Summary
تحليل الجزيئات الحيوية المتعددة على نطاق المنظومة أمر بالغ الأهمية للحصول على رؤى وظيفية وميكانيكية في العمليات البيولوجية. بموجب هذا، يتم وصف بروتوكول واسع النطاق لاستخراج الإنتاجية العالية من الدهون والأيض والبروتينات والنشا من عينة واحدة تم حصادها من ثقافة الكلاميدوموناس المتزامنة.
Abstract
وكانت الطحالب الدقيقة محور البحوث لتطبيقاتها في إنتاج المركبات عالية القيمة والغذاء والوقود. وعلاوة على ذلك، فهي نماذج قيمة للتركيب الضوئي تسهل فهم العمليات الخلوية الأساسية. تتيح الدراسات على نطاق المنظومة فهمًا شاملًا ومتعمقًا للوظائف الجزيئية للكائنات الحية. ومع ذلك، هناك حاجة إلى عينات وبروتوكولات مستقلة متعددة لدراسات البروتيوميات والدهون والميتابولات التي تحدث خطأ أعلى وتباين. يتم عرض طريقة قوية عالية استخراج الإنتاجية لاستخراج الكلوروفيل في وقت واحد، والدهون، والأيض، والبروتينات والنشا من عينة واحدة من الألغا الأخضر Chlamydomonas reinhardtii هنا. الإعداد التجريبي المصور هو لثقافات Chlamydomonas متزامنة باستخدام 12 ساعة / 12 ساعة ضوء / الظروف المظلمة. تم جمع العينات على مدى دورة خلية 24 ساعة لإثبات أن الأيض والدهون وبيانات النشا التي تم الحصول عليها باستخدام منصات تحليلية مختلفة مطابقة بشكل جيد. وعلاوة على ذلك، استُخدمت عينات البروتين التي جُمعت باستخدام بروتوكول الاستخراج نفسه لإجراء تحليل مفصل للبروتيوميات لتقييم نوعيتها وقابليتها للاستنساخ. واستناداً إلى البيانات، يمكن استنتاج أن الطريقة المصورة توفر نهجاً قوياً واستنساخاً لتعزيز فهم مختلف المسارات البيوكيميائية ووظائفها بثقة أكبر في البحوث الأساسية والتطبيقية على حد سواء.
Introduction
الطحالب الدقيقة هي مصدر غني للمنتجات الطبيعية (مثل الوقود والتغذية البشرية والحيوانية ومستحضرات التجميل والمواد الدوائية). يتم تنفيذ العديد من الجهود البحثية لتعزيز كفاءة إنتاجالمنتجات ذات القيمة العالية من الطحالب الدقيقة 1،2،3،4. فهم على مستوى النظم لعملية التمثيل الغذائي هو شرط مسبق لتحسيننوعية وغلة المنتجات الطبيعية 5،6،7. مع ظهور تقنيات الجينوم الوظيفية وتحسين أساليب قياس الطيف الكتلي، يمكن رصد الآلاف من الجينات والنصوص والبروتينات والأيض في وقت واحد. ومع ذلك، هناك حاجة إلى عينات متعددة لدراسات البروتيوميات المتعمقة، والدهون والبيانات، والتي غالبا ً ما يكون من الصعب تحقيقها في الكائنات أحادية الخلية، خاصة إذا كان من المقرر إجراء دراسات دورة زمنية. وعلاوة على ذلك، فإن جمع ومعالجة أنواع مختلفة من الأليكوتات المختلفة بالاقتران مع بروتوكولات مختلفة لجمع بيانات الأوميكس المعقدة للغاية (أي البروتيوميك، والدهون، والبيانات) يدخل في تباين، مما يجعل تكامل البيانات مهمة صعبة.
الكلاميدومونات يوفر ليس فقط نظام الميكروبية ممتازة للتحقيق في العمليات الخلوية، ولكن أيضا نموذجا مناسبا لدراسة تنسيق دورة الخلية والتمثيل الغذائي. وبناء على ذلك، تم عرض تنسيق قوي للتعبير النصوص مع دورة الخلية باستخدام التنميط النسخ عالية الدقة من الثقافة المتزامنة من Chlamydomonas8. حوالي 80٪ من النصوص التي تم تحليلها أظهرت دورية قوية على مدى دورة خلية 24 ساعة8. وبالمثل ، تبين أن الوزن الجاف ، والبروتينات ، والكلوروفيل ، والأحماض الأمينية والأحماض الدهنية من سلالات مختلفة من الكلاميدوماسونا ترتبط مع انقسام الخلايا في دراسة حيث تم إجراء أخذ العينات كل 4 ح9. في الآونة الأخيرة، أفيد أن ديناميات المستقلب والدهون من تحول الخلية على أساس مراحل محددة من دورة الخلية10. كانت التغيرات الدقيقة في الجزيئات الحيوية المختلفة ممكنة للرصد باستخدام ميثيل ثالثبوتيل الأثير القوي (MTBE): الميثانول: طريقة الاستخراج القائمة على المياه، والتي توفر نقطة انطلاق مثالية لتحليل شامل متعدد الأوميكس10 , 11.
