- Giavalisco, P., et al. Proteome analysis of Arabidopsis thaliana by two-dimensional gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry. Proteomics. 5 (7), 1902-1913 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Bittremieux, W., Valkenborg, D., Martens, L., Laukens, K. Computational quality control tools for mass spectrometry proteomics. Proteomics. 17 (3-4), 1600159 (2017).
- Supek, F., Bosnjak, M., Skunca, N., Smuc, T. REVIGO summarizes and visualizes long lists of gene ontology terms. PloS one. 6 (7), e21800 (2011).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73 (6), 897-909 (2013).
- Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in Arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
- Hummel, J., et al. Ultra performance liquid chromatography and high resolution mass spectrometry for the analysis of plant lipids. Frontiers in Plant Science. 2, 54 (2011).
- Giavalisco, P., et al. Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using (13) C, (15) N and (34) S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry. The Plant Journal. 68 (2), 364-376 (2011).
- Watanabe, M., et al. Comprehensive dissection of spatiotemporal metabolic shifts in primary, secondary, and lipid metabolism during developmental senescence in Arabidopsis. Plant Physiology. 162 (3), 1290-1310 (2013).
- Lambers, H., et al. Proteaceae from severely phosphorus-impoverished soils extensively replace phospholipids with galactolipids and sulfolipids during leaf development to achieve a high photosynthetic phosphorus-use-efficiency. New Phytologist. 196 (4), 1098-1108 (2012).
- Degenkolbe, T., et al. Differential remodeling of the lipidome during cold acclimation in natural accessions of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 72 (6), 972-982 (2012).
- Bromke, M. A., et al. Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry for fatty acid profiling. The Plant Journal. 81 (3), 529-536 (2015).
- Li, N., et al. FAX1, a novel membrane protein mediating plastid fatty acid export. PLOS Biology. 13 (2), e1002053 (2015).
- Hemme, D., et al. Systems-wide analysis of acclimation responses to long-term heat stress and recovery in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 26 (11), 4270-4297 (2014).
- Sharma, D. K., et al. UPLC-MS analysis of Chlamydomonas reinhardtii and Scenedesmus obliquus lipid extracts and their possible metabolic roles. Journal of Applied Phycology. 27 (3), 1149-1159 (2015).
- Delgado, R., Munoz, Y., Pena-Cortes, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6679-6686 (2014).
- Bozek, K., et al. Organization and evolution of brain lipidome revealed by large-scale analysis of human, chimpanzee, macaque, and mouse tissues. Neuron. 85 (4), 695-702 (2015).
- Khrameeva, E. E., et al. Neanderthal ancestry drives evolution of lipid catabolism in contemporary Europeans. Nature Communications. 5, 3584 (2014).
- Bozek, K., et al. Exceptional evolutionary divergence of human muscle and brain metabolomes parallels human cognitive and physical uniqueness. PLOS Biology. 12 (5), e1001871 (2014).
- Veyel, D., Erban, A., Fehrle, I., Kopka, J., Schroda, M. Rationales and approaches for studying metabolism in eukaryotic microalgae. Metabolites. 4 (2), 184-217 (2014).
- Allwood, J. W., et al. Inter-laboratory reproducibility of fast gas chromatography-electron impact-time of flight mass spectrometry (GC-EI-TOF/MS) based plant metabolomics. Metabolomics. 5 (4), 479-496 (2009).
- Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