أدلة البروتوكول المقدمة من خلال استراتيجية قابلة للاستنساخ وفعالة10، لاستخراج في وقت واحد من الدهون ، والأيض ، والبروتينات والنشا من aliquot عينة واحدة ، للمرة حل دراسة الميتابوليوموميك والدهون من متزامن الثقافات الكلاميدوموناس المتنامية. بالإضافة إلى توضيح البيانات الأيضية والدهنية القوية والقابلة للاستنساخ10، هنا ، يتم أيضا ً إثبات جودة العينات البروتيومية التي تم الحصول عليها من نفس بيليه.
Protocol
1- ثقافات ما قبل الثقافات في كلاميدوموناس راينهارتي
- إعداد ما قبل الثقافات من Chlamydomonas reinhardtii (سلالة البرية نوع CC-1690 mt +) عن طريق نقل الخلايا من لوحات صلبة من TAP المتوسطة إلى القوارير Erlenmeyer مع 200 مل من HSM المتوسطة12.
- تنمو ما قبل الثقافات على شاكر الدورية في 24 درجة مئوية في 100 μmoles·m-2·s-1 ضوء مستمر حتى تصل كثافة الخلية ~ 2 × 106 خلايا / مل.
2. تزامن الثقافات السائلة Chlamydomonas في المخمرة
ملاحظة: المعلمات المعروضة في هذا البروتوكول،مثل درجة الحرارة والضوء وثاني أكسيد الكربون 2، محددة لمزامنة سلالة CC-1690 mt+. من أجل تطوير ثقافة متزامنة باستخدام سلالة أخرى، فمن الضروري لاختبار الظروف المثلى.
- نقل ما قبل الثقافة إلى نظام المخمرة (انظر الشكل التكميلي 1 لتصميم المخمرة حسب الطلب)، متصلة ببرودة إعادة تدوير للحفاظ على درجة الحرارة، مع محتدما من CO2 المصفاة (2٪، V / V) وأثارت مع شريط ضجة المغناطيسي في الجزء السفلي من المخمرة مع التحريض المستمر.
- لبدء التزامن، تعيين المخمرة في نظام الضوء الداكن من 12:12 ساعة، تحت 34 درجة مئوية و 200 μmoles·m-2·s-1 ضوء وضمان أنه يحتوي على 500 مل من الثقافة في HSM المتوسطة مع كثافة الخلية من 1 × 106 خلايا / مل.
- في نهاية دورة 24 ساعة، إعادة تخفيف الثقافة إلى 1 × 106 خلايا / مل مع وسط HSM الطازجة مع الحد الأدنى من الاضطراب باستخدام نظام أنبوب في تركيبة مع مضخات التمعجي، والذي يسمح لضخ أولا كمية متميزة من الثقافة خارج وبعد ذلك مضخة في الأوتوكلاف معقمة المتوسطة.
ملاحظة: كبديل للمضخات التمعجية، يمكن استخدام المحاقن المطعوم لسحب الثقافة، في حين يمكن إضافة الحجم المطلوب من الوسط الطازج مباشرة إلى المخمرة في ظل ظروف معقمة. - كرر الخطوة 2.3 ثلاث مرات للحصول على الثقافات المتزامنة في اليومالرابع من التلقيح.
- من أجل التحقق من صحة مزامنة الخلايا، وحصاد العينات في فاصل زمني من كل 2 ساعة وقياس كثافة الخلية وحجم الخلية باستخدام عداد الخلية ومحلل حجم (انظر جدول المواد). اعتمادا على كثافة الخلية، تمييع العينات بين 1:10 إلى 1:100 وقياس في نطاق حجم من 30 - 1900 درجة مئوية3.
3. حصاد خلايا الكلاميدوماوناس
- تسمية أنابيب الطرد المركزي مخروطي 15 مل وإعداد ديوار مليئة النيتروجين السائل.
- عينات الحصاد باستخدام حقنة(50 سم 3) من خلال أنبوب الزجاج الداخلي للتخمير. توزيع العينة في أنابيب الطرد المركزي المخروطية التي ينبغي أن تحتوي على 10-15 × 106 الخلايا. لاحظ حجم نقلها إلى كل أنبوب وقياس كثافة الخلية وحجم الخلية من كل نقطة زمنية باستخدام عداد الخلية ومحلل الحجم (انظر جدولالمواد)
- بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 4000 × ز. ثم تجاهل supernatant، وتجميد الكريات في النيتروجين السائل وتخزينها في وقت لاحق في -80 درجة مئوية.
4. إعداد مخازن الاستخراج والكلوروفيل الاستخراج والدهون والأيض
تحذير: الميثانول (MeOH) وMTBE قابلة للاشتعال ويمكن أن يسبب تهيج الجهاز التنفسي أو العين أو الجلد على التعرض لفترات طويلة و / أو الاتصال. يرجى التعامل معها بعناية فقط في غطاء محرك السيارة الدخان واستخدام إجراءات السلامة المناسبة أثناء الاستخراج (معطف المختبر، ونظارات السلامة، والقفازات، وما إلى ذلك).
-
استخراج المخزن المؤقت 1
- في قارورة حجمية 100 مل، إضافة 75 مل من MTBE، 25 مل من MeOH (UHPLC الصف) والتجانس (3:1، المجلد / المجلد).
- إضافة الحل المعايير الداخلية التالية: 50 ميكرولتر من الكورتيكوستيستيرون (1 ملغ / مل في ميوه)، 50 ميكرول 1،2-ديهيبتاكانويل-SN-غليسيرو-3-فوسكولين (17:0 PC) (1 ملغ / مل في الكلوروفورم HPLC الصف)، 25 ميكرولتر من أمسيسيلين (1 ملغ / مل في درجة UHPLC المياه) و 50 ميكرولتر من D-السوربيتول-1-13C (1 ملغ / مل في المياه UHPLC الصف).
- نقل العازلة استخراج إلى زجاجة نظيفة وقبل تبريد الحل في -20 درجة مئوية، 1 ساعة قبل الاستخدام. استخدام حل أعدت حديثا لاستخراج. يمكن تخزين هذا الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
-
استخراج المخزن المؤقت 2
- في قارورة حجمية 100 مل، إضافة 75 مل من درجة UHPLC المياه و 25 مل من درجة MeOH UHPLC والتجانس.
- نقل العازلة استخراج إلى زجاجة نظيفة. استخدام حل جديد للاستخراج. يمكن تخزين هذا الحل في درجة حرارة الغرفة لعدة أسابيع.
5- استخراج الكلوروفيل والدهون والأيض
- ترتيب الأنابيب، مع بيليه الخلية (تحتوي على 10-15 × 106 خلايا)، في النيتروجين السائل.
- إعادة تعليق بيليه الخلية في كل أنبوب مع 1 مل من المبردة مسبقا (-20 درجة مئوية) استخراج العازلة 1.
ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة بسرعة لتجنب تبخر المخزن المؤقت استخراج اللزوجة منخفضة. بعد إضافة المخزن المؤقت للاستخراج 1، حافظ على الأنابيب في درجة حرارة الغرفة. - دوامة حتى يتم تجانس الخلايا بشكل جيد داخل خليط استخراج وعليكوت الخليط في أنبوب 2 مل microcentrifuge.
- Sonicate الثقافات باستخدام حمام sonication (انظر جدولالمواد) في الماء المبرد الجليد لمدة 10 دقيقة.
- احتضان جميع العينات على شاكر المداري في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة في 4 درجة مئوية.
- للحث على فصل المرحلة، أضف 650 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاستخراج 2.
- دوامة قصيرة تليها الطرد المركزي في 20000 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: بعد هذه الخطوة، هناك فصل المراحل السائلة وبيليه الصلبة في الجزء السفلي من الأنبوب. التعامل مع الأنابيب مع الحرص على تجنب خلط المرحلتين السائلة. تحتوي المرحلة المتوسطة MTBE على الدهون والكلوروفيل، في حين تحتوي المرحلة السفلى على الأيض القطبي وشبه القطبي. بيليه عجلت في الجزء السفلي يحتوي على البروتينات والنشا وغيرها من الجزيئات غير القابلة للذوبان.
6. علياقتباس الكسور
- نقل 500 ميكرولتر من المرحلة العليا MTBE (الدهون) في أنبوب وصفت 1.5 مل. تجفيف العينات باستخدام مركز فراغ (انظر جدولالمواد) وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى القياس.
- قم بإزالة المرحلة المتبقية من MTBE باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
- نقل 650 ميكرولتر من المرحلة السفلى (الأيض القطبي وشبه القطبي) إلى أنبوب جديد المسمى. تجفيف العينات باستخدام مركز فراغ (انظر جدولالمواد) وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى القياس.
- إزالة المرحلة السفلى المتبقية عن طريق الأنابيب قبالة حجم الزائدة.
- تجميد بيليه الصلبة في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخراج.
7. تحديد الأيض القطبي (الأيض الأولي)
- إعادة تعليق بيليه المجففة من المرحلة القطبية (الخطوة 6.3) في ميثوكسيامين هيدروكلوريد / بيريدين الحل لميثوكسيم من مجموعات الكربونيل.
- سخني العينات عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
- اشتق العينات مع N-ميثيل-N-ثلاثي ميثيل سيلتيريلتريافلوراسيتياميد (MSTFA) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية كما هو موضح سابقا13.
- استخدم الكروماتوغرافيا الغازية المقترنة بالقياس الطيفي الكتلي في وقت الطيران (GC-TOF-MS) لتحليل الأيض الأولي. وكانت معلمات التدرج المستخدمة وفقا للبروتوكول14الذي سبق وصفه .
8. تحديد الأيض غير القطبية (الدهون)
- إعادة تعليق بيليه المجففة من المرحلة غير القطبية (الخطوة 6.1) في خليط من acetonitrile: isopropanol (7:3، v:v).
- الطرد المركزي في 20000 × ز ومنفصلة على المرحلة العكسية C8 العمود (100 مم × 2.1 مم × 1.7 ميكرومتر الجسيمات)، وذلك باستخدام نظام UPLC (انظر جدولالمواد). وكانت المرحلتان المتنقلتان المياه مع 1٪ 1 M خلات الأمونيوم، 0.1٪ حمض الخليك (العازلة A)، وأسيتونيتريل: إيزوبروبانول (7:3) التي تحتوي على 1٪ 1 M خلات الأمونيوم، 0.1٪ حمض الخليك (العازلة B).
- استخدم معلمات التدرج وفقًا للبروتوكول14الموضح مسبقًا .
9 - تحديد محتوى الكلوروفيل
- مزيج 100 ميكرولتر من المرحلة MTBE (الخطوة 6.1) مع 900 ميكرولتر من الميثانول 90٪ لطريقة فارغة وكذلك العينات التجريبية.
- قياس الامتصاص باستخدام مقياس الطيف الضوئي على طول موجة من 665 نانومتر و 652 نانومتر للتمييز بين الكلوروفيل أ والكلوروفيل ب.
ملاحظة: ينبغي أن يتراوح الامتصاص بين 0.1 و1 لحساب تركيز صحيح. تخفيف العينات، إذا لزم الأمر. - حساب محتوى الكلوروفيل أ وب، وكذلك المحتوى الكلي للكلوروفيل وفقاً للصيغ التالية.
Chla = 16.82A665 – 9.28A652
Chlb = 36.92A652 – 16.54A665
Chla=b = 0.28A665 + 27.64A652
ملاحظة: تم وصف الصيغ من قبل بار نون وأوهاد15.
10. استخراج وتحديد محتوى البروتين والهضم والتحليل
ملاحظة: لإعادة تعليق البروتين، تم استخدام بيليه اليوريا / ثيويوريا العازلة (6 M اليوريا، 2 M البروتياز ثيويورياد ومثبطات الفوسفاتيز) مع التعديلات في البروتوكول الموصوف سابقا16. ومع ذلك، يمكن استخدام أي عازل من الاختيار لإعادة تعليق البروتينات.
- إعداد العازلة البروتين باستخدام التركيزات التالية: 6 M من اليوريا و 2 M من الثيويوريا.
- حل بيليه (الخطوة 6.5) في 200 درجة مئوية من البروتين العازلة (10.1).
- حضانة العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، تليها الطرد المركزي في 20000 × ز لمدة 5 دقائق.
- نقل supernatant، الذي يحتوي على البروتينات، إلى أنبوب جديد.
- تحديد تركيز البروتين منقبل برادفورد دراسة 17 .
- هضم 50 ميكروغرام من البروتين في الحل مع بروتوكول الاختيار. هنا، استخدم البروتوكول التالي.
- تقليل 50 ميكروغرام من عينات البروتين باستخدام 5 mM DTT لمدة 30 دقيقة تليها الألكيلية باستخدام iodoacetamide 10 mM لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- أضف التربسين/Lys-C Mix بسعر 25:1 بروتين: نسبة بروتياز (ث/ث)، واخلط واحتضنلمدة 3 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- تخفيف العينات ستة أضعاف باستخدام 50 mM TrisHCl (درجة الحموضة 8) وحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- إنهاء الهضم عن طريق إضافة حمض ثلاثي فلورو سيتيك (TFA) إلى تركيز نهائي من 0.5-1٪.
- بعد الهضم، إجراء إزالة الأملاح من الببتيدات قبل قياس الطيف الكتلي باستخدام نصائح المرحلة C18 وelute الببتيدات المهضومة18.
- ركّز العينات إلى جفاف قريبة, يترك 2-5 [فل] من حل في فراغ مركّزة (رأيت جدول ال [متريلس])دون تدفئة.
- إعادة تعليق العينات في المخزن المؤقت التحميل (5٪ acetonitrile، 0.5٪ حمض الفورميك) وتحليل خليط الببتيد من قبل LC-MS / MS باستخدام مطياف كتلة عالية الدقة (انظر جدولالمواد) متصلة بنظام نانو UPLC.
- فصل الببتيدات باستخدام نظام UPLC (انظر جدولالمواد) على 20 سم عكس المرحلة المشحونة سطح الهجين (CSH) العمود (انظر جدولالمواد) مع قطر داخلي من 75 درجة مئوية وحجم الجسيمات من 1.7 ميكرومتر.
- تحميل 4 ميكرولتر من العينة وتشغيل من خلال التدرج 90 دقيقة بمعدل تدفق 300 nL/min.
- تعيين التدرج. استخدام إعدادات جزئية دون اتصال بالحلقة مع تعيين التدرج isocratic في 3٪ من العازلة B (99.9٪ acetonitrile + 0.1٪ حمض الفورميك) التي عقدت لمدة 14 دقيقة قبل أن يتم تحويل الحلقة إلى موقف على الانترنت مع العمود، وبعد ذلك يتم زيادة التدرج خطيا لمدة 50 دقيقة، حتى 20٪ تم الوصول إلى المخزن المؤقت B.
- في غضون 15 دقيقة القادمة، وزيادة تركيز المخزن المؤقت B إلى 30٪. ثم في 15 دقيقة التالية، قم بزيادة المخزن المؤقت B إلى 40٪، قبل الوصول إلى 90٪ من المخزن المؤقت B بعد 4 دقائق أخرى. الظروف).
- وأخيراً، قم بضبط النظام إلى معدل تدفق قدره 300 مل/دقيقة وتركيز 3% المخزن المؤقت B في غضون دقيقة واحدة.
ملاحظة: ترد في الجدول 2قائمة كاملة بالبروتينات المحددة بعد تحليل نظام إدارة النُكِس/التصلب المتعدد.2.
11. استخراج وتحديد محتوى النشا
ملاحظة: لتحديد محتوى البروتين الكلي والنشا، تم استخراج بيليه الصلبة في إجراء من خطوتين كما هو موضح سابقا10.
- إضافة 500 درجة مئوية من 80٪ (V / v) الإيثانول إلى بيليه الخلية (الخطوة 6.5) وحضانة لمدة 10 دقيقة عند 80 درجة مئوية.
- الطرد المركزي في 4000 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم حل بيليه في 250 درجة مئوية من المياه المعقمة تليها إضافة 250 درجة مئوية من خلات الصوديوم 100 مل.
- تحلل النشا عن طريق التدفئة لمدة 3 ح في 99 درجة مئوية. هضم النشا المذاب إلى مونومرات الجلوكوز بين عشية وضحاها عن طريق إضافة مزيج إنزيم من α-amylase (4.2 وحدة لكل عينة) وα-amyloglucosidase (10 وحدات لكل عينة). حضانة الأنابيب في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: بعد الحضانة، يمكن تجميد العينات عند -20 درجة مئوية لبضعة أيام، أو عند -80 درجة مئوية لعدة أشهر، قبل قياسات الجلوكوز. - الطرد المركزي استخراج هضمها في 20000 × ز لمدة 5 دقائق وجمع supernatant. حل supernatant (مع مونومرات الجلوكوز المستمدة من النشا) في 100 م من HEPES-العازلة(درجة الحموضة 7) الذي يحتوي على 5 مل ملغ كل 2، 60 ملغ / مل ATP، 36 ملغ / مل NADP والجلوكوز-6-الفوسفات-dehydrogenase (1 وحدة لكل عينة).
- من أجل تحليل محتوى النشا، أولا قياس امتصاص خط الأساس في 340 نانومتر. ثم يضاف hexokinase (1 وحدة لكل عينة) لبدء رد الفعل. أخيرا قياس زيادة NADPH + H+ (تشير إلى مستوى النشا هضمها إلى الجلوكوز) في 340 نانومتر مع قارئ لوحة 96 جيدا.
ملاحظة: الفرق في القيمة القصوى في 340 نانومتر (يجب أن لا تتجاوز النطاق الخطي من 1) وخط الأساس يعادل تركيز الجلوكوز من النشا المهضوم. وينبغي إجراء منحنى الجلوكوز لتحديد تركيز الجلوكوز في نمول الجلوكوز لكل مل.
Representative Results
Chlamydomonas reinhardtii CC-1690 مزامنة الثقافة
ولتوضيح النتائج التمثيلية للبروتوكول المعطى، نقدم نموذج البيانات المتعددة الأوميس التي تم الحصول عليها بعد حصاد واستخراج عينات من ثقافات الكلاميدودوماس رينهارتي المتزامنة10. الثقافات المتزامنة من Chlamydomonas تتألف من الخلايا التي تنتمي إلى مرحلة النمو موحدة في نقطة زمنية محددة. تمت مزامنة ثقافات الكلاميدومونات عند 12 ساعة/12 ساعة ضوء/دورة مظلمة، 34 درجة مئوية مع شدة الضوء من 200 μmol·m-2·s-1 وتركيز ثاني أكسيد الكربون من2٪، v/v، الموصوفة على أنها تركيز أمثل للإجهاد CC-1690 mt+10 . وقد تم تحسين هذه الشروط سابقا والتحقق من صحتها باستخدام مختلف المعلمات دورة الخلية10. يعرض الشكل 1 توزيع حجم الخلية المقاس مع عداد Coulter في نقاط زمنية متميزة للثقافات المتزامنة. ويمكن ملاحظة تحول في حجم الخلية كما تنمو الخلايا في الحجم طوال مرحلة الضوء، تليها الإفراج عن خلايا ابنة بدءا من نهاية مرحلة الضوء من 10 ح. مرة واحدة يتم تحرير جميع الخلايا ابنة، يمكن ملاحظة التحول في حجم الخلية كما يتم التخلص من خلايا ابنة صدر حديثا لبدء الدورة التالية 10 (الشكل 1).
جمع العينات، والمناولة واستخراج
ويتم الحصاد السريع للعينات باستخدام الطرد المركزي وبعد التخلص من supernatant، يمكن تخزين الكريات في -80 درجة مئوية حتى استخراج. وكما هو موضح أعلاه (الخطوة 5)، فإن استخراج MTBE يؤدي إلى ثلاث مراحل متميزة: (أ) استخدمت المرحلة العضوية لقياس الدهون وكذلك مستويات الكلوروفيل (عامل التطبيع)، ب) تم جمع المرحلة القطبية لقياس الأيض على نظام إدارة النُسَّم العالمي في حين أن ج) تم استخدام الكريات لقياس محتوى النشا والبروتينات. ويبين الشكل 2لمحة عامة عن توزيع مختلف المراحل وتوظيفهم.
الأيض القطبي وغير القطبي
استناداً إلى تحليل GCMS للكسر القطبي، تم شرح 65 أيضًا، تغطي الأحماض الأمينية، والأحماض النووية، ووسيطات تحلل الجلوكوز، وتكوين الجلوكوز، ودورة حمض تريكاربوكسيليك، ومسار فوسفات البنتوز، والبوليامين (الشكل3A). أدى تحليل LCMS للمرحلة المحايدة التي تحتوي على الدهون إلى تحديد 204 أنواع الدهون المتميزة التي تغطي مختلف فئات الدهون وهي فوسفاتيديلغليسيرول، فوسفاتيديلإيثانولامين، سولفوكينوسيل دياسيلكلينرول، مونوغالاكتوسيلدياسيلغليسيكلوريس، ديغالكتوسيلدياسيلغليسيكلين، دياسيلغليسيريلتريلميثيلهوموسيرين، الأحماض الدهنية، دياسيلغليسيريدس وترياسيلغليسيريدس. لتصور التحولات العالمية في الأيض والدهون عبر دورة الخلية، تم استخدام تحليل المكون الرئيسي (PCA). يعرض PCA فصل المراحل الخفيفة والظلام لكل من البيانات الميتابولوميك والدهون. وعلاوة على ذلك، يمكن ملاحظة شبه دوري (دائرة مفتوحة جزئيا) لكلا البيانات (الشكل3C،D). وتعزى الفجوة الجزئية في النمط الدائري إلى حقيقة أن العينات في 24 ساعة من دورة الخلية تم جمعها تحت الظلام على النقيض من العينات التي تم جمعها في بداية دورة الخلية بعد 0.25 ساعة من التعرض للضوء (الشكل3C ،D).
تحليل البروتين والنشا
لدراسة نوعية بيليه البروتين التي تم الحصول عليها نتيجة لاستخراج MTBE، تم استخدام 6 عينات لتحليل البروتيومية. تم فحص جودة البيانات البروتيوميات التي تم الحصول عليها عن طريق هضم 50 ميكروغرام بروتين / عينة، باستخدام أداة مراقبة الجودة الحسابية -البروتيوميات مراقبة الجودة (PTXQC)19،مما يشير إلى استنساخ عالية وجودة البيانات البروتيوميات التي تم الحصول عليها من جميع النسخ المتماثلة (الشكلالتكميلي1). تم فحص التغطية الوظيفية الجزيئية للبروتينات باستخدام REVIGO20. ويرد في الشكل 4 ألفعرض عام للإثراء الوظيفي للبروتينات المحددة لعام 2463 (انظر الجدول 2). تم استخدام بيليه المتبقية بعد استخراج البروتين لاستنساخ كمية النشا كما هو مبين من خلال انخفاض الانحراف المعياري بين مختلف تكرار (الشكل4B).
الشكل 1: مثال توضيحي للتغيرات في حجم الخلية عبر مراحل مختلفة من دورة الخلية في Chlamydomonas reinhardtii. المحور س الذي يمثل وحدة تخزين الخلية بينما يمثل المحور ص رقم الخلية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: سير العمل المصور لتوظيف مراحل مختلفة أثناء الكريات خلية استخراج متعددة omics. وقد أعيد استخدام هذا الرقم من جوبنر، ج.وآخرون. 10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مثال تمثيلي للأيض والدهون المحددة باستخدام البروتوكول الموصوف. (أ) فئات المستقلب التي حددها تحليل GCMS. (ب) أنواع الدهون التي تنتمي إلى فئات مختلفة محددة من قبل تحليل LCMS. (C) تحليل مكون المبدأ من مستويات المستقلب عبر دورة الخلية 24 ح. (D) تحليل مكون المبدأ من الدهون عبر دورة الخلية 24 ساعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مثال تمثيلي لبيانات البروتين والنشا. أ) الإثراء الوظيفي الجزيئي للبروتينات المحددة باستخدام تحليل LCMS، خريطة الشجرة المرسومة باستخدام REVIGO 20 B) بيانات النشا التمثيلية التي تعرض إمكانية استنساخ البروتوكول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: تصميم مخصص لنظام المخمرة لدرجة الحرارة والطباعة التي تسيطر عليها النمو المتزامن للثقافات Chlamydomonas. وقد أعيد استخدام هذا الرقم من جوبنر، ج.وآخرون. 10. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: النتيجة التمثيلية لنوعية بيانات البروتيوميات. خريطة الحرارة المرسومة باستخدام أداة حسابية PTXQC19. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
| الوقت (دقيقة) | النسبة المئوية للمخزن المؤقت B إلى المخزن المؤقت A | |
| من 0 إلى 15 دقيقة | تدرج خطي من 0 إلى 3% | العازلة A: 0.1٪ حمض الفورميك في المياه الصف UPLC |
| 15 إلى 75 دقيقة | تدرج خطي من 3% إلى 30% | العازلة B: 0.1٪ حمض الفورميك في 60٪ UPLC الصف acetonitrile |
| 75 إلى 90 دقيقة | تدرج خطي من 30% إلى 40% | معدل التدفق 300 nL / دقيقة |
| 90 إلى 94 دقيقة | تدرج خطي من 40% إلى 90% | حقن حجم 4 ميكرولتر |
| 94 إلى 104 دقيقة | غسل العمود مع 90٪ | |
| 105 إلى 120 دقيقة | معادلة العمود لمدة 15 دقيقة في 3٪ |
الجدول 1: الكروماتوغرافيا السائلة لعينات الببتيد، بارامترات التدرج.
الجدول 2: قائمة بالبروتينات التي تم تحديدها بعد تحليل نظام إدارة النُمس/نظام إدارة النُسْمع. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
في هذه المقالة، قمنا بتوضيح بروتوكول استخراج قوي وقابل للتطبيق للغاية للدهون الشاملة، والبيانات ية، وتحليل النشا والبروتيوميات من بيليه واحد من 10-15 × 106 خلايا. وقد تم تنفيذ هذه الطريقة بنجاح في العديد من الدراسات لمجموعة واسعة من الخلايا والأنسجة10،14،21،22،23،24،25 ،26،27،28،29،30،31،32،33،34 ،35،36. هنا، قدمنا خط أنابيب خطوة لتحليل متعددة omics من الجزيئات الحيوية المختلفة من عينة واحدة تم حصادها من Chlamydomonas reinhardtii (CC-1690 mt+) الثقافة.
ويوفر البروتوكول نهجا قويا واستنساخا لمعالجة عينات متعددة في آن واحد، لتحليل مختلف الجزيئات الحيوية. ومع ذلك، ينبغي اتخاذ عدد من الخطوات الحاسمة من أجل التقليل إلى أدنى حد من التباين التقني. أولا، ينبغي أن يتم حصاد الخلايا في أسرع وقت ممكن مع الحفاظ على الظروف الموحدة لجميع العينات التي تم حصادها للحفاظ على الحالة البيولوجية للخلايا. على الرغم من أننا استخدمنا الطرد المركزي لحصاد الخلايا، يمكن استخدام استراتيجيات الحصاد البديلة لحصاد العينات. ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ أن استراتيجيات الحصاد المختلفة من المعروف أن تؤثر على الحالة الأيضية للخلايا37 وبالتالي، يجب استخدام نهج الحصاد متسقة لجميع العينات التجريبية. ثانيا، من المهم تجنب تجفيف المرحلة العليا غير القطبية التي تحتوي على الكلوروفيل، لأن هذا يمكن أن يؤثر على مستويات الكلوروفيل المذاب في المذيب الذي يؤثر على عامل التطبيع للعينات. وأخيرا، ينبغي توخي الحذر أثناء إزالة المرحلة القطبية المتبقية للحصول على البروتين والنشا بيليه، لتجنب إزعاج بيليه التي يمكن أن تؤثر على محتوى النشا والبروتين.
وبالتالي يقدم بروتوكول الاستخراج المقدم عدة فوائد لتحليل البيانات متعددة omics. وإلى جانب تقليل عدد العوامل العلية المطلوبة، فإنه يقلل أيضا من التباين بين النتائج التحليلية التي تم الحصول عليها لمختلف الجزيئات الحيوية. وهذا يسمح بإجراء مقارنة مباشرة للنتائج التي تم الحصول عليها من الأيض الأولي والدهون والبيانات البروتيومية. وبالمثل، فإن الاستخراج المتزامن لفئات مركبة متعددة يسمح باستراتيجية تطبيع متسقة وموحدة لمجموعات البيانات المختلفة. وهذا ينطبق بشكل خاص إذا كان من الصعب تحقيق التطبيع باستخدام الوزن الجاف أو الطازج38 أو رقم الخلية.
ويمكن تنفيذ البروتوكول من أجل الفحص الروتيني لعينة بيولوجية معقدة. هذه المجموعات البيانات الميتابولوميك الكلي, الدهون وبروتيومميك يمكن أن توفر معلومات شاملة حول التغيرات المنهجية في عملية التمثيل الغذائي. بالإضافة إلى ذلك، فإن البيانات التي تم الحصول عليها من تحليل البروتيوميات، توفر رؤى في التغيرات الكمية (الوفرة) والنوعية (التعديلات) في البروتينات فيما يتعلق بالأيض. ومن ثم، فإن دمج البيانات الأوميسية يمكن أن يكشف عن معلومات متعمقة عن التغيرات الناجمة عن الاضطرابات الوراثية أو الأحيائية و/أو اللاأحيائية للنظام البيولوجي. وهكذا، توضيح التغيرات الجزيئية لمسارات التمثيل الغذائي محددة أو العمليات الخلوية. وبالمثل، فإن هذه البيانات عالية الإنتاجية يمكن أن تسمح بتحديد الأهداف للهندسة الأيضية وصقل أو اختبار التنبؤات من نماذج التمثيل الغذائي على نطاق الجينوم37،39.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ أي كشف.
Acknowledgments
ونحن ممتنون جدا لغودرون ولتر ورين مايكليس على المساعدة التقنية الممتازة. ونود أن نشكر جميع أعضاء مختبر جيافاليسكو على مساعدتهم. نحن ممتنون لجمعية ماكس بلانك لتمويل البحوث وFAPESP لزمالة L A Giraldi
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and standards | |||
| 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
| 13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
| Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
| Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
| Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
| Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
| Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
| Equipment | |||
| 1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
| 2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
| Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
| Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
| Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
| Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
| RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
| RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
| Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
| Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
| UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
| Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
| Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
| Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |
References
- Spolaore, P., Joannis-Cassan, C., Duran, E., Isambert, A. Commercial applications of microalgae. Journal of Bioscience and Bioengineering. 101 (2), 87-96 (2006).
- Georgianna, D. R., Mayfield, S. P. Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels. Nature. 488 (7411), 329-335 (2012).
- Pulz, O., Gross, W. Valuable products from biotechnology of microalgae. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (6), 635-648 (2004).
- Perez-Garcia, O., Escalante, F. M., de-Bashan, L. E., Bashan, Y. Heterotrophic cultures of microalgae: metabolism and potential products. Water Research. 45 (1), 11-36 (2011).
- Mukhopadhyay, A., Redding, A. M., Rutherford, B. J., Keasling, J. D. Importance of systems biology in engineering microbes for biofuel production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (3), 228-234 (2008).
- Chang, R. L., et al. Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism. Molecular Systems Biology. 7, 518 (2011).
- Dal'Molin, C. G., Quek, L. E., Palfreyman, R. W., Nielsen, L. K. AlgaGEM--a genome-scale metabolic reconstruction of algae based on the Chlamydomonas reinhardtii genome. Bmc Genomics. 12 Suppl 4, S5 (2011).
- Zones, J. M., Blaby, I. K., Merchant, S. S., Umen, J. G. High-Resolution Profiling of a Synchronized Diurnal Transcriptome from Chlamydomonas reinhardtii Reveals Continuous Cell and Metabolic Differentiation. Plant Cell. 27 (10), 2743-2769 (2015).
- Willamme, R., et al. Metabolomic analysis of the green microalga Chlamydomonas reinhardtii cultivated under day/night conditions. Journal of Biotechnology. 215, 20-26 (2015).
- Juppner, J., et al. Dynamics of lipids and metabolites during the cell cycle of Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Journal. 92 (2), 331-343 (2017).
- Salem, M. A., Juppner, J., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. Protocol: a fast, comprehensive and reproducible one-step extraction method for the rapid preparation of polar and semi-polar metabolites, lipids, proteins, starch and cell wall polymers from a single sample. Plant Methods. 12, 45 (2016).
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook. Harris, E. H. 1, Elsevier. 248-249 (2009).
- Roessner, U., Wagner, C., Kopka, J., Trethewey, R. N., Willmitzer, L. Technical advance: simultaneous analysis of metabolites in potato tuber by gas chromatography-mass spectrometry. The Plant Journal. 23 (1), 131-142 (2000).
- Salem, M., Bernach, M., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
- Bar-Nun, S., Ohad, I. [34] Chloroplast membrane polypeptides. Methods in Enzymology. 69, 363-374 (1980).
- Giavalisco, P., et al. Proteome analysis of Arabidopsis thaliana by two-dimensional gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry. Proteomics. 5 (7), 1902-1913 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Bittremieux, W., Valkenborg, D., Martens, L., Laukens, K. Computational quality control tools for mass spectrometry proteomics. Proteomics. 17 (3-4), 1600159 (2017).
- Supek, F., Bosnjak, M., Skunca, N., Smuc, T. REVIGO summarizes and visualizes long lists of gene ontology terms. PloS one. 6 (7), e21800 (2011).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73 (6), 897-909 (2013).
- Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in Arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
- Hummel, J., et al. Ultra performance liquid chromatography and high resolution mass spectrometry for the analysis of plant lipids. Frontiers in Plant Science. 2, 54 (2011).
- Giavalisco, P., et al. Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using (13) C, (15) N and (34) S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry. The Plant Journal. 68 (2), 364-376 (2011).
- Watanabe, M., et al. Comprehensive dissection of spatiotemporal metabolic shifts in primary, secondary, and lipid metabolism during developmental senescence in Arabidopsis. Plant Physiology. 162 (3), 1290-1310 (2013).
- Lambers, H., et al. Proteaceae from severely phosphorus-impoverished soils extensively replace phospholipids with galactolipids and sulfolipids during leaf development to achieve a high photosynthetic phosphorus-use-efficiency. New Phytologist. 196 (4), 1098-1108 (2012).
- Degenkolbe, T., et al. Differential remodeling of the lipidome during cold acclimation in natural accessions of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 72 (6), 972-982 (2012).
- Bromke, M. A., et al. Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry for fatty acid profiling. The Plant Journal. 81 (3), 529-536 (2015).
- Li, N., et al. FAX1, a novel membrane protein mediating plastid fatty acid export. PLOS Biology. 13 (2), e1002053 (2015).
- Hemme, D., et al. Systems-wide analysis of acclimation responses to long-term heat stress and recovery in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 26 (11), 4270-4297 (2014).
- Sharma, D. K., et al. UPLC-MS analysis of Chlamydomonas reinhardtii and Scenedesmus obliquus lipid extracts and their possible metabolic roles. Journal of Applied Phycology. 27 (3), 1149-1159 (2015).
- Delgado, R., Munoz, Y., Pena-Cortes, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6679-6686 (2014).
- Bozek, K., et al. Organization and evolution of brain lipidome revealed by large-scale analysis of human, chimpanzee, macaque, and mouse tissues. Neuron. 85 (4), 695-702 (2015).
- Khrameeva, E. E., et al. Neanderthal ancestry drives evolution of lipid catabolism in contemporary Europeans. Nature Communications. 5, 3584 (2014).
- Bozek, K., et al. Exceptional evolutionary divergence of human muscle and brain metabolomes parallels human cognitive and physical uniqueness. PLOS Biology. 12 (5), e1001871 (2014).
- Veyel, D., Erban, A., Fehrle, I., Kopka, J., Schroda, M. Rationales and approaches for studying metabolism in eukaryotic microalgae. Metabolites. 4 (2), 184-217 (2014).
- Allwood, J. W., et al. Inter-laboratory reproducibility of fast gas chromatography-electron impact-time of flight mass spectrometry (GC-EI-TOF/MS) based plant metabolomics. Metabolomics. 5 (4), 479-496 (2009).
- Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
